CN104673921A - 一种与人类乳腺癌相关的血清标志物及其应用 - Google Patents

一种与人类乳腺癌相关的血清标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与乳腺癌相关的血清miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-598-3p或miR-598-3p与CA153的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于人类乳腺癌的早期诊断。

Description

一种与人类乳腺癌相关的血清标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种与人类乳腺癌相关的血清标志物及其应用；具体涉及血清miR-598-3p或miR-598-3p与CA153的组合及其应用。
背景技术
乳腺癌(breast cancer，BC)是女性最常见恶性肿瘤之一，全球每年约有120万新发乳腺癌病例，50万死亡病例，在我国每年约有19万新发乳腺癌病例。近年来乳腺癌的发病率逐年上升，发病年龄日趋年轻化，早期诊断和辅助化疗、激素治疗等综合治疗手段使得乳腺癌的死亡率有所递减，但仍属于发病率和死亡率最高的女性恶性肿瘤。
乳腺癌早期予以手术治疗，5年生存率高达60％以上，所以乳腺癌早期诊断具有重要意义。现阶段临床上乳腺癌的辅助诊断使用超声、乳腺钼靶、CT、MRI检查等多种手段，但误诊率仍高且不能早期诊断。由于肿瘤组织标本需手术切除后获得限制了其在临床的应用。细针穿刺细胞学检查虽是诊断乳腺癌的主要方法，但是具有损伤性，且诊断灵敏度和准确度受肿块大小、位置深浅、操作经验、涂片制作、读片水平等因素影响。此外，肿瘤标志物因其无创性而广泛应用于临床，如肿瘤标志物糖链抗原153(CA153)，但其阳性率仅为53％。
微小RNA(miRNA)是一组非编码小RNA，长约18-25个核苷酸，主要通过结合靶基因mRNA的5’UTR、编码区或3’UTR，在转录后水平对基因的表达行负调控功能，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及肿瘤形成等一系列过程中发挥重要作用。多数miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA和肿瘤的关系为肿瘤的诊断及治疗带来了新思路。Calin等发现50％以上的miRNA基因定位于与肿瘤相关的区域或脆弱位点，首次证明miRNA失调在肿瘤发生中发挥重要作用(Calin G A,et al,Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers,Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(9):2999-3004)。Takemizawa等报道了第一个肺癌相关性miRNA:let-7(Takamizawa J,et al,Reduced expression of the let-7microRNAs in human lungcancers in association with shortened postoperative survival,Cancer Res,2004,64(11):3753-3756)。有研究表明，miRNA异常表达参与了乳腺癌的发生和发展，对于乳腺癌的诊断和预后判断具有重要价值。Zhu等对乳腺癌患者血清miR-155的含量进行了小样本的研究，发现血清miR-155水平在乳腺癌患者和非乳腺癌患者中没有显著性差异，但在癌组织孕酮受体阳性的患者中血清含量要高于阴性患者，提示其可能不是诊断乳腺癌的指标，但有希望提示患者病程或预后的相关信息(Zhu W,et al,Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects,BMC Res Notes,2009,2(89))。血清miRNA-10b在乳腺癌骨转移患者中显著高表达，可以作为乳腺癌骨转移的肿瘤标志物(Zhao FL,et al,Serum over expressionof microRNA-10b in patients with bone metastatic primary breast Cancer,J Int MedRes,2012,40(3):859–866)。
miR-598在食管癌患者中表达上调，提示患者预后良好(Zhao BS,et al,Screening of microRNA in patients with esophageal cancer at same tumor nodemetastasis stage with different prognoses,Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(1):139-143)。目前还没有将血清miR-598-3p作为乳腺癌肿瘤标志物的报道，若能检测出miR-598-3p在乳腺癌患者中的显著性表达差异，将对乳腺癌的诊断和治疗具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种与人类乳腺癌相关的血清标志物。
本发明的目的之二在于提供上述血清标志物的检测试剂。
本发明的目的之三在于提供一种人类乳腺癌的诊断试剂盒。
本发明的目的之四在于提供上述血清标志物在制备人类乳腺癌诊断试剂中的应用。
本发明的目的之五在于提供上述血清标志物和上述血清标志物的检测试剂在制备人类乳腺癌诊断试剂盒中的应用。
发明人通过分离和研究乳腺癌患者及健康人群血清中的miR-598-3p，发现miR-598-3p与乳腺癌相关，并且能很好的将乳腺癌患者和健康人区分开来，以此研制出了可便于临床应用的乳腺癌诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种与人类乳腺癌相关的血清标志物，所述标志物为miR-598-3p或miR-598-3p与CA153的组合；对于乳腺癌诊断，血清miR-598-3p优于CA153，具有高灵敏度和高特异性，而且miR-598-3p联合CA153诊断更优。
本发明还提供了一种上述血清标志物的检测试剂。对于miR-598-3p来说，所述试剂能够检测人类血清中miR-598-3p的含量；对于miR-598-3p与CA153的组合来说，所述试剂能够同时检测人类血清中miR-598-3p和CA153的含量。优选地，对于miR-598-3p来说，所述试剂包括检测miR-598-3p的引物；对于miR-598-3p与CA153的组合来说，所述试剂包括检测miR-598-3p的引物和检测CA153的抗体；检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示。所述检测CA153的抗体可从商业途径获取，只要能检测血清中CA153的含量即可。
本发明还提供了一种人类乳腺癌诊断试剂盒。所述试剂盒包括检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂。优选地，所述试剂是检测miR-598-3p的引物，检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示。
作为一种可替代的技术方案，本发明提供的人类乳腺癌诊断试剂盒包括检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂和检测CA153蛋白含量的试剂。优选地，检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂是检测miR-598-3p的引物，检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；检测CA153蛋白含量的试剂是CA153抗体，所述检测CA153的抗体可从商业途径获取，只要能检测血清中CA153的含量即可。
本发明还提供了上述血清标志物在制备人类乳腺癌诊断试剂中的应用。对于miR-598-3p来说，所述试剂包括检测miR-598-3p的引物；对于miR-598-3p与CA153的组合来说，所述试剂包括检测miR-598-3p的引物和检测CA153的抗体；检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示。所述检测CA153的抗体可从商业途径获取，只要能检测血清中CA153的含量即可。
本发明还提供了上述检测试剂在制备人类乳腺癌诊断试剂盒中的应用。所述人类乳腺癌诊断试剂盒包括检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂。优选地，所述试剂是检测miR-598-3p的引物，检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示。作为一种可替代的技术方案，上述人类乳腺癌诊断试剂盒包括检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂和检测CA153蛋白含量的试剂。优选地，检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂是检测miR-598-3p的引物，检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；检测CA153蛋白含量的试剂是CA153抗体，所述检测CA153的抗体可从商业途径获取，只要能检测血清中CA153的含量即可。
进一步，上述人类乳腺癌诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶、逆转录缓冲液、逆转录核酸混合物、DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
进一步，上述人类乳腺癌诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液、稀释液。还可以包括Constar 8联孔酶标条、不干胶封膜。
可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等)测定血清miR-598-3p在乳腺癌患者和健康人群中的水平。在本发明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。
本发明还提供了一种非诊断目的的血清标志物miR-598-3p的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取总RNA，在RNA提取过程中加入外源性参照物；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(2)获得的cDNA进行扩增；扩增所需的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；对于miR-598-3p来说，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种诊断人类乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取总RNA，在RNA提取过程中加入外源性参照物；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(2)获得的cDNA进行扩增；扩增所需的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；对于miR-598-3p来说，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；
(4)通过融解曲线和扩增曲线分析，2-ΔΔCT法进行相对定量。
(5)对miR-598-3p进行logistic回归分析，建立单因素回归模型Logit(P)＝4.315-5.719×miR-598-3p，将样本miR-598-3p的相对表达量代入方程中，若计算值高于1.175，则诊断为乳腺癌；若计算值低于1.175，则判断为非乳腺癌。
外源性参照物，用于标准化提取、反转录及控制后续的定量检测全过程操作的样本间差。
本发明使用的计算相对表达水平的外源性参照物包括但不限于：miRNA-67(Accession：MI0000038，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)miR-67茎-环(stem-loop))、miRNA-356(Accession：MI0000755，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)miR-356茎-环(stem-loop))、线虫39-miRNA(Cel-miR-39)。在本发明的具体实施方案中，本发明使用的人工合成线虫39miRNA(Cel-miR-39)及其扩增引物购自QIAGEN公司，货号为：219610；Cel-miR-39使用终浓度为5μmol/L。
本发明使用的通用反向引物购自QIAGEN公司，货号为：218073。
可以采用加尾法或茎环法将总RNA中的miRNA反转录成cDNA。
加尾法的实验原理是：在小RNA 3’末端由poly A聚合酶加上一段poly A尾巴，然后用一个3’末端含有一段poly T的长引物将miRNA逆转录成cDNA，所得到的cDNA的长度比较适合进行荧光定量PCR。
茎环法的实验原理是：该方法应用了一个单一的茎环状的引物，避免对目的miRNA进行加尾。反应过程分两步：首先，茎环状引物与目的miRNA分子的3’端结合，引物3’端与miRNA3’端有6个互补配对的核苷酸，然后用逆转录酶将之逆转录成cDNA第一链。其次是PCR反应。cDNA第一链的茎环状结构打开后链的长度增加了，以其为模板即可进行传统的荧光定量PCR。茎环状引物的茎部为双链结构，防止引物与pre-miRNA或其他长链RNA的杂交；茎部的碱基堆积增强了miRNA和DNA异质双链的亲合力，提高了逆转录的效率；且茎环状结构展开后增加了miRNA的长度，为随后进行的PCR反应提供了合适的模板。
在本发明的具体实施方案中，采用反转录试剂盒(购自QIAGEN公司，货号为：218161)将miRNA反转录成cDNA，反转录体系配制如下：
反转录方法：
(1)冰上解冻RNA，按照上述表格的配方，冰上配制混合液20μl。
(2)37℃，60min；95℃，5min，置于冰上，得到cDNA，存放在﹣20℃。
本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明的血清miRNA标志物含量丰富且性质稳定，拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物所不具备的特质，即无需抗体制备且易于精确定量。
(2)血清miRNA在临床应用中具有独特的优势，即样本采集方便、容易保存、可以反复采取进行动态监测、微创、并且具有组织和疾病特异性。
(3)本发明的血清miR-598-3p检测试剂盒是一种灵活、高效、快速、高灵敏度、低成本且简易的生物体系检测手段，对乳腺癌的诊断和确定治疗方案将具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1显示血清miR-598-3p在乳腺癌患者和健康人群中的分布情况；
图2显示血清miR-598-3p区分乳腺癌患者和健康人群的ROC曲线；
图3显示血清CA153区分乳腺癌患者和健康人群的ROC曲线；
图4显示联合血清miR-598-3p和血清CA153区分乳腺癌患者和健康人群的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1血清miR-598-3p在乳腺癌患者和健康人群中的表达
1、病例资料
根据随机原则收集2013年1月至2014年9月间台州市中心医院的乳腺癌病人血清100例和健康人群血清40例。乳腺癌患者的病例都有完整的临床病理资料，所有病例的病理均由两名有经验的病理医师按照WHO的分类标准进行诊断，临床分期是按照美国癌症联合会的TNM分期。全部病例均没有进行过放疗、化疗等治疗。乳腺癌的临床病理资料见表1。
表1 100例乳腺癌患者的临床病理资料
2、血清收集：
全血室温静置30min，4℃下1900×g离心10min，吸取上层黄色血清，再次4℃下16000×g离心10min，吸取上层血清，存放于﹣80℃。
3、采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA(RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，货号：217184)
(1)取200μl血清，室温融解，4℃下16000×g离心5min，加1000μl裂解液，上下吹打混匀，室温静置5min。
(2)加入Cel-miR-39，终浓度为5μmol/L。
(3)加200μl氯仿，剧烈摇晃15s，室温静置2-3min。4℃下12000rpm离心15min，吸取上清至一新离心管中，勿吸入中间层。
(4)加900μl无水乙醇，吹打至完全混匀。
(5)立即吸取700μl样品至吸附柱中，轻轻盖上盖子，12000rpm离心15s，弃掉废液。
(6)加700μl缓冲液RWT，12000rpm离心15s，弃掉废液。加500μl缓冲液RPE，12000rpm离心15s，弃掉废液。
(7)加500μl 80％乙醇至吸附柱中，12000rpm离心2min，弃掉离心管，将吸附柱放在一个新的离心管中，打开吸附柱盖子，以最大速度离心5min。
(8)把吸附柱放在一个新的去RNA酶的EP管中，加14μl无RNA酶水至吸附柱的中间，以最大速度离心1min，收集得到纯净miRNA，保存于﹣80℃。
4、miRNA逆转录(采用miRNA逆转录试剂盒，该试剂盒购自QIAGEN公司，货号：218161)
(1)冰上解冻RNA，按照表2的配方，冰上配制混合液20μl。
表2逆转录反应体系
试剂 体积
5×逆转录缓冲液 4μl
10×核酸混合液 2μl
逆转录酶 2μl
无RNA酶水 10μl
RNA 2μl
(2)37℃，60min；95℃，5min，置于冰上，得到cDNA，存放在﹣20℃。
5、Real-time PCR反应
(1)以cDNA为模板，每个模板设3个复孔，按照表3的配方配制反应体系25μl，所有的反应重复3次。
表3Real-time PCR反应体系
试剂 体积
2×SYBR Green 12.5μl
正向引物 2.5μl
反向引物 2.5μl
无RNA酶水 5μl
cDNA 2.5μl
(2)反应程序：预变性95℃15min；然后94℃15s、55℃30s、70℃30s，共40个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA的正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物为通用反向引物。以Cel-miR-39作为参照基因进行均一化，本发明使用的人工合成线虫39miRNA(Cel-miR-39)及正向引物购自QIAGEN公司，货号为：219610；Cel-miR-39使用终浓度为5μmol/L，反向引物为通用反向引物。本发明使用的通用反向引物包含在SYBR Green PCR试剂盒中，该试剂盒购自QIAGEN，货号：218073。
6、结果
采用实时荧光定量PCR测得的血清miR-598-3p的表达量，用Ct598-3p表示，Cel-miR-39的表达量用Ct39表示。血清miR-598-3p的相对表达量＝2﹣ΔΔCt，[ΔΔCt＝(Ct598-3p-Ct39)乳腺癌-(Ct598-3p-Ct39)正常]。结果如图1所示，与健康人群相比，乳腺癌患者血清中miR-598-3p的含量明显降低，低于健康人群含量的0.5倍，差异具有统计学意义(P<0.001)。
实施例2miR-598-3p与乳腺癌的相关性分析
根据实施例1中测定的血清miR-598-3p在乳腺癌样品中的水平，使用单因素Logistic回归分析miR-598-3p与乳腺癌患者的相关性，结果如表4所示，表明miR-598-3p与乳腺癌患者存在强相关性。
表4单因素Logistic回归分析结果
miRNA 回归系数 标准误 χ2 P OR AUC
miR-598-3p -5.719 0.958 81.905 <0.001 0.003 0.939
常数项 4.315 0.692 81.905 <0.001 74.805
根据实施例1中获得的2﹣ΔΔCt计算miR-598-3p在血清样本中的相对表达量，利用spss软件做回归分析，得出公式：Logit(P)＝4.315-5.719×miR-598-3p，将检测到的miR-598-3p相对表达量带入上述方程中，若计算值高于1.175，则诊断为乳腺癌；若计算值低于1.175，则判断为非乳腺癌。
实施例3miR-598对乳腺癌患者的诊断效果评价
1、ROC曲线制作：
(1)联合miR-598和CA153两个指标来区分乳腺癌组和健康组时，采用Binary Logistic方法进行Logistic逐步回归分析，求出miR-598-3p和CA153的回归方程：P＝1/[1+e-(-5.793×miR-598-3p+0.165×CA153+2.703)]，将miR-598-3p的相对表达量和CA153的含量代入方程，得到联合检测的预测概率P，以新拟合变量P进行ROC曲线分析。
(2)当单独使用miR-598-3p或者CA153来区分乳腺癌组和健康组时，测定miR-598-3相对表达量或者CA153的含量，利用(1)的方法制备ROC曲线。
2、结果：
利用miR-598-3p区分乳腺癌患者和健康人群时，其AUC值为0.939，95％CI为0.902-0.977，最佳临界点时的敏感性为95％、特异性为85％(图2)，上述结果表明血清miR-598在区分乳腺癌患者和健康人群时有意义。
CA153是现有技术中诊断乳腺癌的常用标记物，利用CA153ELISA诊断试剂盒(购自上海科敏生物科技有限公司，货号：E-EL-H0611)，按照试剂盒的说明检测乳腺癌患者和健康人群血清中CA153蛋白的分布情况，建立ROC曲线。结果如图3所示：以CA153诊断乳腺癌时，AUC值为0.699，95％CI为0.608-0.791，最佳临界点时的敏感性为66％、特异性为65％。将miR-598-3p的诊断效果与之相比，可见miR-598-3p对乳腺癌的诊断效果更优，敏感性和特异性更高。
当联合miR-598-3p和CA153两个指标来区分乳腺癌组和健康组时，其AUC值为0.956，95％CI为0.923-0.989，最佳临界点时的敏感性为97.5％、特异性为88％(图4)。可见miR-598-3p和CA153联合使用诊断乳腺癌的敏感性和特异性均高于单独使用其中任何一种标志物，miR-598-3p和CA153联合使用诊断效果更优。
实施例4乳腺癌诊断试剂盒
1、检测血清中miR-598-3p含量的乳腺癌诊断试剂盒的组成如表5所示：
表5乳腺癌诊断试剂盒的组成
组份 浓度 量
逆转录缓冲液 5× 200μl
逆转录酶M-MLV 200U/μL 100μl
逆转录核酸混合液 10× 100μl
miR-598正向引物 10μM 125μl
Cel-miR-39正向引物 10μM 250μl
通用反向引物 10μM 125μl
SYBR Green 2× 625μl
去RNA酶水 750μl
miR-598-3p正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，Cel-miR-39正向引物购自QIAGEN公司，货号为：219610；通用反向引物购自QIAGEN，货号：218073。
2、同时检测血清中miR-598-3p和CA153含量的乳腺癌诊断试剂盒的组成如表6所示：
表6乳腺癌诊断试剂盒的组成
其中，包被缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，其成分为140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，pH值为7.4。
洗涤液为含1％Tween-20的PBS，称为PBST，其成分为PBS、1％Tween-20。
封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS、1％BSA。
加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl、0.5M KCl、1％BSA、0.05％Tween-20，pH值为8.4。
显色剂A为0.2mol/L柠檬酸24.3ml、0.2mol/L Na2HPO425.7ml、过氧化氢0.1％、加双蒸水至1200ml配制而成。
显色剂B为TMB 3.9g、柠檬酸10.52g、EDTA 1.86g、甘油300ml配制而成。
酶标板为Constar 8联孔酶标条。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种与人类乳腺癌相关的血清标志物，其特征在于，所述标志物为miR-598-3p。
2.一种与人类乳腺癌相关的血清标志物，其特征在于，所述标志物为miR-598-3p与CA153的组合。
3.一种权利要求1或2所述的标志物的检测试剂，其特征在于，对于miR-598-3p来说，所述试剂能够检测人类血清中miR-598-3p的含量；对于miR-598-3p与CA153的组合来说，所述试剂能够同时检测人类血清中miR-598-3p和CA153的含量。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，对于miR-598-3p来说，所述试剂包括检测miR-598-3p的引物；对于miR-598-3p与CA153的组合来说，所述试剂包括检测miR-598-3p的引物和检测CA153的抗体；检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；通用反向引物由商业途径获取。
5.一种人类乳腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的试剂。
6.权利要求1或2所述的标志物在制备人类乳腺癌诊断试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂为权利要求3或4所述的试剂。
8.权利要求3或4所述的试剂在制备人类乳腺癌诊断试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为权利要求5所述的试剂盒。
10.一种非诊断目的的权利要求1所述的标志物的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取总RNA，在RNA提取过程中加入外源性参照物；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(2)获得的cDNA进行扩增；扩增所需的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；对于miR-598-3p来说，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；通用反向引物由商业途径获取；
(4)通过融解曲线和扩增曲线分析，2-ΔΔCT法进行相对定量。
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