CN104694455B - 一种甜菜花粉萌发的培养方法 - Google Patents

Abstract

一种甜菜花粉萌发的培养方法，它涉及一种高效提高甜菜花粉萌发率的培养方式及培养条件。本发明要解决甜菜花粉液体培养基直接培养萌发率低，载玻片琼脂糖固体培养操作繁琐、未开裂化药内花粉点样不易操作的技术问题。操作方法为：以滤纸为花粉附着载体，置于Effendorff离心管中，微量培养液浸润后盖上离心管盖，放入遮光袋或盒中进行避光培养。本发明方法改变了甜菜花粉萌发离体培养方式，提高了甜菜花粉离体培养萌发率；本发明方法易操作，培养条件及方式易于控制可在田间直接进行取样培养；成本低、培养时间短，在甜菜花粉活力鉴定及甜菜杂交育种生产中具有广泛的应用前景。

Description

一种甜菜花粉萌发的培养方法

技术领域

本发明涉及甜菜杂交育种与生物技术领域，具体的说，涉及一种甜菜花粉萌发的培养方法。

背景技术

栽培甜菜包括叶用甜糖(leafbeet)，饲料甜菜(fodder beet)，食用甜菜(gardenbeet)以及糖用甜菜(sugar beet)，在农业、食品、医药具有广泛的应用。甜菜属于典型的异花授粉自交不亲和作物，杂交育种是繁殖后代及选育新品种的主要方法。甜菜花粉萌发培养为甜菜杂交、人工辅助授粉提供生命力较强的花粉，同时也为大批量植株花粉萌发活力以及育性的快速鉴定提供了一种有效途径。

甜菜花粉萌发率不但与品种类型、取花药的部位、花粉的成熟程度、取花粉时期有关还受花粉培养的方法及条件的限制。

目前实验室常用的发粉萌发培养主要包括液体培养法和琼脂固体培养基培养法2种方法。液体培养法是把花粉洒在载玻片或平皿中液体培养基直接进行花粉萌发培养。琼脂固体培养基培养法是将融化的琼脂培养基铺在载玻片上，待琼脂凝固后接种花粉,放在浸水的滤纸或纱布培养皿中培养箱中培养。液体直接培养法由于吸水过多，水合过度的花粉萌发率不高；琼脂固体培养基培养法前期琼脂培养基的配制及铺片繁琐费时，均匀平铺点样花粉不容易操作，为保证培养湿度需在平皿等容器中培养；以上两种方法均需将样品从田间取回在试验室中进行操作。

发明内容

本发明的目的是为了解决甜菜花粉液体培养基直接培养萌发率低，载玻片琼脂糖固体培养操作繁琐、未开裂化药内花粉点样不易操作的技术问题。通过改善甜菜花粉萌发离体培养条件，提高花粉离体培养萌发率，提供一种高效、操作简单的甜菜花粉萌发培养的方法。

本发明为了弥补以上方法的不足，发明了新的一种花粉培养方法，以滤纸代替凝固琼脂做为花粉附着载体，置于Effendorff离心管中，微量培养液浸润后盖上塑料管盖进行培养，既保证花粉培养所需的湿度又防止过度水合。本发明方法易操作，培养条件及方式易于控制可在田间直接进行取样培养；成本低、培养时间短，萌发率高，在甜菜花粉活力鉴定及甜菜杂交育种生产中具有广泛的应用前景。本发明为实现异花授粉，开展杂交育种研究工作提供基础，找到一种诱导甜菜花粉高效明发的培养方法。

本发明的一种甜菜花粉萌发的培养发法，它包含以下步骤：取甜菜花粉，以滤纸为花粉培养载体，将附着有花粉的滤纸置于离心管中，然后倒入培养液浸润花粉后盖上离心管盖，再置于遮光袋或盒中，在温度为23℃～30℃的条件下进行培养5～24h，即完成所述的甜菜花粉萌发的培养。

花粉萌发是植物受精的先决条件，它决定着胚及胚乳的形成，种子的质量,并对后代植物体的生长发育有重要的影响。因此，甜菜花粉的人工发芽培养，不仅仅是植物生理学研究的问题，也是甜菜育种中自交不亲合性及甜菜属种间杂交不亲和性研究的重要课题。

本发明的关键是找到了简易的甜菜花粉萌发培养方法，微量培养液浸润滤纸代替凝固琼脂，作为花粉附着载体，盖盖试管中进行花粉萌发培养。该发明是在多年的甜菜花粉培养及对花粉活力测定基础上，培养基以5～35％的蔗糖、0～0.1％的硼酸和0.01％的硝酸钙基本培养基组分，设置培养温度为10～30℃，培养基pH值为4.0～8.0，通过对萌发率(花粉萌发数/花粉总数)和花粉管长度指标进行测定分析，筛选出适宜花粉萌发的培养液及培养条件，首次建立了甜菜游离花粉萌发培养方法，花粉萌发率均明显高于已有方法。

本发明所述的一种甜菜花粉萌发的培养方法，通过实施可达到以下有益效果：

1、本发明解决了琼脂固体培养基培养法前期琼脂培养基的配制及铺片繁琐费时，均匀平铺点样花粉不容易操作的技术问题，培养时间短，萌发率高；

2、操作方法简单易行，培养液配制简单，培养条件及方式易于控制，可在田间直接进行取样培养，便于批量测定田间植株的花粉萌发活力；

3、滤纸代替琼脂粉，廉价的Effendorff塑料离心代替载玻片和培养皿，成本低，培养液成分简单，价格便宜，在进行大量的花粉萌发培养具有较优的综合效果；

4、本发明解决了甜菜花粉在直接的液体培养基上萌发率低和花粉管生长缓慢的技术问题，可为甜菜人工授粉技术研发奠定基础。

本发明方法改善了甜菜花粉萌发离体培养条件，提高了甜菜花粉离体培养萌发率；本发明方法易操作，培养条件及方式易于控制可在田间直接进行取样培养；成本低、培养时间短，解决花粉萌发率低，花粉管较短和不易授粉受精的问题，在甜菜花粉活力鉴定及甜菜杂交育种生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明方法培养的花粉萌发图片。

具体实施方式

具体实施方式一：一种甜菜花粉萌发的培养发法，它包含以下步骤：取甜菜花粉，以滤纸为花粉培养载体，将附着有花粉的滤纸置于离心管中，然后倒入培养液浸润花粉后，再置于遮光袋或盒中，在温度为23℃～30℃的条件下进行培养5～24h，即完成所述的甜菜花粉萌发的培养。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：滤纸剪成上宽下窄梯形形状纸条。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：滤纸条的面积为离心管侧壁面积的1/3。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：将附着有花粉的滤纸置于离心管中是指：离心管底部留有高度为0.8mm～1.5mm的未被滤纸覆盖的空间。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：花粉是指未开裂花药花粉囊内花粉以及花药开裂时的花粉。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：培养液是由10％～30％蔗糖、0.05％～0.01％硼酸、0.01％硝酸钙和余量的水组成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：培养液的pH为5.5～6.5。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：培养温度为25℃～28℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：培养条件为避光培养。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：所述的甜菜是指甜菜(Beta)属内的所有种和亚种，包括栽培甜菜和野生甜菜，其中栽培甜菜包括叶用甜糖(leafbeet)、饲料甜菜(fodder beet)、食用甜菜(garden beet)以及糖用甜菜(sugarbeet)。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一

1、滤纸试管培养法进行发粉萌发培养试验(采用本发明的方法进行操作)

①、滤纸剪成上宽下窄梯形形状纸条，面积为Effendorff离心管侧壁面积的1/3；

②、将滤纸置入Effendorff离心管侧壁，管底部留有高度为1.0mm～1.5mm的空间，盖盖备用；

③、随机选取甜菜授粉系花药刚开裂的新鲜花粉附着于滤纸条中间位置，吸取培养液50～100ul从滤纸边缘浸润滤纸，直至全部浸湿，盖上Effendorff离心管盖；

④、将装有花粉滤纸的Effendorff离心管放入牛皮纸袋或非透明盒中进行避光培养；

⑤、培养完毕，打开管盖，吸取200-500ul培养液反复冲洗滤纸中间部位，使培养的花粉进入离心管底部空间；

⑥、吸取离心管底部空间的花粉培养液放入载玻片，显微镜下观察花粉萌发率(花粉萌发数/花粉总数)和花粉管长度；

以0.01％硝酸钙培养基成分为基础，通过调整蔗糖(0～35％)、硼酸(0～0.1％)的浓度以及pH并进行配比实验，筛选出甜菜花粉萌发的适宜培养液，适宜培养液为质量比蔗糖10～30％、硼酸0.005～0.01％和硝酸钙0.01％组成，pH值为5.3～6.5；使用15％蔗糖+0.01％硼酸+0.01％硝酸钙的培养液(pH＝5.5)培养花药刚开裂时的新鲜花粉，其萌发率最高达90.4％±2.5，培养24h，某些花粉管伸长最长达1320μm，如图1所示；

在20℃～35℃不同温度按上述方法进行花粉萌发试验，结果显示培养温度为23℃～30℃，均适合花粉萌发培养，随温度升高，花粉萌发时间缩短，温度28℃，成熟花粉培养30分钟即观察到花粉管出现。

实施例二

2、载玻片液体直接培养法进行甜菜花粉培养及观察

①配制培养液：培养液包含质量百分含量为15％蔗糖、质量百分含量为0.01％硼酸、质量百分含量为0.01％硝酸钙和余量的水；培养液pH＝5.5，移液器吸取培养液置入载玻片凹槽内；

②随机选取甜菜花枝上的花蕾取新鲜花粉，洒在载玻片凹槽内的液体培养基上，盖上载玻片，培养箱中进行培养24h；

③以单枚接种培养载玻片为重复，每个处理重复3次，每次检测10个视野，以花粉管萌发作为标志，显微镜下观察花粉萌发率(花粉萌发数/花粉总数)，记录最高数。

实施例三

3、琼脂固体培养基培养法进行甜菜花粉培养及观察

①配制培养基：包含质量百分含量为15％蔗糖、质量百分含量为0.01％硼酸、质量百分含量为0.01％硝酸钙、质量百分含量为1％琼脂粉和余量的水；培养基pH＝5.5，加热使培养基中的琼脂粉融化，吸取培养基平铺在载玻片上，待培养基凝固后备用；

②接种环随机选取甜菜花枝上的花蕾取新鲜花粉，均匀平铺在载玻片琼脂固体培养基上，放在浸水的滤纸或纱布平皿中培养箱中进行培养24h；

③以单枚接种培养载玻片为重复，每个处理重复3次，每次检测10个视野，以花粉管萌发作为标志，显微镜下观察花粉萌发率(花粉萌发数/花粉总数)，记录最高数。

4、实施例一至三的花粉萌发培养方法对比试验

三种培养方法分别随机选取甜菜新鲜花粉进行花粉萌发的试验，培养24h，显微镜下观测花粉萌发率及花粉管长度，结果见表1所示。实施例一的滤纸离心管培养方法花粉萌发率显著高于其它2种方法，最高达90.4％±2.5，而液体直接培养法及琼脂固体培养法花粉萌发率最高分别为78.1％±1.8、80.3％±1.1；实施例一方法花粉管的伸长长度明显高于其它2种方法。

表1 三种培养方法的花粉萌发率及花粉管长度

Claims (3)

1.一种甜菜花粉萌发的培养方法，其特征在于它包含以下步骤：取甜菜花粉，以滤纸为花粉培养载体，将附着有花粉的滤纸置于离心管中，然后倒入培养液浸润花粉后盖上离心管盖，再置于遮光袋或盒中，在温度为23℃～30℃的条件下进行培养5～24h，即完成所述的甜菜花粉萌发的培养；所述的滤纸剪成上宽下窄梯形形状纸条，面积为Effendorff离心管侧壁面积的1/3，将滤纸置入Effendorff离心管侧壁，管底部留有高度为1.0mm～1.5mm的空间；其中，甜菜花粉培养是使用15％蔗糖+0.01％硼酸+0.01％硝酸钙的培养液培养花药刚开裂时的新鲜花粉，所述培养液pH＝5.5。

2.根据权利要求1所述的一种甜菜花粉萌发的培养方法，其特征在于培养温度为25℃～28℃。

3.根据权利要求1所述的一种甜菜花粉萌发的培养方法，其特征在于所述的甜菜是指甜菜(Beta)属内的所有种和亚种，包括栽培甜菜和野生甜菜，其中栽培甜菜包括叶用甜菜(leaf beet)、饲料甜菜(fodder beet)、食用甜菜(garden beet)以及糖用甜菜(sugarbeet)。