CN104741086A

CN104741086A - 丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法

Info

Publication number: CN104741086A
Application number: CN201510140673.1A
Authority: CN
Inventors: 王业富; 韩振伟; 李卫
Original assignee: Wuhan Rui Fa Medical Devices Co Ltd
Current assignee: Wuhan Rui Fa Medical Devices Co Ltd
Priority date: 2015-03-29
Filing date: 2015-03-29
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-03-29
Also published as: CN104741086B

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，该方法利用氨基酸处理连接了配基的吸附微球，使其上的配基结合更牢固，降低了丙型肝炎病毒吸附剂脱落的几率和速率，提高了丙型肝炎病毒吸附剂在应用时的安全性。

Description

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体指一种丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法。

背景技术

丙型肝炎由丙肝病毒(HCV)引起，分布极广，容易演变为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。

现有技术中公开了一种丙型肝炎病毒吸附剂及其制备方法与应用，该方法采用丙型肝炎病毒亲和的DNA单链配基与微球相连，通过DNA单链配基特异性结合丙型肝炎病毒包膜蛋白，从而达到清除血液中丙型肝炎病毒的目的。

目前制备该类型吸附剂所常用的微球是琼脂糖微球、聚乙烯醇微球、壳聚糖微球等，与微球相连的配基有DNA单链，蛋白等。在制作微球时，有的微球会需要先用酸、碱预处理，然后采用试剂活化微球表面，有的直接则是直接活化；然后再加入交联剂或者偶联剂连接微球和配基，交联剂(偶联剂)上的功能基团如羟基和配基上的氨基发生反应，使配基结合在微球上。但是这些吸附剂在使用中，随着时间推移，会有不同程度的配基脱落发生，而且容易受到温度、水流等环境影响，可能是由于配基与交联剂之间的结合发生了逆向反应而脱落，当配基脱落后血液中，可能引起免疫反应，具有一定的安全风险。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中制备的丙型肝炎病毒吸附剂上配基容易脱落的缺陷，提供一种操作简单、能大幅度提高配基结合牢固度的丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明所设计的丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

1)准备与丙型肝炎病毒亲和的配基，及作为载体的微球；

2)活化微球表面基团；

3)利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到病毒吸附微球；

4)在溶液环境下，向病毒吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重量与配基的重量比大于2.5：1000，待氨基酸结合到病毒吸附微球上后，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂。

优选地，所述氨基酸选自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或几种的混合。小分子性质稳定的氨基酸均可以采用，实验结果显示混合的氨基酸效果优于单一的氨基酸，特别是大小不均等的氨基酸组合对配基的固定效果较好。

优选地，所述配基为单链脱氧核糖核酸配基，所述微球为玻璃微球，所述氨基酸为组氨酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:0.7:3.5的混合物。

优选地，所述步骤4)中，向病毒吸附微球中添加氨基酸后，使氨基酸结合到病毒吸附微球上的条件为，于25～40℃的环境中，静置含有病毒吸附微球与氨基酸的溶液30分钟以上。适宜的温度可以促进氨基酸结合到微球上去。

优选地，所述步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的洗涤液为PBS。

本发明原理：微球经过处理活化后其上基团暴露通过交联剂与配基相连，但是该连接受多种因素影响，加入的氨基酸起到了封闭裸露基团的作用，对未参加反应的微球及交联剂上裸露的基团进行共价结合的过程，可能也影响了配基上的功能基团与交联剂的结合部位，加固了配基与交联剂之间的结合，使配基不容易从微球上脱落。理论上，氨基酸封闭对多种配基都有效，而在实验中发现，对单链DNA分子的固定效果比体积较大的抗体蛋白效果好。

本发明的有益效果：通过采用氨基酸处理已连接了配基的病毒吸附微球，使其上的配基结合更牢固，降低了丙型肝炎病毒吸附剂脱落的几率和速率，提高了丙型肝炎病毒吸附剂在应用时的安全性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备与丙型肝炎亲和的单链脱氧核糖核酸配基及作为载体的玻璃微球；

①配基的序列为：

5’-gggatccccgCGCCCTAGGATACTGCGTAACTGGGAGTCGCTTCCTCGATCTAATAAGGAGTAAGCCGAGCCTGACAAGGGATATCACTCAGCATAATCTTAAGGCGaacgcgtctg-3’

上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。

②玻璃微球表面预处理：用65％浓硝酸煮洗平均直径85μm玻璃微球10分钟，再用蒸馏水洗(去离子水洗3次，蒸馏水洗2次，每次2分钟)，放入37℃烘箱烘干。

2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮(分析纯)、硅烷化偶联剂(γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)按体积比15:280:6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球浸入其中2小时；用丙酮洗涤玻片5次(5min/次)，再将微球表面烘干。

3)将单链脱氧核糖核酸配基纯化后通过化学交联的方法连接到上玻璃微球上：

①把活化的微球放入0.2wt％PDC(重铬酸吡啶)溶液，置于烘箱中2小时(维持温度37℃)；从PDC中取出微球，先用甲醇洗涤5次(5min/次)，再用丙酮洗涤2次，最后用双蒸水洗涤一次，晾干；

②将单链脱氧核糖核酸配基于100℃加热5min，迅速冰浴90秒，随后与微球混合以微球体积(mL)：单链DNA重量比(mg)为1：20的比例混合，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。

4)向病毒吸附微球溶液中添加甘氨酸，甘氨酸添加重量与配基的重量比为1：100，于恒温37℃水浴箱上静置30分钟，再于恒温37℃水浴箱上微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂1，然后室温晾干、备用。

实施例2

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

①配基的序列为：

4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为组氨酸:赖氨酸＝1:1，氨基酸与配基的重量比为＝1:200，于恒温30℃水浴箱上静置1小时，再用PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂2，然后室温晾干、备用。

实施例3

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

①配基的序列为：

4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为组氨酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:0.7:3.5，氨基酸添加重量与配基的重量比为1：100，于恒温37℃水浴箱上静置30分钟，再于恒温37℃水浴箱上微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂3，然后室温晾干、备用。

实施例4

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

1)准备丙型肝炎病毒免疫球蛋白G(HCV-IgG)及作为载体的壳聚糖微球；HCV-IgG由市售购得，壳聚糖微球的制备方法为现有技术，本申请中不做赘述。

2)活化壳聚糖微球表面基团：称取10g壳聚糖交联微球于灭菌的烧杯中，加入20mL一定浓度的环氧氯丙烷，用1M NaOH溶液调节溶剂pH 8～9，然后在一定的温度、转速80rpm下、反应相应的时间进行活化，活化结束后，除去未反应完的环氧氯丙烷，然后用丙酮、乙醇、洗去残存的环氧氯丙烷，再用大量蒸馏水淋洗微球，抽干，得到壳聚糖活化微球。

3)将HCV-IgG通过化学交联的方法连接到上壳聚糖微球上：

将市售的HCV-IgG用蒸馏水稀释，滴加到环氧活化后的壳聚糖微球中，于37℃低速振荡反应4h。反应结束后，用0.01M pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液洗去未反应完的HCV-IgG，吸干水分，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。

4)向病毒吸附微球溶液中添加缬氨酸，缬氨酸添加重量与配基的重量比为1：100，于恒温37℃水浴箱上静置30分钟，再于恒温37℃水浴箱上微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂4，然后室温晾干、备用。

实施例5

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

1)准备丙型肝炎病毒免疫球蛋白G(HCV-IgG)及作为载体的琼脂糖微球；HCV-IgG由市售购得，琼脂糖微球的制备方法为现有技术，本申请中不做赘述。

2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微球溶液600ml，2mol/L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7，将活化好的凝胶状琼脂糖微球储存在4℃备用。

3)将HCV-IgG通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：

将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0.3mol/L的硼酸缓冲液600ml中，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g HCV-IgG，在37℃反应12小时，停止，回收未反应的HCV-IgG蛋白，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。

4)向病毒吸附微球溶液中添加苏氨酸和异亮氨酸的混合物，混合物为苏氨酸:异亮氨酸＝1:10，氨基酸添加重量与配基的重量比为3：1000，静置2h，再用蒸馏水冲洗，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂5，保存在0.2mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲液中。

实施例6

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备与丙型肝炎亲和的单链脱氧核糖核酸配基及作为载体的壳聚糖微球；

配基的序列为：

上述配基及壳聚糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。

2)活化壳聚糖微球表面基团：称取10g壳聚糖交联微球于灭菌的烧杯中，加入20mL一定浓度的环氧氯丙烷，用1M NaOH溶液调节溶剂pH 8～9，然后在40℃、转速80rpm下、反应2h进行活化，活化结束后，然后用丙酮、乙醇、洗去残存的环氧氯丙烷，再用大量蒸馏水淋洗微球，抽干，得到壳聚糖活化微球。

3)将单链脱氧核糖核酸配基纯化后通过化学交联的方法连接到上壳聚糖微球上：

将含有单链脱氧核糖核酸配基的溶液滴加到环氧活化后的壳聚糖微球中，于37℃低速振荡反应3h。反应结束后，用蒸馏水洗去多余的单链脱氧核糖核酸配基，吸干水分，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。

4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为组氨酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:0.7:3.5，氨基酸添加重量与配基的重量比为1：100，于恒温37℃水浴箱上静置30分钟，再于恒温37℃水浴箱上微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂6，然后室温晾干、备用。

对照例(未用氨基酸封闭)

丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

①配基的序列为：

2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮(分析纯)、硅烷化偶联剂(γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)按体积比15:280:6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球浸入其中2小时；用丙酮洗涤玻片5次(5min/次)，再将微球表面烘干；

②将单链脱氧核糖核酸配基于100℃加热5min，迅速冰浴90秒，随后与微球混合以微球体积(mL)：单链DNA重量比(mg)为1：20的比例混合，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液，于恒温37℃水浴箱上微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余单链，得到丙型肝炎病毒吸附剂DNA(对照)，然后室温晾干、备用。

试验例

取上述实施例中得到的丙型肝炎病毒吸附剂1～6以及对照例，添加至生理盐水中，然后置于恒温37℃水浴箱上，轻微震荡，分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，检测其上抗体蛋白或单链DNA分子的脱落情况，脱落的抗体蛋白和DNA均采用紫外法检测，然后将未脱落的抗体蛋白或单链DNA分子重量和吸附剂上的原有结合的量进行对比，结果如下：

编号

对照

吸附剂1

吸附剂2

吸附剂3

吸附剂4

吸附剂5

吸附剂6

0.5h

99％

1h

96％

96.5％

95％

96％

2h

89％

94％

95％

92％

90％

93％

4h

76％

86％

88％

90％

81％

87％

88％

8h

60％

79％

80％

84％

73％

72％

82％

12h

58％

75％

78％

68％

69％

76％

24h

55％

65％

63％

66％

61％

60％

63％

结果显示，利用氨基酸处理后的丙型肝炎病毒吸附剂其结合的牢固度有所上升，特别是没有氨基酸处理的对照在0.5小时至4小时这个时间段有23％的配基脱落，而处理后的吸附剂上配基脱落几率降低至10％左右，这对于丙型肝炎病毒吸附剂的安全性有所提升。

Claims

1.一种丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

1)准备与丙型肝炎病毒亲和的配基，及作为载体的微球；

2)活化微球表面基团；

2.根据权利要求1所述丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，其特征在于：所述氨基酸选自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或几种的混合。

3.根据权利要求1所述丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，其特征在于：所述配基为单链脱氧核糖核酸配基，所述微球为玻璃微球，所述氨基酸为组氨酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:0.7:3.5的混合物。

4.根据权利要求1或2或3所述丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，向病毒吸附微球中添加氨基酸后，使氨基酸结合到病毒吸附微球上的条件为，于25～40℃的环境中，静置含有病毒吸附微球与氨基酸的溶液30分钟以上。

5.根据权利要求1或2或3所述丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的洗涤液为PBS。