CN104740649A - Plekha5在制备肿瘤诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PLEKHA5在制备肿瘤诊断试剂中的应用，具体的本发明涉及PLEKHA5在制备骨肉瘤诊断试剂中的新用途。发明人基于高通量测序结果采用生物信息学方法分析进行基因筛选，挑选出候选基因PLEKHA5，进一步，通过分子细胞生物学实验证实了PLEKHA5与骨肉瘤具有很好的相关性，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

Description

PLEKHA5在制备肿瘤诊断试剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，PLEKHA5在制备肿瘤诊断试剂中的应用，具体的本发明涉及PLEKHA5在制备骨肉瘤诊断试剂中的新用途。

背景技术

PLEKHA5是PLEKHA((pleckstrin homology domain-containing protein familyA)家族的一员，目前关于该基因的研究非常少。Kenichiro等(Identification andcharacterization of splicing variants of PLEKHA5(Plekha5)during braindevelopment，Gene，Volume 492，Issue 1，15January 2012，270-275)对该基因进行研究后发现，其mRNA有两种表达形式，较长的mRNA链(L-PLEKHA5)有32个外显子，编码1282个氨基酸，在脑组织中表达较高，而较短的(S-PLEKHA5)有26个外显子，编码1116个氨基酸，在机体的各个部位都有表达。这两种形式的mRNA编码的蛋白质均具有WW及PH结构域，主要位于细胞质中。在小鼠E13.5时PLEKHA5表达量最多，其中S-PLEKHA5占主要部分，随后开始出现PLEKHA5总量下降，但是L-PLEKHA5的表达量却逐渐增加，直到E17.5时，L-PLEKHA5的表达量达到最大，并一直维持在小鼠的整个成年期，提示PLEKHA5的表达量可能与小鼠的年龄呈依赖性关系。实验还发现在这个转变过程中PLEKHA5的PH结构域可以特异性的与PI3P，PI4P，PISP及PI(3，5)P2结合。这些均提示PLEKHA5可能通过与特异的磷酸肌醇连接完成从短链到长链转变，这在大脑发育的过程中起着重要的作用。

骨肉瘤(Oseteosarcoma)是除浆细胞瘤外最常见的恶性骨原发性肿瘤，其组织学特点是在多数情况下肿瘤细胞产生骨样或不成熟骨。骨肉瘤易于侵及生长迅速的干髓端，其典型的位置是在长管状骨，股骨远端及胫骨、胧骨的近端是最常见的发病部位，全部病人的50％-70％病变发生在膝关节周围。骨肉瘤起病时无明显的临床症状，极易与外伤混淆，且恶性程度高早期即可能发生肺转移，故其危害性大死亡率很高。临床骨科工作者一直致力于对其防治的研究，希望寻找到骨肉瘤精确有效治疗的靶点。

发明人对5例骨肉瘤病例样本及3例正常对照进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因PLEKHA5。近来还有研究发现，在先天性挛缩综合症及神经肌肉疾病中，磷酸肌醇与PI(3、5)P2代谢异常被认为是导致该疾病的可能原因。PLEKHA5蛋白可能通过内吞作用与细胞膜上的PI(3，5)P2连接，从而激活细胞膜上的信号通路导致代谢异常。但是并没有研究表明PLEKHA5与骨肉瘤之间的关系，进一步，本发明进行了分子细胞生物学方法证实了PLEKHA5与骨肉瘤的关系：PLEKHA5与骨肉瘤具有很好的相关性，骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供PLEKHA5基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因PLEKHA5，今儿通过分子细胞生物学方法验证了PLEKHA5与骨肉瘤的关系：PLEKHA5与骨肉瘤具有很好的相关性，PLEKHA5在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

进一步，所述抗骨肉瘤制剂是指可以抑制骨肉瘤细胞中PLEKHA5基因的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活PLEKHA5基因的抑制基因、激活抑制PLEKHA5基因表达的蛋白、导入抑制PLEKHA5基因表达的siRNA、激活促进PLEKHA5mRNA降解的microRNA、导入促进PLEKHA5蛋白降解的分子、抑制促进PLEKHA5基因表达的因子及蛋白的表达。

RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

进一步，所述抑制PLEKHA5基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6。优选siRNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本发明的目的在于提供一种抗骨肉瘤制剂，所述抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞中PLEKHA5基因的表达。进一步，所述的抗骨肉瘤制剂中含有抑制PLEKHA5基因表达的siRNA。

本发明的目的在于提供PLEKHA5基因在制备骨肉瘤诊疗制剂中的应用。

进一步，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测骨肉瘤组织中PLEKHA5基因的表达。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

所述的用于荧光定量PCR方法检测骨肉瘤中PLEKHA5基因的产品含有一对特异性扩增PLEKHA5基因的引物；所述的基因芯片包括与PLEKHA5基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用免疫方法检测肺腺癌中PLEKHA5蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测骨肉瘤中PLEKHA5蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

进一步，所述检测PLEKHA5蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的PLEKHA5单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被PLEKHA5单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

进一步，所述检测PLEKHA5蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的PLEKHA5单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗PLEKHA5单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

本发明的目的在于提供一种检测骨肉瘤的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因PLEKHA5，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取。

本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为10⁶-10²copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。

本发明目的是提供了一种骨肉瘤检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测PLEKHA5蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测骨肉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与PLEKHA5基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

图1 PLEKHA5基因在癌组织及正常组织中相对表达量图

图2 RNA干扰后各组PLEKHA5 mRNA表达水平

图3 RNA干扰前后MG-63细胞增殖变化

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 高通量测序及分析

分别收集5例骨肉瘤病例样本及3例正常对照组织，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC＞1或＜-1，FDR＜0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因PLEKHA5。

实施例2 骨肉瘤组织及正常组织PLEKHA5基因表达情况

一材料和方法

1、材料

收集65例骨肉瘤组织及25例正常组织，对其进行分组及编号。

2、方法

2.1 骨肉瘤组织及正常组织总RNA的提取

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5分钟；

②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；

③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按I ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

2.2 逆转录合成cDNA

采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：

5×逆转录缓冲液5μl，10mmol/l dNTP 1.25μl，0.1mmol/l DTT 2.5μl，30μmmol/lOligodT 2μl，200U/μl MMLV 1.25μl，模板RNA 1μg，加入灭菌水至总体系25μl。42℃孵育1小时，72℃10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3 Real-Time PCR

2.3.1 仪器及分析方法

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。

2.3.2 引物设计

采用在线引物设计软件，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

表1 引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°10min，(95℃15sec，60℃60sec)×45个循环。

表2 RealTime反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μl
上游引物(10uM)	0.5μl
		下游引物(10uM)	0.5μl
模板	2μl
		加入灭菌蒸馏水	至25μl

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTimePCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

二实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较PLEKHA5基因在骨肉瘤组织和正常组织中的表达水平。结果显示(具体见图1)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中PLEKHA5在癌组织中的表达水平高于正常组织，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析PLEKHA5在骨肉瘤组织中高表达的结果。

实施例3 骨肉瘤细胞系MG-63的培养

一、材料

(一)标本来源

人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。

(二)主要试剂

DMEM/HIGH Glucose(1×)(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)

(三)主要溶液

1、细胞培养液

DMEM培养基+10％标准胎牛血清。

2、PBS(平衡盐溶液)

在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。

3、0.25％胰蛋白酶消化液

0.25g胰蛋白酶加入100ml去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。

二、实验方法

(一)细胞培养

1、细胞传代

(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25％胰蛋白酶液1ml，覆盖细胞层，瓶口消毒，加盖；

(2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10％胎牛血清的培养液终止消化；

(3)细胞计数：取上述细胞悬液0.5mI，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数：细胞总数/ml＝4大格细胞总数/4×10⁴×稀释倍数；

(4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×10⁵个细胞浓度，分装于培养瓶中(8ml/每瓶)，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2、细胞冻存

(1)消化细胞(方法同上)，将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液；

(2)沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5×10⁶/ml左右，将悬液分至冻存管中，每管1ml；

(3)将冻存管口封严，否则复苏时易出现爆裂，贴上标签，写明细胞种类，冻存日期；

(4)按下列顺序降温：室温4℃(20分钟)，冰箱冷冻室(30分钟)、低温冰箱(-30℃，1小时)，低温冰箱(-70℃，过夜)、液氮。

3、细胞复苏

(1)从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化，管消毒，入台；

(2)打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm离心10分钟，弃去上清液；

(3)沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液；

(4)加入新培养液适当稀释，轻轻混匀，接种于培养瓶中培养。

实施例4 RNAi抑制PLEKHA5基因表达及其对人骨肉瘤MG-63细胞的影响

一、材料

(一)标本来源

人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。

(二)主要试剂

Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent(Invitrogen)，MTT(Solarbio)，Transwell小室(Corning)，Matrigel胶(BD)。

(三)siRNA构建与合成

依据在线设计软件siDirect version 2.0(http：//design.rnai.jp/)，根据PLEKHA5基因在GenBank(NCBI Reference Sequence：NM_144920.3)中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成。

二、实验方法

(一)RNA干扰技术特异性抑制人骨肉瘤细胞PLEKHA5基因的表达

1、人骨肉瘤细胞MG-63的培养

方法步骤同实施例3。

2、siRNA的设计与合成

siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记，可以实时监测载体在细胞中的转染效率。根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列及阴性对照(表3)。对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA(shorthairpin RNA)。合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNA PoIyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点，可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间。siRNA空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3∶1。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37℃培养过夜。PCR鉴定；测序鉴定。柱抽提阳性克隆载体并定量。

表3 siRNA转录模板序列

3、细胞分组及转染

(1)细胞分组

C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。

(2)转染

按照Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent提供的步骤进行。

①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×10⁵/ml，取2ml接种于六孔板，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。

②配制转染液体：

A液：250ul无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；

B液：250ul无血清培养基稀释10ul Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min;

③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO₂培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。

4、转染效率的验证

(1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况

转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧光下观察转染情况。

(2)应用Real-time PCR方法检测转染前后PLEKHA5基因表达的变化

①标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的骨肉瘤MG-63细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于10⁴-10⁰copies/ul的DNA模板，分别加入PLEKHA5引物和内参照actin引物，配制25ul反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到PLEKHA5和actin的标准曲线。

②Real-time PCR方法检测转染前后PLEKHA5基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行PLEKHA5和actin的Real-time PCR反应，实验重复三次。

③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

(二)RNAi抑制人骨肉瘤MG-63细胞PLEKHA5基因表达对其相关生物学行为的影响

1、MTT法测细胞增殖

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用紫外分光光度计在490nm处测定其吸光度，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

实验步骤：

(1)MTT溶液：称取250mg MTT，放入小烧杯中，加入50mI PBS(0.01mol/L，pH7.4)，在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤膜除菌，分装，4℃保存，两周内有效。

(2)细胞分组：实验分为正常细胞组，阴性对照组和实验组。正常细胞组为常规培养的MG-63；阴性对照组为非特异性siRNA转染后48h；实验组为特异性siRNA转染后48h；每组设3个重复。

(3)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔1了个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100ul。

(4)培养细胞：将培养板放入CO₂孵箱，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养。

(5)呈色：培养后第0h、24h、48h、72h、96h，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37℃继续孵育4h，终止培养，小心弃去孔内培养上清夜。吸去上清液，加入二甲基亚砜150ul，振荡10min使结晶完全溶解。

(6)比色：选择490nm波长，在紫外分光光度计上测定各孔吸光度。设与试验孔平行不加细胞只加培养液的空白对照孔。重复3次，记录结果，以时间为横轴，吸光度(A₄₉₀)为纵轴绘制细胞生长曲线。

2、体外侵袭实验

(1)细胞准备

本实验设置空白对照组，阴性对照组和实验组。空白对照组为常规培养的MG-63；阴性对照组为非特异性siRNA转染后48h；实验组为特异性siRNA转染后48h。将各组细胞用0.25％胰蛋白酶消化，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗3遍，重悬于含0.1％BSA的无血清培养基中。

(2)体外侵袭模型的构建与实验步骤

Transwell小室是常用的Matrigel胶重建基底膜系统，是体外研究肿瘤细胞侵袭和转移行为的有效方法。Matrigel是人工重构基底膜材料，主要成分为层黏连蛋白和W型胶原，是一种细胞外基质，4℃时是液体，在37℃会逐渐凝固成胶状，不可逆。将Transwell小室放入24孔培养板中，小室内称上室，培养板内称下室。

①包被基底膜：将Transwell小室放入培养板中，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜(8um孔径)相隔。Matrigel 4℃过夜成液态，用50mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，每个小室使用100ul，分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上，第一次用50ul，第二、三次各加25ul，每次的间隔时间为10min，使膜上所有的微孔被人工基底胶覆盖并在37℃孵育2h使其成凝胶状，吸取胶层表面析出的水相，形成人工重组基底膜。取10ul纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)稀释液涂于小室的下表面，4℃风干。

②接种细胞：将各组细胞调整密度，取2×10⁵/ml细胞200ul加入上室，下室加入作为化学趋化物的含10％FBS的DMEM培养基500ul。

③培养细胞：37℃，5％CO2条件下孵育20h。

④固定与染色：取出小室，弃去上室内培养基，用棉签仔细擦净膜上室面未

侵袭的细胞，下室面用甲醇固定10min后，0.1％结晶紫染色。用小刀沿边缘切下，置于载玻片上，中性树胶封片。

⑤观察与计数：在倒置显微镜下随机选取6个200×视野，计数穿膜细胞数目，取均值。实验重复3次。

三、实验结果

Real-time PCR检测转染效率。应用Real-time PCR方法构建PLEKHA5和actin的标准曲线，相关系数分别为0.9987，0.9979，线性关系良好，符合要求。用双标准曲线的方法比较各组PLEKHA5基因的表达。空白对照组、脂质体转染组、非特异性转染组基因的表达基本相似，差异无统计学意义。SiRNA1，SiRNA2，SiRNA3均有抑制PLEKHA5基因表达的作用，PLEKHA5-siRNA2的作用更明显，抑制效率达87％，而PLEKHA5-siRNA1和PLEKHA5-siRNA3的抑制作用分别为50％和28％，与空白对照组、脂质体转染组、非特异性转染组相比，差异有统计学意义，P＜0.05(表4，图2)。

表4 各组PLEKHA5 mRNA表达水平

组别	PLEKHA5/actin相对浓度比值(均数±标准差)

空白对照组	1.0
		脂质体转染组	1.0458±0.0772
非特异性转染组	0.9952±0.0821
		PLEKHA5-siRNA1组	0.5049±0.0158
PLEKHA5-siRNA2组	0.1295±0.0316
		PLEKHA5-siRNA3组	0.7184±0.0225

细胞增殖抑制实验(MTT)。阴性对照组为转染非特异性siRNA，特异性siRNA转染组转染PLEKHA5-siRNA2。四甲基偶氮哇蓝比色法(MTT)实验显示，在相同的初始条件下，各组细胞增殖速度相近，无统计学差异(P＜0.05)。24h后，特异性siRNA转染组(0.1599±0.0193)细胞增殖速度减慢，正常细胞组(0.2056±0.0208)、阴性对照组细胞(0.2013±0.0251)增殖速度相近，特异性siRNA转染组细胞增殖速度减慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。随着观察时间延长，前两组组间比较，增殖速度相似，差异无统计学意义(P＞0.05)；特异性siRNA转染组与前两组相比，增殖速度明显减慢，有显著性差异(P＜0.05)。MTT实验结果表明，特异性siRNA转染组的细胞生长明显受到抑制(表5、图3)。

表5 RNA干扰前后MG-63细胞增殖变化

时间	正常细胞组	阴性对照组	实验组
				0h	0.1255±0.0223	0.1204±0.0320	0.1237±0.0154
24h	0.2056±0.0208	0.2013±0.0251	0.1680±0.0219
				48h	0.3596±0.0311	0.3527±0.0198	0.2699±0.0138
72h	0.4482±0.0308	0.4451±0.0241	0.3425±0.0224
				96h	0.5580±0.0402	0.5397±0.0336	0.4217±0.0173

体外侵袭实验。细胞穿过Matrigel重建基底膜数目的多少反映了细胞侵袭能力的变化。通过计数实验组与对照组细胞穿过人工基底膜的细胞数量并进行比较，可以发现RNA干扰PLEKHA5基因表达后肿瘤细胞的运动侵袭能力明显下降，穿过人工基底膜的细胞数量明显减少，空白对照组(33.54±1.85)、阴性对照组(33.18±2.74)及实验组(20.77±1.83)侵袭细胞的相对数目差异有统计学意义(P＜0.05)(表6)。

表6 RNA干扰PLEKHA5基因后Transwell值

组别	Transwell值
		空白对照组	33.54±1.85
阴性对照组	33.18±2.74
		实验组	20.77±1.83

本发明采用高通量测序筛选出骨肉瘤致病相关基因PLEKHA5，结合分子细胞生物学实验验证，证实了PLEKHA5在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，抑制PLEKHA5基因的表达能够降低骨肉瘤细胞的侵袭和增殖。本发明为骨肉瘤临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

Claims (11)

1.PLEKHA5基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗骨肉瘤制剂可以采用下述方法中的一种和/或几种抑制骨肉瘤细胞中PLEKHA5基因的表达：通过激活PLEKHA5基因的抑制基因、激活抑制PLEKHA5基因表达的蛋白、导入抑制PLEKHA5基因表达的siRNA、激活促进PLEKHA5mRNA降解的microRNA、导入促进PLEKHA5蛋白降解的分子、抑制促进PLEKHA5基因表达的因子及蛋白的表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制PLEKHA5基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

4.一种抗骨肉瘤制剂，其特征在于，所述抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞中PLEKHA5基因的表达。

5.根据权利要求4所述的抗骨肉瘤制剂，其特征在于，所述的抗骨肉瘤制剂中含有抑制PLEKHA5基因表达的siRNA。

6.PLEKHA5基因在制备骨肉瘤诊疗制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测骨肉瘤组织中PLEKHA5基因的表达。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的用于荧光定量PCR方法检测骨肉瘤中PLEKHA5基因的产品含有一对特异性扩增PLEKHA5基因的引物；所述的基因芯片包括与PLEKHA5基因的核酸序列杂交的探针。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用免疫方法检测肺腺癌中PLEKHA5蛋白的表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测骨肉瘤中PLEKHA5蛋白表达的为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。

11.一种检测骨肉瘤的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因PLEKHA5，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。