CN104711244A - 以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素g酰化酶的方法 - Google Patents

以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素g酰化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法，该方法包括以下步骤：⑴配制装有斜面培养基的试管和装有斜面培养基的平皿；⑵无菌条件下在装有斜面培养基的试管中的斜面培养基上接种蜡状芽孢杆菌21090，经恒温培养得到活化的菌株；⑶制备细胞浓度为108个/mL的菌悬液；⑷紫外诱变选育高产青霉素G酰化酶的突变株；⑸以酪蛋白水解物等制备蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基；⑹青霉素G酰化酶发酵后得到发酵醪液；⑺发酵醪液预处理与酶液浓缩后得到浓缩酶液；⑻制备青霉素G酰化酶液体酶制剂；⑼制备青霉素G酰化酶固体酶粉：在PGA液体酶制剂中依次加入可溶性淀粉、氯化钠、甘油，混合均匀后经喷雾干燥即得PGA酶粉。本发明成本低、产量高。

Description

以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种青霉素酰化酶的生产方法，尤其涉及以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法。
背景技术
青霉素G酰化酶（PGA）是重要的工业用酶，广泛用于催化青霉素G生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）和催化头孢霉素G生成7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）。6-APA和7-ADCA是抗生素工业上生产半合成青霉素类抗生素和头孢霉素类抗生素的重要原料。
目前，青霉素G酰化酶年需求超过800吨，并且每年大约以10%左右的速度增长，而国内市场上销售的高活力青霉素G酰化酶制剂仍多数依赖于进口。我国自20世纪80年代开始青霉素G酰化酶的研究，主要集中在产青霉素G酰化酶工程菌的构建、青霉素G酰化酶酶分子特性和底物特异性研究、青霉素G酰化酶的分离纯化等方面。发酵生产青霉素G酰化酶虽已初步实现工业化，但产酶菌的产酶活性、工程菌的稳定性、生产工艺技术仍有待于提高。一方面，构建基因工程菌工作复杂而繁琐，所构建的菌株遗传稳定性较差。另一方面，目前国内外用于产青霉素G酰化酶的发酵培养基中的氮源主要为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等，来源有限且成本昂贵，不能够满足大规模工业化生产的需要。因此，获得高产青霉素G酰化酶生产菌株并提高其遗传稳定性，以及降低发酵培养基的生产成本，是国内青霉素G酰化酶工业化生产面临的最大挑战。
酪蛋白是西北藏区牦牛乳中含量最高的蛋白质，由α、β、γ和κ酪蛋白组成。利用酸水解技术制得的酪蛋白水解物，不但成本低，而且可发酵性含氮物质种类多、含量丰富，可作为食品原料或微生物培养基使用。酪蛋白水解物对菌体的生长及产酶能力具有一定的促进作用，是发酵生产青霉素G酰化酶的理想的培养基氮源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低、产量高的以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法。
为解决上述问题，本发明所述的以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法，包括以下步骤：
⑴配制斜面培养基：
将5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化钠、15g琼脂与1L蒸馏水混合，采用质量浓度为10%~20%的氢氧化钠溶液调pH值至7.0，分别装/倒入20ml试管和直径6cm平皿中，在高压蒸汽灭菌锅中维持1kg(f)/cm2灭菌30min，然后取出，自然冷却凝固，即分别得到装有斜面培养基的试管和装有斜面培养基的平皿；
⑵以蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 21090作为出发菌株，无菌条件下在所述装有斜面培养基的试管中的斜面培养基上接种所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 21090，置于30℃恒温培养箱中培养48h，得到活化的菌株；
⑶制备蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 21090菌悬液：
将5支所述活化的菌株，分别用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，振荡30min以打碎菌块；然后在3000r/min条件下离心15min，弃去上清液，得到菌体；将该菌体用无菌生理盐水洗涤2~3次，制成细胞浓度为108个/mL的菌悬液；
⑷紫外诱变选育高产青霉素G酰化酶的突变株：
打开15 W紫外线灯开关，预热15~25min；同时，在2套所述装有斜面培养基的平皿中分别加入所述菌悬液5mL，并放入无菌搅拌棒，置于磁力搅拌器上，然后在室温条件下距离紫外灯下30cm搅拌照射15min；最后，经筛选获得一株产青霉素G酰化酶酶活力为352U/L的突变株；
⑸制备蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基：
将16.2g酪蛋白水解物、6.8g牛肉膏、7g葡萄糖、18g苯乙酸、6g氯化钠、0.4 g氯化镁、0.005g氯化铁溶解于1L pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，然后在1kg(f)/cm2压强下灭菌30min，经自然冷却至30℃后，即得蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基；
⑹青霉素G酰化酶的发酵生产：
在250ml三角瓶中装入60ml所述蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基，然后置于恒温振荡器上，在30℃下以220 r/min的转速恒温振荡培养72h，得到青霉素G酰化酶酶活力为408U/L的发酵醪液；
⑺发酵醪液预处理与酶液浓缩：
在所述发酵醪液中按其体积的0.05%加入絮凝剂聚丙烯酰胺，搅拌均匀后，再按所述发酵醪液体积的0.01%的加入葡聚糖，继续搅拌，静置1h，在3000r/min条件下离心2 次，每次15min，得到澄清酶液；所述澄清酶液在温度为35℃、真空度为- 100~-90kPa的条件下，经薄膜浓缩50~60min后，得到浓缩酶液；
⑻制备青霉素G酰化酶液体酶制剂：
往所述浓缩酶液中边搅拌边加入研细的固体硫酸铵，当其饱和度为50%时，以8000 r/min的速率离心10 min去除杂蛋白，得到上清液；然后再往所述上清液中继续加入所述研细的固体硫酸铵，当其饱和度为70%时，完全沉淀青霉素G酰化酶，得到沉淀物；将所述沉淀物按5%的比例溶解于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，随后经孔径为0.01μm的超滤膜处理，脱去硫酸铵，得到酶活力达到13U/ml 的青霉素G酰化酶液体酶制剂；
⑼制备青霉素G酰化酶固体酶粉：
在所述青霉素G酰化酶液体酶制剂中依次加入其体积12%的可溶性淀粉、10%的氯化钠、5%的甘油，混合均匀后经喷雾干燥即得青霉素G酰化酶固体酶粉。
所述步骤⑺中的薄膜规格为0.2μm。
所述步骤⑼中喷雾干燥的条件是指热风进口温度135℃、热风流量5 m3/min、出口温度60℃、进料速度160ml/h、雾化器压力0.4MPa。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明充分利用牦牛乳酸水解酪蛋白的优良特性，通过紫外诱变选育出一株高产青霉素G酰化酶的突变菌株，以酪蛋白水解液作为培养基的主要氮源，确定了培养基配方、发酵工艺参数和酶制剂制备工艺方法，在降低生产成本的情况下有效提高了产量。
2、本发明所得产品为类白色固体颗粒，无结块、无潮解现象，无异味，有特殊发酵气味。经理化检测，本发明所得产品符合技术指标要求（参见表1）。
表1  PGA的理化与卫生指标检测结果
3、采用本发明后，可显著增加酪蛋白的附加值，增加农牧民收入，同时也增加了青霉素G酰化酶的产品种类和数量，减少了进口，节约了外汇。另外，本发明为甘肃省特色资源酪蛋白的进一步开发利用开辟了一条新的途径，延伸了酪蛋白产业链，可有效带动农牧民增收，降低青霉素G酰化酶生产成本，提高企业经济效益。
具体实施方式
以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法，包括以下步骤：
⑴配制斜面培养基：
将5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化钠、15g琼脂与1L蒸馏水混合，采用质量浓度为10%~20%的氢氧化钠溶液调pH值至7.0，分别装/倒入20ml试管和直径6cm平皿中，在高压蒸汽灭菌锅中维持1kg(f)/cm2灭菌30min，然后取出，自然冷却凝固，即分别得到装有斜面培养基的试管和装有斜面培养基的平皿。
⑵以蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 21090作为出发菌株，无菌条件下在装有斜面培养基的试管中的斜面培养基上接种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 21090，置于30℃恒温培养箱中培养48h，得到活化的菌株。
其中：蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 21090购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
⑶制备蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 21090菌悬液：
将5支活化的菌株，分别用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，振荡30min以打碎菌块；然后在3000r/min条件下离心15min，弃去上清液，得到菌体；将该菌体用无菌生理盐水洗涤2~3次，制成细胞浓度为108个/mL的菌悬液。
⑷紫外诱变选育高产青霉素G酰化酶的突变株：
打开15 W紫外线灯开关，预热15~25min；同时，在2套装有斜面培养基的平皿中分别加入菌悬液5mL，并放入无菌搅拌棒，置于磁力搅拌器上，然后在室温条件下距离紫外灯下30cm搅拌照射15min；最后，经筛选获得一株产青霉素G酰化酶酶活力为352U/L的突变株。
⑸制备蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基：
将16.2g酪蛋白水解物、6.8g牛肉膏、7g葡萄糖、18g苯乙酸、6g氯化钠、0.4 g氯化镁、0.005g氯化铁溶解于1L pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，然后在1kg(f)/cm2压强下灭菌30min，经自然冷却至30℃后，即得蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基。
其中：酪蛋白水解物由临夏州华安生物制品有限公司提供。
⑹青霉素G酰化酶的发酵生产：
在250ml三角瓶中装入60ml蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基，然后置于恒温振荡器上，在30℃下以220 r/min的转速恒温振荡培养72h，得到青霉素G酰化酶酶活力为408U/L的发酵醪液。
⑺发酵醪液预处理与酶液浓缩：
在发酵醪液中按其体积的0.05%加入絮凝剂聚丙烯酰胺，搅拌均匀后，再按发酵醪液体积的0.01%的加入葡聚糖，继续搅拌，静置1h，在3000r/min条件下离心2 次，每次15min，得到澄清酶液；所述澄清酶液在温度为35℃、真空度为- 100~-90kPa的条件下，经0.2μm的薄膜浓缩50~60min后，得到浓缩酶液。
⑻制备青霉素G酰化酶液体酶制剂：
往浓缩酶液中边搅拌边加入研细的固体硫酸铵，当其饱和度为50%时，以8000 r/min的速率离心10 min去除杂蛋白，得到上清液；然后再往上清液中继续加入研细的固体硫酸铵，当其饱和度为70%时，完全沉淀青霉素G酰化酶，得到沉淀物；将沉淀物按5%的比例溶解于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，随后经孔径为0.01μm的超滤膜处理，脱去硫酸铵，得到酶活力达到13U/ml 的青霉素G酰化酶液体酶制剂。
⑼制备青霉素G酰化酶固体酶粉：
在青霉素G酰化酶液体酶制剂中依次加入其体积12%的可溶性淀粉、10%的氯化钠、5%的甘油，混合均匀后，在热风进口温度135℃、热风流量5 m3/min、出口温度60℃、进料速度160ml/h、雾化器压力0.4MPa的条件下经喷雾干燥即得青霉素G酰化酶固体酶粉。

Claims (3)

1.以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法，包括以下步骤：
⑴配制斜面培养基：
将5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化钠、15g琼脂与1L蒸馏水混合，采用质量浓度为10%~20%的氢氧化钠溶液调pH值至7.0，分别装/倒入20ml试管和直径6cm平皿中，在高压蒸汽灭菌锅中维持1kg(f)/cm2灭菌30min，然后取出，自然冷却凝固，即分别得到装有斜面培养基的试管和装有斜面培养基的平皿；
⑵以蜡状芽孢杆菌21090作为出发菌株，无菌条件下在所述装有斜面培养基的试管中的斜面培养基上接种所述蜡状芽孢杆菌21090，置于30℃恒温培养箱中培养48h，得到活化的菌株；
⑶制备蜡状芽孢杆菌21090菌悬液：
将5支所述活化的菌株，分别用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，振荡30min以打碎菌块；然后在3000r/min条件下离心15min，弃去上清液，得到菌体；将该菌体用无菌生理盐水洗涤2~3次，制成细胞浓度为108个/mL的菌悬液；
⑷紫外诱变选育高产青霉素G酰化酶的突变株：
打开15 W紫外线灯开关，预热15~25min；同时，在2套所述装有斜面培养基的平皿中分别加入所述菌悬液5mL，并放入无菌搅拌棒，置于磁力搅拌器上，然后在室温条件下距离紫外灯下30cm搅拌照射15min；最后，经筛选获得一株产青霉素G酰化酶酶活力为352U/L的突变株；
⑸制备蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基：
将16.2g酪蛋白水解物、6.8g牛肉膏、7g葡萄糖、18g苯乙酸、6g氯化钠、0.4 g氯化镁、0.005g氯化铁溶解于1L pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，然后在1kg(f)/cm2压强下灭菌30min，经自然冷却至30℃后，即得蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基；
⑹青霉素G酰化酶的发酵生产：
在250ml三角瓶中装入60ml所述蜡状芽孢杆菌突变株发酵培养基，然后置于恒温振荡器上，在30℃下以220 r/min的转速恒温振荡培养72h，得到青霉素G酰化酶酶活力为408U/L的发酵醪液；
⑺发酵醪液预处理与酶液浓缩：
在所述发酵醪液中按其体积的0.05%加入絮凝剂聚丙烯酰胺，搅拌均匀后，再按所述发酵醪液体积的0.01%的加入葡聚糖，继续搅拌，静置1h，在3000r/min条件下离心2 次，每次15min，得到澄清酶液；所述澄清酶液在温度为35℃、真空度为- 100~-90kPa的条件下，经薄膜浓缩50~60min后，得到浓缩酶液；
⑻制备青霉素G酰化酶液体酶制剂：
往所述浓缩酶液中边搅拌边加入研细的固体硫酸铵，当其饱和度为50%时，以8000 r/min的速率离心10 min去除杂蛋白，得到上清液；然后再往所述上清液中继续加入所述研细的固体硫酸铵，当其饱和度为70%时，完全沉淀青霉素G酰化酶，得到沉淀物；将所述沉淀物按5%的比例溶解于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，随后经孔径为0.01μm的超滤膜处理，脱去硫酸铵，得到酶活力达到13U/ml 的青霉素G酰化酶液体酶制剂；
⑼制备青霉素G酰化酶固体酶粉：
在所述青霉素G酰化酶液体酶制剂中依次加入其体积12%的可溶性淀粉、10%的氯化钠、5%的甘油，混合均匀后经喷雾干燥即得青霉素G酰化酶固体酶粉。
2.如权利要求1所述的以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法，其特征在于：所述步骤⑺中的薄膜规格为0.2μm。
3.如权利要求1所述的以酪蛋白水解物为氮源发酵生产青霉素G酰化酶的方法，其特征在于：所述步骤⑼中喷雾干燥的条件是指热风进口温度135℃、热风流量5 m3/min、出口温度60℃、进料速度160ml/h、雾化器压力0.4MPa。
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