CN104721221B - 琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其涉及琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途。本发明的琼枝麒麟菜多糖的平均分子质量范围为1000‑100000，经药效实验证实，该琼枝麒麟菜多糖具有单独抗呼吸道病毒的作用，呼吸道病毒主要包括呼吸道合胞病毒、科萨奇病毒及流感病毒。本发明人还将利巴韦林与琼枝麒麟菜多糖联合使用、肝素与琼枝麒麟菜多糖联合使用用于抗呼吸道病毒，取得了预料不到的协同的治疗效果。本发明的琼枝麒麟菜多糖制成抗病毒药物，如制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、缓释片或喷雾剂。本发明的琼枝麒麟菜多糖具有很强的抗呼吸道病毒活性，且对宿主细胞的毒性小，是抗病毒活性高效、低毒的药物，具有广阔的应用前景。

Description

琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途。

背景技术

呼吸道病毒是一类能侵犯呼吸道或以呼吸道为侵入门户而引起呼吸道及呼吸道外组织器官病变的病毒。呼吸道病毒包括正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的流感病毒；副粘病毒科(Paramyxoviridae)中的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒以及其它病毒科中的一些病毒，如腺病毒、风疹病毒、鼻病毒、冠状病毒和呼肠病毒等。据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起。其中常见的呼吸道病毒是H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、H5N3流感病毒，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，简称RSV）和科萨奇病毒CVB3（Coxsachievirus）等。

流感病毒传染性极强且极易变异，危害性大，难以控制，目前广泛使用的抗流感病毒的西药具有一定的毒副作用，并可引起流感病毒变异，或产生不同程度的耐药性。柯萨奇病毒(Coxsachievirus)是一种肠病毒(enteroviruses)分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。其中柯萨奇病毒B3属小核糖核酸病毒科，肠道病毒属，可经呼吸道和消化道传染，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状，是非常严重的人类疾病致病病原。目前尚无有效治疗柯萨奇病毒感染的药物。呼吸道合胞病毒（RSV）可引起婴幼儿严重呼吸道感染，目前只有病毒唑和RSV免疫球蛋白2种药物。但病毒挫不良反应较严重，RSV免疫球蛋白治疗费用很高。

麒麟菜( Eucheuma st ri at um) 属于红藻门( Rhodop hyta ) , 麒麟菜属(Eucheuma) 。其中琼枝麒麟菜和异枝麒麟菜在我国海南岛有大规模的人工养殖，资源十分丰富。麒麟菜中含有丰富的多糖，约占藻体干重的60%。

琼枝麒麟菜多糖主要是由半乳糖和3，6-内醚半乳糖组成，此外还含有少量的葡萄糖、木糖、塔罗糖和艾杜糖等，多糖硫酸酯是指糖羟基上带有硫酸基团的多糖，也称硫酸多糖，可经天然提取或硫酸化的结构修饰得到。近年的研究证明：多糖硫酸酯无论在体内还是体外，都显示了不同程度的抗病毒活性，尤其与目前抗病毒药物相比，其细胞毒作用小，因而，多糖硫酸酯的抗病毒活性得到了广泛的关注，尤其是多糖硫酸酯的抗病毒活性的药用前景。迄今为止，发现硫酸酯多糖有抗单纯疱疹病毒和细胞具病毒等，但是未见硫酸酯多糖对呼吸道相关病毒抗性的报道。

利巴韦林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等，是广谱强效的抗病毒药物，目前广泛应用于病毒性疾病的防治。常用剂型有注射剂、片剂、口服液、气雾剂等。

肝素类药物属粘多糖类药物，由己糖醛酸、氨基己糖及它们的硫酸化、乙酰化等衍生物为结构单位构成的一类物质，包括肝素、低分子肝素和超低分子肝素。肝素是体内外均能延长凝血时间的抗凝血药。其抗凝血作用极为复杂，对凝血过程的许多环节都有影响。低分子量肝素的活性/抗凝血活性的比值为1.5～4.0，而普通的肝素为1，保持了肝素的抗血栓作用而降低了出血的危险。具有半衰期长，生物利用度高等优点，正广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗，其有效性和安全性均优于普通肝素，量效关系明确。

发明内容

为了解决现有技术呼吸道病毒尚无有效药物治疗的现状，本发明目的在于提供琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途。

本发明提供的琼枝麒麟菜多糖是平均分子质量范围为1000-100000的琼枝麒麟菜多糖，琼枝麒麟菜多糖优选为α -D-（1-6）-葡萄糖硫酸酯琼枝麒麟菜多糖，所述的α -D-（1-6）-葡萄糖硫酸酯琼枝麒麟菜多糖的平均分子质量是45000，单糖硫酸基取代度为 2.13。

本发明人还将利巴韦林与琼 枝麒麟菜多糖联合使用、肝素与琼 枝麒麟菜多糖联合使用用于抗呼吸道病毒，取得了预料不到的协同的治疗效果。

本发明的琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒的病毒中，所述的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒、科萨奇病毒和流感病毒，其中所述的呼吸道合胞病毒为RSV long株，所述的科萨奇病毒为柯萨奇病毒B3，所述的流感病毒为H1N1流感病毒、H3N2流感病毒和H5N3流感病毒。

本发明的琼枝麒麟菜多糖的制备方法包括以下步骤:

称取一定量的琼枝麒麟菜，将洗净的琼枝麒麟菜,使琼枝麒麟菜的含水量不超过8％时，用粉粹机粉碎，再将粉粹过后的琼枝麒麟菜浸泡 0.5h，然后用加热回流装置进行热水提取多糖 3h，冷却至 40-45℃后收集滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至原滤液体积的2/3 ，然后直接加入3 倍体积的95％的乙醇，并不断搅拌，置4℃冰箱醇沉 12 h，四层纱布过滤，收集过滤物，待残余酒精部分挥发后进行冷冻干燥，最终得到的白色纤维状物质即为琼枝麒麟菜多糖。

本发明提取得到的琼枝麒麟菜多糖可以单独制成药剂，可以制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或缓释片。

将提取的琼枝麒麟菜多糖进行单独的细胞实验，分别选用MDCK（狗肾细胞），Hep-2（人喉癌上皮细胞）和Hela（宫颈癌细胞）。结果显示，琼枝麒麟菜多糖具有良好的抗流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒的效果。将提取的琼枝麒麟菜多糖进行体外抗呼吸道相关病毒机制研究，实验结果显示，琼枝麒麟菜多糖主要作用于病毒感染早期阶段。

本发明公开的琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途，与现有技术相比，具有以下突出的优势：本发明的琼枝麒麟菜多糖具有很强的抗呼吸道病毒的活性，且对宿主细胞的毒性小，而且琼枝麒麟菜多糖制备方法简单，资源丰富，是很高的推广价值。

说明书附图：

图1是不同给药途径下琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道合胞病毒的活性；

图2是不同给药途径下琼枝麒麟菜多糖抗柯萨奇病毒B₃的活性。

具体实施案例

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本领域技术人员应当知晓本发明的具体实施例并不以任何方式限制本发明，且在本发明基础上所作出的任何等同替换均落入本发明的保护范围。

第一部分本发明琼枝麒麟菜多糖的分子质量测定

实施例1、麒麟菜多糖分子量范围测定

a.精密称取麒麟菜多糖1mg，用0.2M pH值4.0的醋酸钠缓冲溶液溶解至终浓度为1mg/ml，经0.45um的微孔滤膜过滤后备用。

b.右旋糖酐Dextran Mw800T、505T、170T、60T。精确称取不同分子量的右旋糖苷标准品0.100g,用流动相溶解并定容至10mL,最终浓度为10mg/mL。

c.分别将标准品和麒麟菜多糖样品用高效液相进行检测，流动相为0.2M pH值4.0的醋酸钠缓冲溶液，色谱条件为流速1.0mL/min,进样量10μl，进样时间15min。以不同分子量标准右旋糖酐的分离保留时间(RT)与相应的分子量对数值(LogMw)绘制坐标曲线并计算出麒麟菜多糖的分子量范围。

第二部分本发明琼枝麒麟菜多糖的药效学研究

实施例2、琼枝麒麟菜多糖的细胞毒性研究试验

1、试验材料

将提取的琼枝麒麟菜多糖用纯水配置为10 mg/mL的水溶液，保存于-20℃备用。

2、试验方法

将琼枝麒麟菜多糖倍比稀释成不同浓度（起始浓度为500µg/mL），其间置倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度TC₀，测定麒麟菜多糖的细胞毒性。

3、试验结果

以正常细胞无死亡、不引起细胞病变的最高药物稀释浓度作为对各株细胞的最大无毒浓度TC0，CPE观察结果如表1，可加麒麟菜粗多糖（CEGP）和大于500KDa麒麟菜多糖（LEGP）组分在实验所用浓度中对MDCK，hela，hep-2细胞无毒。

表1 CEGP和LEGP的细胞毒性

实施例3、琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道相关病毒药效研究试验

a.从琼枝麒麟菜提取琼枝麒麟菜多糖，平均分子量为45000，单糖硫酸基取代度为2.13。

b.参照实施例2细胞毒性实验的结果，将步骤a提取的琼枝麒麟菜多糖制备成起始浓度为62.5 µ g/mL的稀释液，采用MTT法测定抗呼吸道相关病毒活性。

c.步骤：在96孔培养板中接种细胞，细胞密度为1.5*10⁵个/ml，每孔100μl，37℃，5%CO₂培养箱中培养16 ~ 20 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液，用PBS洗三次，将不同稀释度的药物（在无毒浓度范围内）和病毒稀释液（100TCID₅₀）各50μl直接加到单层细胞上，先加样品液，再加病毒液。每个浓度设3个复孔，100μl/孔，同时设病毒对照组、正常细胞对照组，置于37℃、5% CO₂培养箱培养24 ~72 h，其间置倒置显微镜下观察细胞病变（CPE）的情况。待病毒对照组的细胞病变达到75%以上，而对照组细胞正常时，观察并记录各孔的CPE，并做MTT定量活细胞数并按照以下公式计算病毒抑制率。病毒抑制率 =（药物组吸光度 -病毒组吸光度）/（对照组吸光度 - 病毒组吸光度）*100%。以药物浓度的对数值为横坐标，以病毒抑制率为纵坐标作图，根据病毒抑制率结果做出病毒对药物的敏感性曲线，计算药物的半数抑制浓度（IC₅₀）。

d.c中所使用的细胞为MDCK，所用病毒株为H1N1、H3N2和H5N3。

c中所使用的细胞为Hep-2，所用病毒为RSV。

c中所使用的细胞为Hela，所用病毒为CVB₃。

实验结果表明，在实验所用浓度（≤ 500μg/ml），琼枝麒麟菜多糖均能不同程度地抑制各株病毒感染所致的细胞病变（如表2所示），

表2 CEGP和LEGP的抗病毒活性及治疗指数

实施例4、琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道相关病毒作用方式

a.通过水提醇沉法从琼枝麒麟菜提取琼枝麒麟菜多糖，平均分子量为45000，单糖硫酸基取代度为2.13。

b.将步骤a.制备的麒麟菜多糖，参照实施例2 细胞毒性实验的结果，制备成起始浓度为500 µg/mL的稀释液，采用MTT法测定麒麟菜多糖抗呼吸道相关病毒作用方式：直接灭活作用、预防作用。

c.步骤：按不同的给药途径实验设 4 组①预防法: 以含有倍比稀释浓度样品的维持液加入单层细胞孔中, 每孔50μl, 置37℃吸附 2h后, 加入 50μl病毒悬液; ②治疗法:接种 50μl病毒悬液于单层细胞中，置 37℃吸附 1h 后, 加入含有不同浓度样品的维持液; ③直接灭活法: 含对倍稀释浓度样品的维持液与等体积的病毒悬液混合后, 置冰上孵育 2 h 后, 将孵育液加入单层细胞中。所有 96 孔培养板均置于 37℃、5% CO ₂培养箱中培养。

d.c中所使用的细胞为Hep-2，所用病毒为RSV。

c中所使用的细胞为Hela，所用病毒为CVB₃。

e.结果显示琼枝麒麟菜多糖对实验所用各株呼吸道相关病毒均具有很好的直接灭活作用及预防作用，结果如图1和图2所示。

第三部分本发明琼枝麒麟菜多糖制剂及其制备方法

实施例5-10琼枝麒麟菜多糖片剂制备

表3 片剂处方（单位：g）

实施例5制备工艺：将琼枝麒麟菜多糖和环糊精放入研钵中研磨混合均匀，依次加入羧甲基淀粉钠、可压性淀粉混合均匀，再加入适量5%PVP的无水乙醇溶液作粘合剂制粒，40℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁混匀，压片，即得。实施例6-10制备工艺同实施例5。

实施例11-13琼枝麒麟菜多糖胶囊剂制备

表4胶囊剂处方（单位：g）

实施例11制备工艺：将琼枝麒麟菜多糖与β-环糊精放入研钵中研磨混合均匀，依次加入微晶纤维素、微粉硅胶混合均匀，最后加入己酮可可碱、双氯芬酸混匀，装填胶囊壳，即得。实施例12-13制备工艺同实施例11。

实施例14、琼枝麒麟菜多糖颗粒剂制备

表5颗粒剂处方（单位：g）

制备工艺：先将琼枝麒麟菜多糖与β-环糊精混合均匀，然后加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、十二烷基硫酸钠过16目筛后混合，后再与甜橙香精、阿斯巴甜混合均匀。混合物用5%聚维酮乙醇液制粒，干燥，整粒，分装，即得。

实施例15、琼枝麒麟菜多糖缓释片制备

表6缓释片处方（单位：g）

制备工艺：称取处方量的琼枝麒麟菜多糖，卡波姆，羟丙基纤维素，β-环糊精混合均匀。另取适宜量的8%淀粉浆溶液，加入混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。

实施例16、本发明琼枝麒麟菜多糖对柯萨奇B₃病毒引起心肌炎疾病的影响试验

1、试验分组

取Balb/c小鼠60只，随机分为5组，正常组、柯萨奇B₃ 病毒组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只。

2、试验方法

除正常组外，其余各组腹腔接种0.1mlCVB₃病毒液(TCID₅₀＝10-7.5，105倍稀释)，本发明的低、中和高剂量组同日灌胃给药，连续给药7天，观察至第15天，并记录给药(饲养)期间动物的精神状态、饮食、毛色及死亡等情况。

所述各组的给药量为：

正常组：灌胃给予等体积的生理盐水；

病毒对照组：灌胃给予等体积的生理盐水；

低剂量组：灌胃给予0.1g/kg实施例11制备的胶囊剂；

中剂量组：灌胃给予0.2g/kg实施例11制备的胶囊剂；

高剂量组：灌胃给予0.4g/kg实施例11制备的胶囊剂。

3、试验结果：

表7本发明药物对柯萨奇B₃病毒引起心肌炎疾病小鼠死亡率的影响

本发明琼枝麒麟菜多糖的低、中和高剂量组均能显著降低由柯萨奇B₃病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，而且本发明的高剂量组能极显著降低由柯萨奇B₃病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，说明本发明琼枝麒麟菜多糖对由柯萨奇B₃病毒引起的病毒性心肌炎的治疗效果呈现剂量依赖性。

实施例17、本发明琼枝麒麟菜多糖体内抗流感病毒活性动物试验

1、试验分组：

选取18-20g的昆明小鼠60只，设置病毒对照组、利巴韦林组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只。

2、试验方法：

本试验采用H1N1流感病毒为材料，使用10TCID₅₀浓度的病毒用滴鼻法感染，病毒感染2小时后口服给药，每天记录小鼠死亡情况，连续记录14天。另外，于感染第5天每组解剖4只小鼠，用肉眼观察其肺病变程度；

所述的各组的给药量：

病毒对照组：灌胃给予等体积的生理盐水；

利巴韦林组：灌胃给予0.1g/kg利巴韦林；

低剂量组：灌胃给予0.1g/kg实施例11制备的胶囊剂；

中剂量组：灌胃给予0.2g/kg实施例11制备的胶囊剂；

高剂量组：灌胃给予0.4g/kg实施例11制备的胶囊剂。

3、试验结果：

表8本发明琼枝麒麟菜多糖对小鼠肺病变面积减少的影响

本发明琼枝麒麟菜多糖的低、中和高剂量组能有效减少流感病毒感染后的肺病变面积，而且本发明的琼枝麒麟菜多糖高剂量组的抑制肺病率高达65.2%，有效的抑制H1N1流感病毒对小鼠的肺病的影响，对流感病毒显著的治疗效果。

实施例18、本发明琼枝麒麟菜多糖体内抗呼吸道合胞病毒活性

1、试验材料：

昆明种雄性或雌性小白鼠(18～22g)。采用小鼠RSV感染模型，测定琼枝麒麟菜多糖内抗呼吸道合胞病毒(抗RSV)活性。

2、试验分组：

选用BALB/C小鼠90只，随机分成9组，分别为正常组、病毒对照组、利巴韦林组、肝素组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、复方一组和复方二组，每组10只，

所述的各组的给药量为：

正常组：灌胃给予等体积的生理盐水；

病毒对照组：灌胃给予等体积的生理盐水；

利巴韦林组：灌胃给予0.1g/kg利巴韦林；

肝素组：灌胃给予0.1g/kg肝素，其中所述的肝素的效价以170IU/mg计；

低剂量组：灌胃给予0.1g/kg琼枝麒麟菜多糖；

中剂量组：灌胃给予0.2g/kg琼枝麒麟菜多糖；

高剂量组：灌胃给予0.4g/kg琼枝麒麟菜多糖；

复方一组：灌胃给予0.1g/kg利巴韦林+0.1g/kg琼枝麒麟菜多糖；

复方二组：灌胃给予0.1g/kg琼枝麒麟菜多糖+0.1g/kg肝素，其中所述的肝素的效价以170IU/mg计。

3、试验方法：

除了正常组外，其余各组经鼻滴入RSV悬液(TCID₅₀为10-6.6/ml)，然后灌胃给药7天，观察小鼠存活情况。最后给药40min后处死小鼠，无菌取肺组织，匀浆、用维持液吹打悬浮、离心、稀释，接种在Hep-2细胞上，采用细胞病变效应抑制法测定病毒滴度，计算病毒抑制率，病毒抑制率=（药物处理组吸光度-病毒对照组吸光度）/（细胞对照组吸光度-病毒对照组吸光度）*100%。

4、试验结果

表9本发明琼枝麒麟菜多糖体内抗呼吸道合胞病毒结果

可见本发明琼枝麒麟菜多糖在体内能显著抑制抗呼吸道合胞病毒，且具有剂量依赖性。并且琼枝麒麟菜多糖与利巴韦林或肝素联合使用取得了突出的预料不到的技术效果，并且取得了协同作用。

Claims (1)

1.琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道合胞病毒药物中的用途，其特征在于，所述的药物为琼枝麒麟菜多糖和肝素；

所述的琼枝麒麟菜多糖为α-D-(1-6)-葡萄糖硫酸酯琼枝麒麟菜多糖，所述的α-D-(1-6)-葡萄糖硫酸酯琼枝麒麟菜多糖的平均分子量为45000，所述的α-D-(1-6)-葡萄糖硫酸酯琼枝麒麟菜多糖的单糖硫酸基取代度为2.13。