CN104694418A - 一株具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株及其应用 - Google Patents

一株具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有低β-半乳糖酶活性的保加利亚乳杆菌及其应用，所述的保加利亚乳杆菌分类命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，微生物保藏号为CGMCC No.9957。该菌株是从传统乳制品中分离的保加利亚乳杆菌中筛选出的菌株，性能较为稳定，不会像突变菌株一样因传代次数过多导致不稳定，并且其所具有的弱后酸化能力也可一直保持，因而在实际应用中可有效延缓酸奶在储藏期间的后酸化，延长货架期。并且该菌株发酵特性优良，可作为弱后酸化的酸奶发酵剂用于工业化。

Description

一株具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株筛选得到的具有低β-半乳糖酶活性的保加利亚乳杆菌菌株，以及该菌株在发酵工业中的应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
发酵乳制品中的益生菌不仅可以改善食品的品质，其自身也为人体提供改善肠道功能、促进物质吸收等有益作用。酸奶是最为普遍的一种利用乳酸菌发酵的乳制品，其主要以德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌为发酵剂，在42℃下发酵至pH4.5，低温下储存，运输和销售。在发酵后和食用前的过程中，乳酸菌仍能继续繁殖和发酵乳糖产生乳酸，使pH值进一步下降，产生人们无法接受的过酸味，同时因为酸度过高使菌体大量死亡，活菌数目较少，降低益生作用，这就是后酸化。
要控制酸奶的后酸化，关键在于既要保持酸奶中乳酸菌的活性，又要降低乳酸菌在低温贮存过程中的产酸能力。目前国内外对于控制酸奶后酸化的研究有很多，主要如下：(1)发酵后快速冷却和低温贮藏，这两种方法已得到广泛的认同，一定程度上解决了工厂实际生产中酸奶的后酸化问题，其中发酵后快速冷却是为了使菌株的生长受到抑制，活力迅速下降，产酸降低，从而减缓酸奶后酸化，低温贮藏也是同样的道理，这是保证酸奶弱后酸化的关键因素之一；(2)采用超高温杀菌和巴氏杀菌等技术，发酵成熟的酸奶，对成品进行热处理，但杀菌后的酸奶因不含有活菌，而不符合国际乳品联合会(IDF)制定的发酵乳制品中需含106cfu·mL-1活菌数的要求，同时《中华人民共和国行业标准》乳酸饮料中也规定：乳酸菌发酵制成的酸奶饮料中，活菌数量应达到105-106cfu·mL-1，这样的乳酸菌制品才对人体具有生理保健功能，所以我们几乎并不采用此方法控制酸奶制品的后酸化；(3)调整发酵剂中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的比例，适当加大酸奶发酵剂中球菌对杆菌的比例可在一定程度上延长酸奶的保质期。酸奶在发酵前期，嗜热链球菌快速生长，当pH值下降到5.5左右时，保加利亚乳杆菌生长加速，嗜热链球菌的生长减缓，当pH值下降到5.0左右时，此时保加利亚乳杆菌成为了酸奶发酵的主要菌株，当pH 值降至4.6左右时，由于酪蛋白的凝聚，此时凝乳开始形成，接着转入低温贮藏，此后主要都是保加利亚乳杆菌代谢乳糖产酸，导致pH值继续降低，直至降到3.5左右，pH的降低增加了菌体细胞膜的通透性，影响了菌体内的pH，从而抑制了乳糖酶的活性，在介质pH为4.0-4.5时，其细胞内的pH还能维持在近中性附近，代谢酶的活力不受到影响，当介质的pH降至3.5时，菌体细胞内的新陈代谢才受到抑制。Torriani等调整了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例，认为当杆菌和球菌的比例为1：1.5时为最优的发酵条件，可很好的延长酸奶的保质期；(4)筛选低温下产酸弱的野生菌株，控制酸乳后酸化的最好方法是选育性状优良的保加利亚乳杆菌作为发酵剂菌株，为了克服酸奶在贮存期间的后酸化问题，Mollet和他的雀巢团队分离并坚定了由IS调控的β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，其在乳环境中不能正常代谢乳糖产生乳酸，从而有效的降低酸奶后酸化，而Ongol也认为自然环境中存在天然的H+-ATPase缺陷型的保加利亚乳杆菌，一旦筛选出这种自发突变菌株，就可以从根本上解决酸奶的后酸化问题，这样的菌株性状稳定，操作上简单，而且大大节省成本，对于降低酸乳后酸化意义重大；(5)筛选β-半乳糖苷酶活性弱的菌株，由于酸奶的后酸化主要是由于保加利亚乳杆菌在低温贮存下继续发酵乳糖导致酸度增加造成的，因此我们可以通过减弱保加利亚乳杆菌对乳糖的代谢强度来降低酸奶的后酸化。例如有学者通过诱变β-半乳糖苷酶基因，使该酶在40℃发酵时具有较强活性，但在贮藏期活性减弱甚至失去活性；也有学者通过令β-半乳糖苷酶基因缺失和灵气下游基因缺失或对编码β-半乳糖苷酶基因序列进行无意义突变的方法筛选弱后酸化突变菌株；(6)筛选H+-ATPase活性弱的菌株，国内一度热衷于运用人工诱变育种技术生产高温下正常产酸，低温产酸能力受抑制的菌株作发酵剂，如车黎锰分别利用紫外诱变和化学试剂(0.9mg/mL的亚硝基胍)对保加利亚乳杆菌进行诱变处理，并通过青霉素浓缩处理，筛选出的突变株在12℃贮存过程中明显的推迟了后酸化，但目前不能确定这个突变株是否为H+-ATPase缺陷型菌株；(7)添加外来物质控制酸奶后酸化，有学者将羧甲基纤维素(CMC)和不同稳定剂添加到酸奶制品中来提高酸奶的稳定性，使酸奶的保质期延长10d以上，也有学者通过改变乳酸菌实际所能利用的水分量，来限制菌株的产酸和生长能力，我们都知道为了保证酸奶的甜度，在鲜奶发酵前期，通常要加入少量的蔗糖、葡萄糖，由于添加了外来物质，使乳酸菌所能利用的水分活度值发生了改变，同时水分活度值的变化也影响着球菌和杆菌的比例，从而进一步降低酸奶的后酸化；(8)改变细胞膜的通透性，研究发 现，变形链球菌在低pH环境中生存时，细胞膜中的单不饱和脂肪酸和长链脂肪酸会增多，这样降低细胞膜对质子的通透性，从而抑制质子进入细胞，增强耐酸性，介质的pH值对乳酸菌细胞的新陈代谢有间接影响，菌株细胞质的pH值对新陈代谢活动有直接影响，在酸奶发酵过程中由于周围介质的pH值不断下降，菌株的细胞膜受到侵害，通透性改变影响了菌体介质酸碱度，抑制了菌株的正常代谢，发酵成熟的酸奶，通过改变乳酸菌细胞膜通透性，使胞外的抑制物质渗透到菌体内，抑制了乳酸菌的正常生长，从而降低了后酸化的程度；(9)添加细菌素来控制酸奶后酸化，近年来，将乳酸链球菌素、丙酸杆菌所产的丙酸杆菌素、短杆菌分泌的短杆菌素应用到酸奶制作中，成功地抑制了酸奶的后酸化，其中詹氏杆菌素，是一种热稳定的丙酸菌属的细菌素，在生产过程中与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌同时添加，可抑制这两种菌的生长和产酸，尤其是保加利亚乳杆菌，十分敏感，添加了詹氏杆菌素的酸奶可以在5℃贮存30d的情况下pH仍维持在4.15-4.42之间。
虽然众多研究者对控制酸奶后酸化的方法进行深入地探讨，但这些方法中多多少少存在一些弊端：如添加防腐剂和稳定剂虽在一定程度上防止微生物污染，改善了酸奶的组织状态，但并没有解决酸奶酸味过重的问题，造成了生产成本增加；还有一点就是Nisin在食品中特别在固体食品中分散性不好，且是在加工后期加入，易带来污染；诱变育种菌和基因工程菌的表达专一性和稳定性还存在隐患。
Benedi等人经过研究发现，乳酸菌分解乳糖代谢为半乳糖和葡萄糖这一步骤是整个乳糖代谢的限速步骤，而β-半乳糖苷酶是酸奶在发酵结束后贮存过程中引起后酸化的关键酶，当β-半乳糖苷酶催化产生的乳酸还不足以抑制其活性时，保加利亚乳杆菌会继续代谢乳糖产生乳酸，导致酸奶发生后酸化。为了解决酸奶后酸化问题，人们曾尝试改善生产工艺和储藏等方法，或通过基因诱变得到后酸化能力弱的突变株，但都存在着一定的弊端且无法根本解决这一问题。目前，通过改变保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶的活性来控制发酵酸乳后酸化的研究已经有很多，比如令编码β-半乳糖苷酶的基因缺失或是将编码β-半乳糖苷酶的基因突变，或是扰乱乳糖操作子的编码序列，从而改变野生菌株中β-半乳糖苷酶活性，一定程度上减缓了后酸化水平，可见改变菌株的β-半乳糖苷酶活性可有效降低酸奶后酸化水平。目前通过改善工艺水平控制后酸化的方法很多，但都不能从根本上解决问题，而诱变育种及基因工程的遗传稳定性受到多因素影响和制约，Ongol等人提出在自然界中可能存在一些自发的缺陷型菌株，应用这种菌株生产弱后酸化酸奶可以成为一种新途径。本发 明的主要目的是筛选出天然的弱后酸化保加利亚乳杆菌，使其低温产酸慢，高温产酸快，从而开发出具有我国自主知识产权的低成本的弱后酸化酸奶发酵剂。
发明内容
为了解决保加利亚乳杆菌在酸奶储存期间引起的后酸化问题，本发明通过对来自传统乳制品中分离出的保加利亚乳杆菌进行筛选，得到1株具有低β-半乳糖酶活性的菌株，该菌株在脱脂乳中具有较弱的产酸能力，稳定性强，生产成本低，有效延缓货架期，可作为弱后酸化酸奶发酵剂使用。
本发明的一种具有低β-半乳糖酶活性的保加利亚乳杆菌菌株，命名为KLDS1002，分类命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，该菌株是从传统乳制品中分离的保加利亚乳杆菌中筛选出的，于2014年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No.9957，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的菌株是以β-半乳糖酶活性为筛选指标进行初筛，再根据其生长性能和发酵特性得到的一株后酸化能力弱，发酵性能优良的保加利亚乳杆菌。本发明菌株性能较为稳定，不会像突变菌株一样因传代次数过多导致不稳定，并且其所具有的弱后酸化能力也可一直保持。同时本发明菌株由于β-半乳糖酶活性较低，乳糖分解速度减慢，葡萄糖分解为丙酮酸时产生ATP的速度也变慢，导致提供给H+-ATPase的能量也相应较少，从而降低了菌株细胞的代谢活性，减少向胞外排出的质子，减缓了酸奶后酸化发生。
本发明菌株KLDS1002的16SrDNA序列与目前发表的德氏乳杆菌保加利亚亚种的16SrDNA，同源性达到95％以上。综合形态特征与16SrDNA序列鉴定，菌株KLDS1002为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
在本发明中，优选的，所述菌株的β-半乳糖酶活性与产酸能力呈正相关。
本发明还公开了上述具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种在制备发酵乳和发酵食品中的应用。
在本发明中，优选的，所述发酵食品为酸奶。
在本发明中，优选的，所述菌株在42℃发酵12h时，酸奶pH值从6.36降至4.53，下降幅度明显低于对照菌，具有弱后酸化作用。
在本发明中，优选的，其特征在于：所述菌株在42℃发酵后，在4℃冷藏21d期间，pH值的变化范围在4.55-4.25。
在本发明中，优选的，所述菌株在42℃发酵后，在4℃冷藏21d期间，pH值下降了0.3pH单位。
在本发明中，优选的，所述菌株在42℃发酵后，在20℃储藏21d期间，pH值在4.36-3.79的范围内。 
另一方面，本发明还公开了上述具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备酸奶发酵剂中的用途，以及
制备酸奶的方法，该方法的具体操作步骤如下:
①均质：将新鲜牛奶加热至65℃-70℃，在18-20MPa条件下均质；
②杀菌：90-93℃条件下灭菌10min；
③投放发酵菌株：待原料温度降至42℃，以5.0×106cfu/mL的接种量添加德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株KLDS1002，发酵5h，待pH值降至4.5时，终止发酵，即得。
通过筛选得到的具有低β-半乳糖酶活性的德式乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002因其产酸能力较弱，故生长能力也低于对照菌G-495。且对酸较为敏感，有助于菌株在pH降到一定值后就不能再继续生长，代谢乳糖产酸，有助于降低酸奶在贮存过程中的后酸化程度，从而使酸奶产品的酸度维持在理想水平。KLDS1002因其在冻干时的活菌存活率是54.95％，显著高于对照菌株G-495(p<0.05)，是制作酸奶发酵剂以及发酵剂的储存的重要性质。
通过筛选得到的具有低β-半乳糖酶活性的德式乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002在42℃下发酵脱脂乳的过程中，产酸量始终都显著低于对照菌G-495(p<0.05)，并且在pH达到4.5后没有明显的下降。试验菌和对照菌分别在4℃和20℃下储藏1、2、7、14、21d，在4℃下到第21d，G-495的酸度已经升高了51.95％，pH下降到3.67。KLDS1002显著弱于对照菌(p<0.05)，pH值仍保持在4.25。在20℃条件下储存，德式乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的代谢速率较高，虽然KLDS1002随储藏时间延长产酸程度有所加强，但仍显著低于对照菌(p<0.05)，在第21d，酸度增加了40.28％。
通过筛选得到的后酸化能力较弱的德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002产双乙酰和乙醛的能力虽不及对照菌，但综合物性特性较好，具有优良发酵剂的发酵特性。
附图说明
图1为冷藏期间试验菌德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002与对照菌G-495滴定酸度的对比变化图；
图2为冷藏期间试验菌德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002与对照菌G-495pH值的对比变化图；
图3为试验菌德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002与对照菌G-495活菌数变化曲线图；
图4为酸胁迫对试验菌德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002与对照菌G-495活力的影响图；
图5为冷冻对试验菌德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002与对照菌G-495活力的影响图；
图6为试验菌德式乳杆菌保加利亚种KLDS1002与对照菌G-495单菌株发酵的pH变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
材料与试剂 
菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)KLDS1002是以β-半乳糖苷酶活性为筛选指标，从乳品科学教育部重点实验室菌种保藏中心(KLDS-DICC)保藏的所有从传统乳制品中分离的保加利亚乳杆菌中筛选出的，已于2014年11月13号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No.9957。
商业发酵剂菌株命名为G-495，由丹麦科汉森公司进口。
培养基：MRS培养基；11％(w/v)脱脂乳培养基。
主要试剂：1％NaHSO3，1mol/L NaHCO3，0.01mol/L(1/2I2)，邻苯二胺，4mol/L HCl，浓硫酸，苯酚，三氯乙酸，0.1mol/LNaOH，酚酞等，所有试剂均为分析纯。
主要仪器：Delta320精密pH计：Mettler Toledo公司；DU-800紫外分光光度计： Beckman公司；GL-21M高速冷冻离心机、BCN1360型生物洁净工作台、SPX-150B生化培养箱、HIRAYAMA HVE-50形高压灭菌器、TA.XT-2i型质构仪等。
实施例1 一种具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的筛选
(1)筛选
将15株分离自传统乳制品的保加利亚乳杆菌活化2-3次后接种至11％的脱脂乳中，单菌株发酵，后熟24h测定各菌株的β-半乳糖苷酶活性。测定方法：先取50mL的发酵乳与1％EDTA(pH＝12，4℃)混合，使每克样品的质量大于20mg EDTA，主要目的是通过EDTA螯合Ca2+，溶解样品中凝固的乳蛋白，接着5520g离心10min(4℃)，去除上清液，用1mL的20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)反复清洗菌体细胞两次，加入10mL的20mmol/L的磷酸盐缓冲液于菌体细胞中，经过8000r/min离心10min后收集菌体，再加入8mL的20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.5)于菌体中，和1mL的10mg/mL的溶菌酶(酶活力为20000U/mL)，37℃下水浴50min。制得的粗提取胞内酶活力是通过ONPG比色法测定的，方法如下：首先，将1mL粗酶液在37℃下水浴加热5min，加入含20mmol/L的ONPG磷酸盐缓冲液1.0mL(提前预热至37℃)，37℃水浴10min，马上加入3mL的Na2CO3(0.5mol/L)终止反应，测定OD420下的分光光度值，每组三个平行。一个酶活力单位(U)定义为：在37℃下每分钟释放出1μmol的ONPG所需的酶量。结果见表1。
(2)筛选结果
酸奶在后熟结束时品质最好，菌株β-半乳糖苷酶活性较高，随后如果储存温度不适宜，或者菌株产酸能力较强就会因β-半乳糖苷酶的催化，乳糖继续分解发生后酸化。通过对15株保加利亚乳杆菌对比发现，不同菌株β-半乳糖苷酶活性存在很大的差异，范围在0.01-0.16U/mg，其中KLDS1002的活性最低，仅为0.0119U/mg(表1)，故以此菌为研究菌株，就其后酸化和在酸奶中的应用进行深入研究。
表1 不同菌株的β-半乳糖苷酶活性
(3)菌株的16srDNA序列分析
利用16srDNA通用引物，得到16srDNA的PCR产物，将纯化后的PCR产物进行测序，结果发现：菌株KLDS1002的16SrDNA序列与目前发表的德氏乳杆菌保加利亚亚种的16SrDNA，同源性达到95％以上。综合形态特征与16SrDNA序列鉴定，菌株KLDS1002为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
实施例2 具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002与后酸化的关系试验
(1)β-半乳糖苷酶活性的测定
利用溶菌酶破壁法粗提取胞内酶，再采用ONPG比色法测定β-半乳糖苷酶酶活力。一个酶活力单位(U)是指在37℃条件下，每分钟可以释放1μmol ONPG所需 要的酶量。
(2)分别测试试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002与对照商业菌株G-495在4℃贮藏下第1、4、10d和13d的发酵乳中β-半乳糖苷酶的酶活，pH值和酸度的变化，结果见表2、图1和图2。
(3)酶活和酸度对比测定结果
从表2、图1和图2可以看出，两菌株的后酸化能力不同，β-半乳糖苷酶活力也存在较大的区别。在储藏期间，需要β-半乳糖苷酶提供较高的活力来代谢糖产酸。储存初期，菌株的β-半乳糖苷酶活力较高，尤其是后酸化强的商业菌G-495，相应的产酸量也快速增加，最后达到高峰，与之对应的产酸速率也达到最大，随着储藏时间的延长，过多的乳酸反过来抑制了β-半乳糖苷酶的活性，β-半乳糖苷酶的活性逐渐下降，在第10d-13d后，β-半乳糖苷酶的活性已降到很低，β-半乳糖苷酶活活性的变化幅度与贮存期间产酸的幅度趋势完全一致，可见β-半乳糖苷酶是菌株贮存期间的关键酶。试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002整个过程β-半乳糖苷酶活性保持较低的水平，几乎没发生后酸化，这也进一步验证菌株KLDS1002后酸化较弱的一个重要原因是贮存期间β-半乳糖苷酶活力较弱导致的。
表2 贮存期间β-半乳糖苷酶活力的变化
实施例3 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株KLDS1002的生理特性测定
(1)生长性能的测定
将试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002与对照菌G-495活化两代后以3％接种于MRS液体培养基中，37℃培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36和48h取样测定菌体浓度，结果见图3。
(2)耐酸能力的测定
将活化好的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002、G-495接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养16h后，每个样各取3％的接种量分别接种于pH3.0、4.5、5.5、6.5的MRS液体培养基中，37℃下培养12h。采用平板菌落计数法计算活菌数，结果见图4。
(3)耐冷冻能力的测定
将活化好的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002、G-495接种于MRS液体培养基中，在37℃培养16h，分别取10mL菌液，6000r/min离心20min，收集的菌体用等体积的PBS缓冲液重悬，6000r/min离心20min，重复两次。把收集的菌体重悬于10mL脱脂乳培养基中，混匀后分装到安培瓶中冻干。分别对冻干前后取样，采用平板菌落计数法测定活菌数，结果见图5。
(4)菌株生理特性的测定结果
从图3可以看出，试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002生长能力显著低于对照菌G-495(p<0.05)，菌株生长能力较低导致了其产酸能力较弱，进一步验证了德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的弱产酸性能。
图4中的两株保加利亚乳杆菌在pH值为5.5的MRS液体培养基中培养12h时的活菌数高于其他pH值的培养基，说明该菌种更适宜于在偏酸性环境生长。当pH值降到4.5，也就是酸奶发酵终止的pH值时，活力有所下降，但仍都保持在106cfu/mL以上。pH值为3.5时，活菌数显著下降(p<0.05)，德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002和G-495的活菌数减少量分别是pH值6.5的99.83％和98.34％，在相同条件下，试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002较对照菌G-495对酸更为敏感。菌株较弱的生长能力和对酸性环境的较高敏感性，有助于菌株在pH降到一定值后就不能再继续生长和代谢乳糖产酸，有助于降低酸奶在贮存过程中的后酸化程度，从而使酸奶产品的酸度维持在理想水平。
保加利亚乳杆菌作为酸奶发酵剂，在冻干和低温保存时，需要暴露于较低的温度下，其对低温冷冻刺激的适应能力对发酵和储存都有重要的意义。不同菌株对冻干的抵抗力有所不同，由试验结果可知，试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的冷适应性比对照菌株强(图5)。
实施例4 具有低β-半乳糖苷酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002在发酵酸奶中的应用
将活化好的德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002按5.0×106cfu/mL的接种量转接到11％(w/v)的脱脂乳中，42℃下发酵至pH值达到4.5左右，分别在4℃和20℃储藏，以供后面实验使用。
(1)发酵期间产酸能力测定
从发酵开始起，每2h测定乳样的pH值变化，直到第12h，结果见图6。
(2)储藏期间后酸化程度的测定
分别测定4℃和20℃条件下储存1、2、7、14和21d乳样的滴定酸度和pH值。测定滴定酸度的方法参考GB5413.34-2010，pH测定利用Delta320精密pH计直接测定，试验结果见表3和表4。
(3)菌株发酵酸乳的物性特性的测定
利用TA.XT-2i型质构仪测定4℃储存7d的发酵乳质构，每个样品重复测定3次，结果见表5。
(4)菌株发酵酸乳的发酵特性测定结果
在图6中，42℃下发酵脱脂乳时，试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的产酸量始终都显著低于对照菌G-495(p<0.05)，并且在pH达到4.5后未继续显著下降，而对照菌株G-495在到达pH4.5之后仍快速产酸，在最适温度42℃下发酵到12h时，其pH值已经降至3.89。
试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002和对照菌株G-495发酵的酸奶都分别在4℃和20℃下储藏21d，测定不同时间段发酵乳的滴定酸度和pH的变化，以评价发生后酸化的程度(表3、表4)。试验结果发现，4℃下储藏的第2d，对照菌株G-495已经明显的产酸，酸度上升了18.57％，pH下降也到4.24，而试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002发酵的酸乳酸度却只升高了5.56％。到第21d时，对照菌株G-495的滴定酸度已经升高了51.95％，pH下降到3.67。试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002在储存器中也有一定的产酸，但显著弱于对照菌(p<0.05)，在第21d，pH值仍保持在4.25，酸奶最适宜的酸度。因此，该试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002在货架期期间产酸速率较低，可有效延缓后酸化的发生。而在20℃条件下储藏时，加快了保加利亚乳杆菌的代谢速率，产酸能力显著高于4℃下的产酸情况(p<0.05)。在储藏第7d，对照菌株G-495的酸度已经增加了38.89％，到第21d时，pH下降到了2.99，发生了严重的后酸化。虽然试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002随储藏时间延长产酸程度有所加剧，但仍明显低于对照菌(p<0.05)。
表3 酸奶在4℃下储存的pH和酸度变化
注：同行进行差异比较，大写字母不同者表示不同菌株间滴定酸度变化率的差异显著(p<0.05)，同列进行差异比较，小写字母不同者表示储藏期间pH值变化的差异显著(p<0.05)。
表4 酸奶在20℃下储存的pH和酸度变化
注：同行进行差异比较，大写字母不同者表示不同菌株间滴定酸度变化率的差异显著(p<0.05)，同列进行差异比较，小写字母不同者表示储藏期间pH值变化的差异显著(p<0.05)。
在表5中，试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002发酵酸乳所析出的乳清体积只占了总体积的2.98％，凝乳状态良好。且硬度大于对照菌株G-495，呈现明显的负相关(r＝-0.998，p<0.05)，但黏性相关性不显著(r＝0.754，p>0.05)，跟其他指标不具有相关性，而试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的内聚性是0.424，依然是高于对照菌株G-495。在搅拌前，酸奶的硬度高低是其凝胶结构的外在特征，是酸奶胶体中各种化学键结合以及可溶的微粒聚合的结果。不同发酵剂发酵的酸奶硬度差别有时会很大，而酸奶质地过软，将不利于储存及运输，对整体品质也有较大影响。黏度同样是酸奶品质的重要参数，通过试验发现复合发酵酸奶的黏度一般要大于单菌株发酵，另外嗜热链球菌可明显增强产品的黏性。结合各物性指标可以发现，试验菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1002的综合性能更好。
表5 两株保加利亚乳杆菌所得酸乳的TPA质构分析
注：同列进行差异比较，字母不同者表示差异显著(p<0.05)。

Claims (10)

1.一株具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株，其特征在于：所述具有低β-半乳糖酶活性的保加利亚乳杆菌菌株，命名为KLDS1002，微生物保藏号为CGMCC No.9957，保藏日期为2014年11月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其特征在于：所述菌株的β-半乳糖酶活性与产酸能力呈正相关。
3.权利要求1或2所述的具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳和发酵食品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵食品为酸奶。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌株在42℃发酵12h时，酸奶pH值从6.36降至4.53，下降幅度明显低于对照菌，具有弱后酸化作用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌株在42℃发酵后，在4℃冷藏21d期间，pH值的变化范围在4.55-4.25。
7.根据要求3所述的应用，其特征在于：所述菌株在42℃发酵后，在4℃冷藏21d期间，pH值下降了0.3pH单位。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌株在42℃发酵后，在20℃储藏21d期间，pH值在4.36-3.79的范围内。
9.权利要求1所述的具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备酸奶发酵剂中的用途。
10.一种制备酸奶的方法，该方法的具体操作步骤如下:
①均质：将新鲜牛奶加热至65℃-70℃，在18-20MPa条件下均质；
②杀菌：90-93℃条件下灭菌10min；
③投放发酵菌株：待原料温度降至42℃，以5.0×106cfu/mL的接种量添加权利要求1所述的具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株KLDS1002，发酵5h，待pH值降至4.5时，终止发酵，即得。
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