CN104703683A

CN104703683A - 流体集成旋转珠磨机

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Publication number: CN104703683A
Application number: CN201380026996.7A
Authority: CN
Inventors: J·卡雷拉法布拉; A·科芒热卡萨斯; R·马丁布兰诺; R·布鲁吉贝特
Original assignee: Stat Diagnostica and Innovation SL
Current assignee: Stat Diagnostica and Innovation SL
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2033-04-11
Also published as: JP5931275B2; ZA201500087B; AU2013246867B2; US9304066B2; AU2013246867A8; EP2836294A1; KR20150023248A; BR112014025389B1; JP2016075703A; CA2870220A1; KR102251762B1; EP2836294B1; IN2014KN02333A; CN104703683B; DK2836294T3; US20130280710A1; JP2015515629A; ES2647942T3; AU2013246867A1; CA2870220C

Abstract

一种用于样品的匀化和裂解中的至少一种的系统，其包括一个或多个壁，所述壁形成具有进口和多个流体连接的密闭室。将第一流体网络连接多个流体连接中的至少一个，并且将第二流体网络连接多个流体连接中的至少一个。该系统进一步包括在室内的旋转元件，和配置成使旋转元件旋转的致动器。第一流体网络配置成将至少样品从至少一个第一存储器引入室中。第二流体网络配置成将至少样品从室中排入至少一个第二存储器中。旋转元件通过致动器围绕沿着旋转元件长度延伸的轴来旋转。

Description

流体集成旋转珠磨机

发明领域

本发明的实施方案涉及珠磨机(bead beater)。

发明背景

鉴于分子测试和免疫试验技术自动化的复杂性，缺乏提供适当性能使得在近病人测试环境临床上可用的产品。通常的分子测试包括涉及正确剂量的试剂、样品引入、样品匀化、细胞裂解以提取DNA和/或RNA、纯化步骤和扩增以用于其随后检测的各种过程。即使存在将这些过程中的一些自动化的中央实验室机器人平台，但对于许多需要短的周转时间的许多测试，中央实验室不能在所需的时间需求内提供结果。

生物样本的匀化和/或裂解通常是测试过程中的初始步骤，使得可以获得一种或多种得到合适纯化的用于分子测试的分析物。一般而言，存在三种主要的细胞裂解方法：化学、酶和物理方法。这些方法可以单独或组合使用，按序或在单个步骤中，以获得更佳的过程。化学和酶方法的使用可以证明是有问题的，因为一些用于破裂细胞壁的化学品可以使存在的任何酶变性或在随后的过程中产生问题。

用于细胞破裂的物理方法包括超声波处理、加热(通常在90-100℃之间)、重复的冻-融、形成快速且大的压力变化和机械方法。机械方法涉及通过物理力(如，高剪切力)、研磨以及用小颗粒(常常由珠子组成)轰击细胞的细胞壁的物理破裂。机械的破坏方法具有多种优势。它们常常使用一步过程，通常是非常快速的，易于自动化，并且具有破坏固体样本(如，骨头)的能力，这类固体样本不使用机械匀化不可能获得目标分析物。

发明概述

提供了一种可以与近病人测试系统整合的机械珠磨机系统和方法。

在一个实施方案中，一种用于样品的匀化和裂解中的至少一种的系统包括一个或多个壁，其形成具有进口和多个流体连接的密闭室。将第一流体网络连接多个流体连接中的至少一个，并且将第二流体网络连接多个流体连接中的至少一个。该系统进一步包括在室内的旋转元件，和配置成使旋转元件旋转的致动器。第一流体网络配置成将至少样品从至少一个第一存储器引入室中。第二流体网络配置成将至少样品从室中排入至少一个第二存储器中。旋转元件通过致动器围绕沿着旋转元件长度延伸的轴来旋转。

在一个实施方案中，一种用于进行分子测试的系统包括具有一个或多个流体室和流体网络的外壳和致动器，一个置于所述壳内的珠磨机。流体网络将至少一个或多个流体室连接至可移动中央室。珠磨机进一步包括一个或多个形成具有进口和多个流体连接的密闭室的壁和密闭室内的旋转元件。多个流体连接的至少一部分连接外壳的流体网络。旋转元件通过围绕沿着旋转元件长度延伸的轴的致动器来旋转。

描述一种裂解样品的实例方法。该方法包括将样品经由连接流体网络的流体连接引入密闭室中，所述流体网络进一步连接一个或多个其他室。该方法进一步包括在密闭室内沿着轴旋转旋转元件，所述轴是沿着旋转元件长度延伸的。该方法进一步包括在密闭室内通过旋转元件的移动来裂解样品。

描述了另一种裂解样品的实例方法。该方法包括将样品经由连接流体网络的流体连接引入密闭室中，所述流体网络进一步连接一个或多个其他室。该方法进一步包括在密闭室内沿着轴旋转旋转元件，所述轴是沿着旋转元件长度延伸的。该方法进一步包括在密闭室内通过旋转元件的移动激发多个珠子。该方法进一步包括在密闭室内经由旋转元件和多个珠子的移动来裂解样品。

描述了一种匀化样品的实例方法。该方法包括将样品经由连接流体网络的流体连接引入密闭室中，所述流体网络进一步连接一个或多个其他室。该方法进一步包括在密闭室内沿着轴旋转旋转元件，所述轴是沿着旋转元件长度延伸的。该方法进一步包括在密闭室内经由旋转元件的移动来匀化样品。

描述了另一种匀化样品的实例方法。该方法包括将样品经由连接流体网络的流体连接引入密闭室中，所述流体网络进一步连接一个或多个其他室。该方法进一步包括在密闭室内沿着轴旋转旋转元件，所述轴是沿着旋转元件长度延伸的。该方法进一步包括在密闭室内通过旋转元件的移动激发多个珠子。该方法进一步包括在密闭室内经由旋转元件和多个珠子的移动来匀化样品。

附图简述

在本文中伴随的并且形成说明书一部分的附图说明了本发明的实施方案，并且与描述一起，进一步用于解释本发明的原理，并且能够使本领域技术人员理解和使用本发明。

图1是根据实施方案的测试筒平台的示意图。

图2A-2B展示了根据实施方案的珠磨机系统。

图3A-3B展示了根据实施方案的珠磨机系统的更多视图。

图4展示了根据实施方案的珠磨机系统的分解图。

图5展示了显示出根据实施方案的珠磨机系统内部的视图。

图6A-6B展示了根据实施方案的珠磨机系统的截面视图。

图7A-7E展示了根据实施方案的旋转元件的视图。

图8-11是说明了通过根据实施方案的珠磨机系统进行的方法的图。

图12是从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子测量的DNA浓度的图。

图13是从枯草芽孢杆菌营养细胞测量的DNA浓度的图。

图14是从枯草芽孢杆菌营养细胞收集的DNA的图。

图15是从枯草芽孢杆菌营养细胞测量的DNA和RNA浓度的图。

图16是从枯草芽孢杆菌营养细胞收集RNA的图。

图17A-17C是来自枯草芽孢杆菌的生物分析仪rRNA谱。

将参照附图描述本发明的实施方案。

详述

尽管讨论了特定的构造和排列，应当理解这只是为了说明性的目的。本领域技术人员将认识到可以使用其他构造和排列，而没有脱离本发明的精神和范围。本领域的技术人员将清楚本发明也可以用于各种其他应用中。

注意到说明书涉及的“一个(one)实施方案”、“一个(an)实施方案”、“一个(an)实例实施方案”等，表示所述的实施方案可以包括特定的特点、结构或特征，但每个实施方案不是必需包括特定的特点、结构或特征。此外，这样的短语不一定涉及相同的实施方案。此外，当结合实施方案描述特定的特点、结构或特征时，结合其他实施方案实现这样的特点、结构或特征在本领域技术人员的知识范围内，不管这些其他实施方案有没有明确描述。

本文中所述的实施方案涉及用于样品的匀化和/或裂解的珠磨机系统。样品可以是液体、固体、半固体或其组合。在一个实施方案中，珠磨机系统与测试筒平台整合。测试筒平台包括流体通道的网络，其一部分可以连接集成的珠磨机。流体通道可以将样品提供给珠磨机室，从珠磨机室提取出样品和/或用于给珠磨机室加压。

将珠磨机系统设计成通过例如珠磨机室内的旋转元件的旋转来使用样品的物理破坏。这种物理破坏又得益于珠子的存在(例如，玻璃和/或其他材料制成的惰性珠子)。在一个实施例中，通过在珠磨机室内使用裂解缓冲液来进一步优化裂解和/或匀化过程，在另一个实施例中，通过给样品加热来进行酶裂解。在一些实施例中，在样品的实际珠磨前，进行样品的加热。在一个实施方案中，在测试筒平台内包含珠磨机所有需要的试剂和组分。

在一些实施方案中，测试筒平台和集成的珠磨机设计成在使用后可丢弃的。一旦将试剂或样品置于测试筒内，它们不再接触外部环境或外部测量仪器的任何部分。这一特点对于许多实验室和医院能够在使用后安全地丢弃产品是重要的。

珠磨机室自身设计成能够处理各种样本并且能够破坏各种细胞类型。这部分地通过每种样本/细胞类型组合特定的不同测试筒平台的可利用性来实现。在另一个实施例中，通过分析仪控制的可变条件，如旋转元件的旋转速度和持续时间，允许处理各种样品类型。

本文中参考附图描述了关于珠磨机组成部分的更多详细内容。应当理解每个物理组成部分的说明不是用来限制并且相关领域的技术人员鉴于本文中的描述将认识到重新排列或另外改变任一个组成部分的方式，而没有偏离本发明的范围或精神。

图1说明了根据实施方案的其中可以整合珠磨机的实例测试筒系统。尽管本文中参照了实例测试筒系统的结构，本领域技术人员将认识到本文中所述的珠磨机实施方案可以与任一种测试系统类型和构造一起使用。

测试筒系统包括筒外壳102和转移模块104。还可以考虑其他组成部分包括在测试筒系统中，如分析仪模块或各种活动组成部分，如泵或加热器。转移模块104包括内壳110、夹套108和盖子106。根据实施方案，夹套108设计成适合围绕内壳110。盖子106设计成密封转移模块104的末端，以防止渗漏。转移模块104设计成经由室底板120插入筒外壳102中。

筒外壳102包括多个流体通道、室和存储器。例如，筒外壳102可以包括多个存储室116，其可以含有试验或PCR实验方案过程中使用的各种缓冲剂或其他试剂。存储室116可以预先装满各种液体，使得最终的使用者将测试筒系统放入分析仪之前，将不需要装满存储室116。筒外壳102可以进一步包括一个或多个连接沿着筒外壳102一侧的流体通道的处理室124a-b。处理室124a-b可以用于各种处理和/或废物应用。在一个实施例中，室124a是废物室，而室124b是尺寸设定为接收其上具有样品的棉签的长度的室。

根据实施方案，经由样品口114，将样品引入筒外壳102。使用者可以将棉签完全放入样品口114及其相应的室124b内，并且随后用端口盖子114密封端口。在另一个实施例中，样品口114接收固体、半固体或液体样品。在一个实施方案中，筒外壳102包括超过一个进口来引入样品。

可以通过使用覆盖物118、126、127和128来密封围绕筒外壳102的各种室和通道。覆盖物可以是能够密封筒外壳102内的流体的薄膜。在另一个实施例中，覆盖物可以是塑料板。在一个实施例中，一个或多个覆盖物是透明的。另外，一个或多个覆盖物可以是热控制的，用于加热外壳102的一部分。

集成的测试筒系统允许使用者将样品放入例如样品口114中，然后将测试筒系统放入分析仪中。在实施方案中，待进行的反应步骤包括，例如纯化、裂解、混合、结合、标记和/或检测，全部可以通过与分析仪的相互作用在测试筒内进行，而不需要任何最终使用者的干预。此外，由于全部液体保持密封在测试筒系统中，因此完成测试后，测试筒系统可以从分析仪中取出，并且安全地丢弃，没有污染分析仪。

测试筒系统可以进一步包括流体通道，其通向具有开口132的内处理室。在一个实施方案中，内处理室是置于筒外壳102内的集成珠磨机室。尽管室自身在图1的视图中是隐藏的，但在分解图中显示了系统的各个其他组成部分。例如，珠磨机系统包括适合盖在开口132上的加工盖134。在室自身内，根据实施方案，放置旋转元件136。在一个实施方案中，旋转元件136通过密封件138和套管139连接致动器(未显示)。密封件138和套管139可以通过支持物140保持在适当位置。在一个实施例中，密封件138是盖子密封件。可以使用其他类型的密封部件。支持物140也可以啮合内处理室的末端并且将其密封，防止任何泄露。本文中将更详细地解释珠磨机系统的每个组成部分。

图2A和2B说明了旋转珠磨机系统的实例实施方案。两个实施方案中的相似部件给出了相同的数字标记。列出了每个实施方案的描述，以描述可以存在于珠磨机系统之上或之内的部件，但不应当作为部件放置或尺寸特性的限制。

图2A和2B提供了珠磨机201的透视图，根据实施方案，其可以整合至测试筒系统中。图2B中说明的珠磨机201的外部视图展示了在根据一个实施方案的珠磨机201顶面的处理进口132。在图2A中说明的珠磨机实施方案中，处理进口在珠磨机201反面那侧上，并且因此未显示。处理进口132配置成接收任何类型的样品，包括液体、固体、半固体，或其任意组合。处理进口132通向密闭室，在那进行珠磨过程。在另一个实施例中，将进入处理进口132的样品导向第一个室，并且随后从第一个室转移至第二个室，在那进行珠磨处理。

在珠磨机201的一侧上，提供流体进口，以连接流体网络。图2A的珠磨机实施方案具有三个流体进口203a-c，而图2B的珠磨机实施方案具有两个流体进口203a和203b。例如，流体进口203a-c可以连接筒外壳102的任一个储存室116。在一个实施方案中，流体进口203a-c通向在那进行珠磨的室。如此，流体进口203a-c可用于向珠磨室引入任何液体。从珠磨室提取任何液体，或在珠磨室应用压力差，或其任意组合。应当理解可以存在通向珠磨室的多种流体连接。此外，多个流体连接中的任一个可以通向筒外壳102的一个或多个室。在一个实施方案中，第一流体网络连接流体进口，并且将至少样品从第一个存储器引入室中，同时第二流体网络连接流体连接，并且用于从室中将样品排入第二个存储器中。在一个实施方案中，流体网络、珠磨机和存储器形成密闭系统。

根据一个实施方案，在珠磨机201的外部，致动器系统202连接放置在珠磨机室内的旋转元件136(未显示)。在一个实施例中，致动器系统202是旋转致动器。致动器系统202可以通过耦合器204接收各种信号。例如，信号可以包括力或控制信号。耦合器204可以呈现电报、RF信号或光学信号。致动器系统202可以以致动器202能力范围内的任何速度旋转旋转元件136。在一个实施例中，致动器系统202以50 RPM至30,000RPM的速度旋转旋转元件136。

图2A中说明的珠磨机的实施方案还包括置于珠磨机201侧壁上的空腔205。空腔205可以被热传导材料覆盖，例如，铝箔。通过加热热传导材料，珠磨机201内处理室内的内含物经由空腔205得到加热。应当理解空腔205的放置不限于珠磨机201的侧面。空腔还可以放置在珠磨机201的顶部或在珠磨机201的背面。在另一个实施例中，内处理室的一个或多个壁可以是热控制表面，以加热内处理室的内含物，而不需要空腔。内处理室的一个或多个壁可以由具有高热传导性的金属，如铝、铜等制造。将热引入内处理室使得允许进行样品的酶裂解。在一个实施例中，在样品实际的珠磨开始之前，使用施加于样品的热来进行酶裂解。

图3A说明了珠磨机201的另一个视图，致动器202脱离于珠磨机201的主体。提供插接元件302，其将致动器202连接珠磨机室内的旋转元件136(未显示)。插接元件302可以是，例如，轴、螺钉或用于接收另一个元件的凹槽。致动器202配置成可人工或自动从珠磨机室内的旋转元件136拆卸下来，使用者只需要很少的力。插接元件302可以制成合适的形状，以在旋转元件136的接收部分内啮合，或可以自身接收旋转元件136的一部分。根据一个实施方案，插接元件302的旋转引起旋转元件136的旋转。

图3B说明了根据一个实施方案的珠磨机201的另一个视图。图3B说明了如图2A中所示的珠磨机201的另一个角视图，除去了致动器202。根据一个实施方案，显示了插入了珠磨机201一侧上的孔中的支持物140。根据一个实施方案，在凹槽304内，旋转元件136的一部分伸出密闭室。旋转元件136的这个部分包括结构306。结构306可以设计成从致动器贴合地啮合至插接元件302中。在一个实施例中，通过致动器202引起的插接元件302的旋转引起旋转元件136末端上的结构306基本上相同的旋转。

图4说明了根据一个实施方案的旋转元件136和致动器202的各个组成部分的分解图。根据一个实施方案，珠磨机201的开口401接收支持物140，其有助于致动器202与旋转元件136的连接。还可以包括其他元件，用于将旋转元件136连接致动器202，例如，密封件138和套管139。这些元件还可以提供一个屏障，将样品保持在珠磨机室内，以免从旋转元件136伸出室外的周围区域中渗漏出来。

根据一个实施方案，轴402连接旋转元件136末端上的结构306，所述旋转元件136具有旋转体404。旋转体404可以采用各种形状和大小。轴402的长度可以针对珠磨机室的不同大小而调节。应当注意到，在一些实施方案中，显示了珠磨机的所有组成部分，除了致动器202打算在珠磨机的单次使用或单次测试过程中的一系列使用后丢弃。

还说明了在珠磨机201的一侧是多个玻璃料406。每个玻璃料406可以包括各种设计成过滤或捕获各种颗粒大小的各种材料。在一个实施例中，玻璃料406是具有可选择孔径的薄网的塑料材料，所述孔径范围可以为5微米至500微米之间的任意值。在一个实施方案中，玻璃料406具有大约20微米的孔径。从珠磨机室提取出来的流体可以通过至少一个玻璃料406，使得得到过滤。

图5说明了珠磨机201的珠磨机室的内部视图。密闭室502提供了在那进行样品的匀化和/或裂解的区域。在一个实施方案中，密闭室502基本上是圆柱形。圆柱形随着旋转元件的旋转提供了围绕该旋转元件的有效流体运动。密闭室502还可以具有矩形横截面。也可以考虑其他形状的密闭室502，用于例如增强密闭室502内放置的多个珠子的搅拌。参照图6B更详细地描述了多个珠子用于提高匀化和/或裂解过程的用途。

根据一个实施方案，包括与密闭室502的多个流体连接。显示了按照之前所述的沿着一侧的流体进口203a-c。在一个实施例中，可以经由流体进口203a或203b，将样品和/或其他液体引入密闭室502中。在另一个实施例中，裂解或匀化后所得到的混合物可以经由流体进口203c从密闭室502排出。多个流体连接可以放置在密闭室502周围的任何一处，并且以任何角度放置。说明了处理进口132和加热腔205也在密闭室502的侧面。热控制表面可以密封加热腔205，并且加热密闭室502的内含物。在一个实施例中，加热密闭室502的内含物引起酶裂解发生。在另一个实施例中，轴402可以旋转，以搅拌样品以及在加热过程中均匀密闭室502内的温度。

图6A说明了根据一个实施方案的珠磨机201的侧视图，观察到除去了覆盖物的处理进口132。在一个实施例中，观察到旋转体404基本上在密闭室502的中心。

图6B说明了根据一个实施方案的包括支持物140的密闭室502内部的横截面视图。轴402延伸通过支持物140，并且连接密闭室502内的旋转体404。根据一个实施方案，轴402的一端啮合至密闭室402的凹口602中。凹口602可以用于稳定轴402在密闭室502内的位置，而同时仍然允许旋转体404的旋转。密闭室502还可以包括多个珠子604。可以包括珠子，以帮助密闭室502内的样品的匀化和/或裂解。旋转体404的旋转也激发了多个珠子604的移动。多个珠子604中的个别珠子的大小范围可以为一微米直径至3000微米直径。另外，多个珠子604可以从各种惰性材料，包括塑料、玻璃、陶瓷和二氧化硅制造。

图7A-7E说明了旋转元件136的不同实施方案。这些实施方案是示例性的，并且应当理解鉴于本文中的描述，本领域技术人员也可以考虑其他设计。如之前所述的，每个实施方案中的旋转元件136包括轴402，在其一端具有结构306。针对主体702和部件704，说明了各种设计。主体702可以是任何合适的足够硬的材料，以进行坚硬样品类型(如，骨头和组织)的匀化。另外，主体702可以是生物相容性材料。提供部件704，使得给主体702提供模型化的形状。部件704在密闭室502内的旋转引起样品和室周围的任何其他材料的快速移动。在另一个实施例中，部件704的旋转引起多个珠子604的激发和移动。根据一些实施方案，每个说明的设计还包括旋转元件136一端的钉子706。钉子706可以配置成啮合密闭室502的凹口602。应当理解钉子706不是旋转元件136的必需元件，但可以用于增强在密闭室502内的稳定性。

图8-11描述了根据一个实施方案的用于匀化或裂解样品的实例方法，使用或不使用珠子。应当理解方法800、900、1000和1100描述了可以用珠磨机201进行的实例操作顺序，并且应当不认为是限制。方法800、900、1000和1100的任一种还可以包括加热珠磨机201内的内含物的步骤，以进行酶裂解。在一个实例中，酶裂解是在进行珠磨之前进行的。

图8展示了使用珠磨机201裂解样品的实例方法800的流程图。细胞裂解的目的是释放分析需要的细胞内含物。细胞内含物的实例包括，但不限于，DNA、RNA、多肽、酶、朊病毒、蛋白质、抗体、抗原、过敏原和病毒粒(viron)。

在模块802，将至少样品经由连接流体网络的进口引入密闭室。例如，可以通过流体进口203a-c引入样品。

在模块804，旋转元件在密闭室内旋转。旋转元件配置成通过外部致动器沿着轴旋转，所述轴沿着旋转元件的长度延伸。

在模块806，将样品在密闭室内经由旋转元件的移动来裂解。裂解物可以经由流体进口203a-c之一从密闭室转移至第二个室。

图9展示了使用含有多个珠子的珠磨机201裂解样品的实例方法800的流程图。细胞裂解的目的是释放分析需要的细胞内含物。细胞内含物的实例包括，但不限于，DNA、RNA、多肽、酶、朊病毒、蛋白质、抗体、抗原、过敏原和病毒粒(viron)。所包括的珠子用来加速撕裂细胞壁的过程，以释放细胞内含物。

在模块902，将至少样品经由连接流体网络的进口引入密闭室中。例如，样品可以通过流体进口203a-c引入。

在模块904，旋转元件在密闭室内旋转。旋转元件配置成通过外部致动器沿着轴旋转，所述轴沿着旋转元件的长度延伸。

在模块906，室内的多个珠子通过旋转元件的移动来激发。按照之前所述的，珠子的形状、大小和/或材料可以改变。室内增加的珠子的移动提供了更多的细胞研磨，并且形成更有效的裂解过程。

在模块908，样品在密闭室内通过旋转元件和多个珠子的移动来裂解。裂解物可以经由流体进口203a-c之一从密闭室转移至第二个室。

图10展示了使用珠磨机201匀化样品的实例方法1000的流程图。

在模块1002，将至少样品经由连接流体网络的进口引入密闭室中。例如，样品可以通过流体进口203a-c或通过任何其他合适的端口引入。在一个实施方案中，可以提供固体、半固体或液体样品用于匀化。例如，具有高粘度的样品(例如，痰液、组织、骨头)非常适用于匀化，以粉碎将样品的细胞组分连接在一起的复合基质。

在模块1004，旋转元件在密闭室内旋转。旋转元件配置成通过外部致动器沿着轴旋转，所述轴沿着旋转元件的长度延伸。

在模块1006，样品在密闭室内经由旋转元件的移动来匀化。匀化的样品可以使用珠磨机201裂解或转移至另一个室，用于进一步处理。

图11展示了使用含有多个珠子的珠磨机201匀化样品的实例方法1000的流程图。

在模块1102，将至少样品经由连接流体网络的进口引入密闭室中。例如，样品可以通过流体进口203a-c或通过任何其他合适的端口引入。在一个实施方案中，可以提供固体、半固体或液体样品用于匀化。例如，具有高粘度的样品(例如，痰液、组织、骨头)非常适用于匀化，以粉碎将样品的细胞组分连接在一起的复合基质。

在模块1104，旋转元件在密闭室内旋转。旋转元件配置成通过外部致动器沿着轴旋转，所述轴沿着旋转元件的长度延伸。

在模块1106，室内的多个珠子通过旋转元件的移动来激发。按照之前所述的，珠子的形状、大小和/或材料可以改变。室内增加的珠子的移动提供了更多的样品研磨，并且形成更有效的裂解过程。

在模块1108，样品在密闭室内通过旋转元件和多个珠子的移动来匀化。匀化的样品可以使用珠磨机201裂解或转移至另一个室，用于进一步处理。

具体实施方式

现在讨论使用珠磨机201的实施方案进行的实例实验方案。这样的实验方案只是实例，并不是对本发明实施方案的限制。对于实例实验方案，分析从各种样品提取的DNA和RNA，并且与对照比较，以确定珠磨机的有效性。应当理解本文所述的步骤只是提供了使用系统的几个可能的实例。

实施例1：从枯草芽孢杆菌内生孢子提取DNA

枯草芽孢杆菌，也称为枯草杆菌或草杆菌，是革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性细菌。芽孢杆菌属的成员，枯草芽孢杆菌是杆状的，并且具有形成坚硬的、保护性的内生孢子的能力，允许生物体耐受极端环境条件。各种芽孢杆菌种的内生孢子在孢子形成中形成，孢子形成是通常由环境中营养素水平降低诱发的过程。内生孢子含有外孢子皮层，其非常能够抵抗苛刻的物理和化学处理，使得可以在几分钟内完成鉴定孢子裂解方法成为挑战。

用于裂解枯草芽孢杆菌细胞的实例实验方案改编自W.Nicholson和P.Setlow，Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢杆菌的分子生物学方法)，New York，John Wiley，pp.391-450，1990。在这个实例实验方案中，将生长于孢子形成培养基(SM)中的枯草芽孢杆菌spizizeni i亚种(ATCC 6633)的100mL培养物进行涡旋，然后分成两个50mL的体积。在3750g离心15分钟后，将沉淀物用50mL无菌冷蒸馏水洗涤三至五次，每次洗涤在3750g下离心15分钟。将最终的沉淀物重悬浮于50mL无菌冷蒸馏水中。用DNase处理孢子悬浮液，以除去外部残余的DNA，定量并稀释至5×10⁹个内生孢子/mL的终浓度。在Tris-EDTA缓冲液中制备了系列的10-倍稀释液(5×10⁹、5×10⁷、5×10³和50个内生孢子/mL)，用作流体集成旋转珠磨机中的起始材料。

首先，将400mg无菌的、酸洗涤过的具有150-212μm直径的玻璃珠(SIGMA G1145-100G)引入珠磨机室中。其次，将200μL内生孢子稀释液重悬浮于200μL Tris-EDTA缓冲液1×中，并且经由处理进口转移至珠磨机室内。珠磨机以10,000 RPM转速运行约2分钟。通过珠磨机的机械力破坏孢子时，细菌核酸释放出来。在冷冻存储在-80℃或-20℃时，核酸提取物保持稳定数个月，并且可以冻融数次，而PCR分析灵敏度没有任何显著丢失。

根据制造商的说明，使用来自Takara的PremixExTaq(Probe qPCR)(cat.RR390A)，在来自Applied Biosystems的StepOnePlus^TM实时PCR系统上进行了来自枯草芽孢杆菌内生孢子的DNA的扩增和检测。将1.5μL制备的裂解物直接加入qPCR反应中，所述反应由1×Premix ExTaq(含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP混合物，Mg²⁺和Tli RNaseH)、1×ROX参照染料、0.50μM每种SpoA枯草芽孢杆菌-特异性引物、0.20μM SpoOA探针和0.2mg/ml BSA组成；在最终15μL的体积中。平行地，没有处理的孢子作为未处理对照进行测试(在相同浓度下)。还将1.5μL蒸馏水加入qPCR反应中作为阴性对照。针对最大灵敏度和特异性的最佳循环条件是95℃下初始变性10秒钟，然后由95℃1秒钟和60℃10秒钟组成的两个步骤的五十个循环。在每个延伸循环中通过测量荧光水平来监控扩增。还通过在标准曲线中插入Ct值(产生阳性信号需要的PCR循环的个数)来计算DNA浓度。以下的表1提供了qPCR反应中使用的SpoOA枯草芽孢杆菌特异性引物和探针序列。

表1

图12提供了来自用于枯草芽孢杆菌的DNA提取实验方案的结果的图。基于与枯草芽孢杆菌孢子的起始浓度相比的提取的DNA浓度，显示了结果。结果是每个浓度15次重复的平均。如观察到的，对于每个枯草芽孢杆菌孢子的起始浓度，用流体集成旋转珠磨机裂解的内生孢子产生了比未处理内生孢子高的DNA浓度。

实施例2：从枯草芽孢杆菌营养细胞提取DNA

在这个实例中，首先给珠磨机装载400mg无菌的、酸洗涤过的具有150-212μm直径的玻璃珠(SIGMA G1145-100G)。将处于生长对数中期(O.D550＝0.60-0.70)的枯草芽孢杆菌spizizenii亚种(ATCC 6633)的3mL体积的肉汤培养物离心，并且将沉淀物重新悬浮于Tris-EDTA缓冲液中，以获得5×10⁸CFU/mL的最终枯草芽孢杆菌浓度。在Tris-EDTA缓冲液中制备了连续的10-倍稀释液(5×10⁸、5×10⁶、5×10⁴、5×10²和5CFU/mL)。将200μL营养细胞稀释液重悬浮于200μL Tris-EDTA缓冲液1×中，并且将最终混合物通过处理进口转移至珠磨机设备。珠磨机以10,000RPM的转速运行约2分钟。

根据制造商的说明，使用来自Takara的PremixExTaq(Probe qPCR)(cat.RR390A)，在来自Applied Biosystems的StepOnePlus^TM实时PCR系统上进行了来自枯草芽孢杆菌植物细胞的强化DNA的扩增和检测。将1.5μL制备的裂解物直接加入qPCR反应中，所述反应由1×Premix Ex Taq(含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP混合物，Mg2+和TliRNaseH)、1×ROX参照染料、0.50μM每种SpoA枯草芽孢杆菌-特异性引物、0.20μM SpoOA探针(见实施例的表1)和0.2mg/ml BSA组成；在最终15μL的体积中。平行地，没有处理的营养细胞作为未处理对照进行测试(在相同浓度下)。还将1.5μL蒸馏水加入qPCR反应中作为阴性对照。针对最大灵敏度和特异性的最佳循环条件是95℃下初始变性10秒钟，然后由95℃1秒钟和60℃10秒钟组成的两个步骤的五十个循环。在每个延伸循环中通过测量荧光水平来监控扩增。还通过在标准曲线中插入Ct值来计算DNA浓度。

图13提供了来自用于枯草芽孢杆菌营养细胞的DNA提取实验方案的结果的图。基于与细胞起始浓度相比的提取的DNA浓度，显示了结果。结果是每个浓度15次重复的平均。来自使用流体集成旋转珠磨机的枯草芽孢杆菌植物细胞的裂解物的检测大约为50至500CFU/mL(10-100CFU/反应)。在高达5.0×10⁴ CFU/ml浓度的未处理枯草芽孢杆菌营养细胞下没有观察到扩增信号。

实施例3：针对枯草芽孢杆菌营养细胞的DNA收集比较

在这个实施例中，使用Norgen RNA/DNA/蛋白质纯化试剂盒从枯草芽孢杆菌spizizenii亚种(ATCC 6633)提取DNA对照。对于每个样品，在800μL缓冲液中强化(spiked)1.6ng DNA，所述缓冲液还包括螯合剂(Tris-EDTA缓冲液1×，从SIGMA Tris-EFTA缓冲液100×浓缩物制得)。

平行地，对以基本上相同的方式并且使用珠磨机制得的枯草芽孢杆菌营养细胞进行裂解实验方案，所述珠磨机具有与之前实施例中所述的基本上相同的玻璃珠。珠磨机在20,000RPM转速下运行约3分钟，以裂解样品。

在这个实施例中，根据制造商的说明，使用来自Takara的PremixExTaq(Probe qPCR)(cat.RR390A)，在来自Appl ied Biosystems的StepOnePlus^TM实时PCR系统上进行了强化DNA的扩增和检测。将1.5μL制备的裂解物直接加入qPCR反应中，所述反应由1×Premix Ex Taq(含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP混合物，Mg²⁺和Tli RNaseH)、1×ROX参照染料、0.50μM每种SpoA枯草芽孢杆菌-特异性引物、0.20μM SpoOA探针(参见表1，实施例1)和0.2mg/ml BSA组成；在最终15μL的体积中。平行地，没有处理的DNA作为阳性对照进行测试(在相同浓度下)。还将1.5μL蒸馏水加入qPCR反应中作为阴性对照。

表2提供了从珠磨机裂解收集的DNA浓度vs.阳性对照的结果。阴性对照样品显示出不存在DNA。还针对两种裂解方法给出了Ct值。图14说明了使用珠磨机收集的平均DNA与阳性对照相比的图。用流体集成旋转珠磨机的机械裂解后的DNA收集与阳性对照相当(差异为约7.6％)。在流体集成旋转珠磨机处理后，没有观察到DNA降解。

表2

实施例4：从枯草芽孢杆菌提取DNA和RNA

该实例实验显示出可以使用流体集成旋转珠磨机，从细菌细胞提取适用于cDNA合成和通过RT-qPCR扩增的RNA。将处于生长对数中期(O.D550＝0.60-0.70)的枯草芽孢杆菌spizizenii亚种(ATCC 6633)的3mL体积的肉汤培养物离心，并且将沉淀物重新悬浮于Tris-EDTA缓冲液中，以获得1.5×10⁸CFU/mL的最终枯草芽孢杆菌浓度。在Tris-EDTA缓冲液中制备了5×10⁴的稀释液，以用作流体集成旋转珠磨机中的起始材料。

用基本上与之前实施例中所述的相同玻璃珠来准备珠磨机，并且装载重悬浮于200μL Tris-EDTA缓冲液1×中的200μL营养细胞稀释液。珠磨机在20,000RPM转速下运行约3分钟，以裂解样品。

在该实施例中，用来自Norgen(RNA/DNA/蛋白质纯化试剂盒)和Fermentas(GeneJET病毒DNA/RNA纯化试剂盒)的两种不同的商业纯化试剂盒进行了枯草芽孢杆菌裂解物的纯化。根据制造商的说明，使用来自Takara的PremixScript^TM RT-PCR试剂盒(Perfect Real Time)(cat.RR064A)，在来自Applied Biosystems的StepOnePlus^TM实时PCR系统上进行了来自枯草芽孢杆菌营养细胞的RNA和DNA的扩增和检测。将2.0μL制备的裂解物直接加入两个RT-qPCR混合物中，含有或不含逆转录酶(PrimeScript RT酶混合物I I)，以检测RNA和DNA。最终混合物由1×One Step RT-PCR缓冲液I I I(包括dNTP混合物，Mg²⁺)、0.1U/μLTaKaRa exTaq HS、1×PrimeScript RT酶混合物II(在RT+混合物中)、1×ROX参照染料、0.38μM每种SpoA枯草芽孢杆菌-特异性引物和0.15μM SpoOA探针组成(参见实施例1的表1)；在最终20μL的体积中。平行地，没有处理的营养细胞作为未处理对照进行测试(在相同浓度下)。还将2.0μL蒸馏水加入RT-qPCR(±RT酶)反应中作为阴性对照。用于逆转录(cDNA合成)的头一个步骤是42℃5min。针对最大灵敏度和特异性的最佳循环条件是95℃下初始变性10秒钟，然后由95℃1秒钟和60℃10秒钟组成的两个步骤的四十个循环。在每个延伸循环中通过测量荧光水平来监控扩增。还通过在相应的标准曲线中插入Ct值来计算DNA和RNA浓度。

图15显示了在不同测试条件下的RNA和DNA收集平均浓度(ng/μL)的图示：来自流体集成旋转珠磨机后的NA裂解物，来自流体集成旋转珠磨机并用Norgen纯化试剂盒纯化后的NA裂解物，来自流体集成旋转珠磨机并用Fermentas纯化试剂盒纯化后的NA裂解物和来自未处理的枯草芽孢杆菌重悬浮液。结果是每个浓度15次重复的平均。就DNA和RNA浓度而言的核酸收集，与未处理条件相比，在用流体集成旋转珠磨机机械裂解后提高，尤其是关于RNA收集。核酸纯化后，由于膜纯化过程，％NA收集降低(25-30％vs.未纯化条件)。

实施例5：枯草芽孢杆菌营养细胞的RNA收集比较

在这个实施例中，使用Norgen RNA/DNA/蛋白质纯化试剂盒，从枯草芽孢杆菌spizizenii亚种(ATCC 6633)营养细胞提取RNA对照。对于每个样品，在800μL缓冲液中强化9.00ng RNA，所述缓冲液还包括螯合剂(Tris-EDTA缓冲液1×，核酸酶来自SIGMA)。

在这个实施例中，根据制造商的说明，使用来自Takara的PremixScript^TM RT-PCR试剂盒(Perfect Real Time)(cat.RR064A)，在来自Appl ied Biosystems的StepOnePlus^TM实时PCR系统上进行了强化RNA的扩增和检测。将2.0μL制备的裂解物直接加入RT-qPCR反应中，所述反应由1×One Step RT-PCR缓冲液III(包括dNTP混合物，Mg²⁺)、0.1U/μL TaKaRa exTaq HS、1×PrimeScript RT酶混合物II、1×ROX参照染料、0.38μM每种SpoA枯草芽孢杆菌-特异性引物和0.15μM SpoOA探针组成(参见实施例1的表1)；在最终20μL的体积中。平行地，没有处理的RNA作为阳性对照进行测试(在相同浓度下)。还将2.0μL蒸馏水加入RT-qPCR反应中作为阴性对照。

表3提供了从珠磨机裂解收集的RNA浓度vs.阳性对照的结果。阴性对照样品显示出不存在RNA。还针对两种裂解方法给出了Ct值(产生阳性信号需要的PCR循环数)。图16说明了使用珠磨机收集的平均RNA与阳性对照相比的图。用流体集成旋转珠磨机的机械裂解后的RNA收集与阳性对照相当(差异为约5.3％)。在流体集成旋转珠磨机处理后，没有观察到RNA降解。

表2

实施例6：RNA完整性分析

在这个实施例中，Agilent生物分析仪和相关的试剂盒提供了特别有效的用于评价总RNA完整性的方法。Agilent 2100生物分析仪是基于多流体的平台，用于DNA、RNA、蛋白质和细胞的分级、定量和质量控制。其可以用于通过观察原核生物的16S和23S核糖体峰及其比例来考虑总RNA质量。23S:16S峰下的面积比是RNA纯度的测量，并且其应当落入1.5-2.0的范围中。

将来自未处理RNA和流体集成旋转珠磨机核酸裂解物的RNA样品(1μL)在Agilent 2100生物分析仪上运行，使用Agilent RNA 6000 Pico试剂盒(cat#5067-1513)和Agilent RNA 6000 Nano试剂盒(cat#5067-1511)，用于分析总RNA(真核生物和原核生物)和mRNA样品。图16A提供了针对未处理RNA对照(参照)的生物分析仪rRNA谱，而图16B和16C提供了针对用旋转珠磨机裂解的两种不同样品的生物分析仪rRNA谱。如所观察到的，在流体集成旋转珠磨机中处理的两种实例核酸样品的rRNA比在规格(1.5-2.0)内，意味着RNA完整性是正确的。来自珠磨机样品的23S和16S峰明显小于对照样品。这是因为裂解物是RNA和DNA的混合物，并且珠磨机样品中DNA的存在影响了Agi lent生物分析仪电泳图谱分辨率。

之前特定实施方案和实施例的描述将如此全面地展现了本发明的一般性质，为了适用于各种应用，其他人通过应用本领域技术人员的知识可以容易地改变和/或调整这样的特定实施方案，而不需要过度的实验，没有脱离本发明的一般原理。因此，基于本文中呈现的教导和指导，确定这样的调整和改变在所公开的实施方案的等级含义和范围内。理解本文中的措词或术语是用于描述的目的，并非限制，使得本说明书的术语或措词由本领域技术人员根据教导和指导来解释。

以上已经借助功能性构件模块描述了本发明的实施方案，所述构件模块说明了特定功能的执行及其关联。为了描述的方便性，本文中随意地限定了这些功能性构件模块的边界。可以限定可替换的边界，只要合适地进行特定的功能及其关联。

概述和摘要部分列出了发明人考虑的本发明的一个或多个但非全部的实例实施方案，并且因此，不是打算以任何方式来限制本发明和所附权利要求。

本发明的宽度和范围不应当受到上述任一个示例性实施方案的限制，而只应当根据以下权利要求及其等价物来限制。

Claims

1.一种用于样品的匀化和裂解中的至少一种的系统，其包括：

一个或多个壁，其形成具有进口和多个流体连接的密闭室；

连接多个流体连接中的至少一个的第一流体网络，并且配置成将至少样品从至少一个第一存储器引入室中；

连接多个流体连接中的至少一个的第二流体网络，并且配置成将至少样品从室中排入至少一个第二存储器中；

室内的旋转元件；和

连接旋转元件并且配置成使旋转元件围绕沿着旋转元件长度延伸的轴旋转的致动器。

2.权利要求1的系统，其中一个或多个壁形成基本上是圆柱形的密闭室。

3.权利要求1的系统，其中一个或多个壁形成具有矩形横截面的密闭室。

4.权利要求1的系统，其中进口配置成从外部环境引入固体、半固体或液体样品。

5.权利要求1的系统，其中进口位于密闭室的顶部。

6.权利要求1的系统，其中进口位于密闭室的侧面。

7.权利要求1的系统，进一步包括配置成盖在进口上并且防止渗漏的盖子。

8.权利要求1的系统，其中第一流体网络或第二流体网络的至少一部分配置成使室加压或减压。

9.权利要求1的系统，进一步包括连接密闭室并且配置成使室加压或减压的第三流体网络。

10.权利要求1的系统，进一步包括多个放置在室内的珠子。

11.权利要求10的系统，其中多个珠子包括选自塑料、玻璃、陶瓷和二氧化硅的材料。

12.权利要求10的系统，其中多个珠子的直径范围为1微米至大约3000微米。

13.权利要求10的系统，其中旋转元件配置成激发多个珠子。

14.权利要求1的系统，其中致动器通过插接机械可拆卸地连接旋转元件。

15.权利要求14的系统，进一步包括基本上放置在插接机械并且配置成防止渗滤的支持物。

16.权利要求1的系统，进一步包括放置在密闭室侧面的空腔，使得相对空腔放置的加热表面实质性地使密闭室内的温度升高。

17.权利要求1的系统，其中密闭室的一个或多个壁的至少一个包括热控制表面。

18.一种用于进行分子测试的系统，其包括：

外壳，其包括：

一个或多个流体室；和

将至少一个或多个流体室连接至可移动中央室的流体网络；

放置在外壳内的珠磨机，其包括：

一个或多个壁，其形成具有进口和多个流体连接的密闭室，其至少一部分连接流体网络，和

放置在密闭室内的旋转元件；和

19.权利要求18的系统，其中一个或多个壁形成基本上圆柱形的密闭室。

20.权利要求18的系统，其中一个或多个壁形成具有矩形横截面的密闭室。

21.权利要求18的系统，其中进口配置成从外部环境引入固体、半固体或液体样品。

22.权利要求18的系统，其中进口位于密闭室的顶部。

23.权利要求18的系统，其中进口位于密闭室的侧面。

24.权利要求18的系统，进一步包括配置成盖在进口上并且防止渗漏的盖子。

25.权利要求18的系统，其中流体网络的至少一部分配置成使室加压或减压。

26.权利要求18的系统，进一步包括多个放置在室内的珠子。

27.权利要求26的系统，其中多个珠子包括选自塑料、玻璃、陶瓷和二氧化硅的材料。

28.权利要求26的系统，其中多个珠子的直径范围为1微米至大约3000微米。

29.权利要求26的系统，其中旋转元件配置成激发多个珠子。

30.权利要求18的系统，其中致动器通过插接机械可拆卸地连接旋转元件。

31.权利要求30的系统，其中珠磨机进一步包括基本上放置在插接机械处并且配置成防止渗滤的支持物。

32.权利要求18的系统，进一步包括放置在密闭室侧面的空腔，使得相对空腔放置的加热表面实质性地使密闭室内的温度升高。

33.权利要求18的系统，其中密闭室的一个或多个壁的至少一个包括热控制表面。

34.一种用于裂解样品的方法，其包括：

将至少样品经由连接流体网络的流体连接引入密闭室中，所述流体网络进一步连接一个或多个其他室；

沿着轴旋转放置在密闭室内的旋转元件，所述轴是沿着旋转元件长度延伸的；和

在密闭室内经由旋转元件的移动来裂解样品。

35.权利要求34的方法，进一步包括经由连接流体网络的另一个流体连接从密闭室排出至少样品。

36.权利要求34的方法，进一步包括经由流体网络使密闭室加压或减压。

37.权利要求34的方法，进一步包括经由插接机械连接致动器到旋转元件。

38.权利要求34的方法，进一步包括将至少样品经由进口引入密闭室中，所述进口配置成从外部环境引入样品。

39.权利要求38的方法，其中经由进口引入至少样品包括引入固体、半固体或液体样品。

40.权利要求34的方法，进一步包括经由放置在密闭室侧面上的空腔加热样品。

41.一种用于裂解样品的方法，其包括：

沿着轴旋转放置在密闭室内的旋转元件，所述轴是沿着旋转元件长度延伸的；

通过旋转元件的移动激发放置在密闭室内的多个珠子；和

在密闭室内经由旋转元件和多个珠子的移动来裂解样品。

42.权利要求41的方法，进一步包括经由连接流体网络的另一个流体连接从密闭室排出至少样品。

43.权利要求41的方法，进一步包括经由流体网络使密闭室加压或减压。

44.权利要求41的方法，进一步包括经由插接机械连接致动器到旋转元件。

45.权利要求41的方法，进一步包括将至少样品经由进口引入密闭室中，所述进口配置成从外部环境引入样品。

46.权利要求45的方法，其中经由进口引入至少样品包括引入固体、半固体或液体样品。

47.权利要求41的方法，进一步包括经由放置在密闭室侧面上的空腔加热样品。

48.一种用于匀化样品的方法，其包括：

在密闭室内经由旋转元件的移动来裂解样品。

49.权利要求48的方法，进一步包括经由连接流体网络的另一个流体连接从密闭室排出至少样品。

50.权利要求48的方法，进一步包括经由流体网络使密闭室加压或减压。

51.权利要求48的方法，进一步包括经由插接机械连接致动器到旋转元件。

52.权利要求48的方法，进一步包括将至少样品经由进口引入密闭室中，所述进口配置成从外部环境引入样品。

53.权利要求52的方法，其中经由进口引入至少样品包括引入固体、半固体或液体样品。

54.权利要求48的方法，进一步包括经由放置在密闭室侧面上的空腔加热样品。

55.一种用于裂解样品的方法，其包括：

通过旋转元件的移动激发放置在密闭室内的多个珠子；和

在密闭室内经由旋转元件和多个珠子的移动来裂解样品。

56.权利要求55的方法，进一步包括经由连接流体网络的另一个流体连接从密闭室排出至少样品。

57.权利要求55的方法，进一步包括经由流体网络使密闭室加压或减压。

58.权利要求55的方法，进一步包括经由插接机械连接致动器到旋转元件。

59.权利要求55的方法，进一步包括将至少样品经由进口引入密闭室中，所述进口配置成从外部环境引入样品。

60.权利要求59的方法，其中经由进口引入至少样品包括引入固体、半固体或液体样品。

61.权利要求55的方法，进一步包括经由放置在密闭室侧面上的空腔加热样品。