CN104673685A - 一种两面针内生真菌的分离培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种两面针内生真菌的分离培养基，培养基由两面针枝叶粉、玉米粉、葡萄糖、硝酸钾、无机盐、琼脂粉和水组成，制备方法为：将两面针枝叶粉、玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，然后灭菌备用。本发明的培养基显著提高了所分离得到的两面针内生真菌的数量，而且具有保存菌种时间长的优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种两面针内生真菌的分离培养基。
背景技术
植物内生真菌是指部分或全部生活史存在于植物的组织和器官内部的真菌，其可通过从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内扩增出DNA的方法来证明其内生性，而且被感染的宿主植物却不表现出外在病症。1993年，美国科学家从药用红豆杉组织中分离到一株产紫杉醇的内生真菌后，引起了人们对植物内生真菌及其活性物质开发的研究热潮，随着研究的深入，人们还发现，某些植物的内生真菌除了能产生与寄主植物相同的活性成分外，还能产生与寄主植物不同的活性成分，再加上植物内生菌作为微生物，具有生长速度快、易于工业化发酵等特点，因此从植物内生真菌中发现有医用价值的内生菌株及化合物已成为医药工作者研究的新热点。
我国植物种类繁多，不同的寄主植物，其内生真菌的种类和数量的差别相当大。因此，对具医用价值的内生菌株的筛选中应采取一定的策略，一般来讲，从具药用的植物中分离筛选到医用价值内生菌株的机率较大，而某些作为民族药、特色药的药用植物，如两面针等药用植物，其所含的内生真菌很可能具有产生新颖药用物质的潜力。此外，在药用植物资源日渐枯竭、生态环境及生物多样性受到严重威胁的今天，加强对两面针等药用植物内生真菌的研究并对其加以开发利用具有良好的应用潜力。但人们在对两面针等药用植物内生真菌的研究中还有以下不少问题有待完善，例如：(1)某些植物内生真菌种类在人工培养基中生长不好，因此不能保证所有的内生真菌菌株被全部被分离出来，因而部分活性菌株会漏筛，也无法做进一步的后继研究；(2)部分获得的植物内生真菌菌种在保存的过程中会自然消亡或失活。
因此本领域是通过皿内培养的方式，获得足够的两面针内生真菌的种类，为进一步提取、纯化、鉴定两面针内生真菌胞内及胞外的药用活性物质提供基础。中国专利公开了一些细菌、真菌和植物的培养基或分离培养基，例如：CN 102719386 A，一种细菌、真菌菌种保存培养基；CN 103396968 A，一种细菌培养基及其应用；CN 1488751 A，一种真菌细菌培养基；CN 104277987 A，牛樟菌培养基；CN 103952319 A，一种食线虫真菌分离、纯化和保存培养基；CN 102965308 A，一种分离高盐环境放线菌的培养基及其应用；CN 103396970 A，一种分离锰氧化菌的培养基；CN 102754655 A，一种简便的腐霉菌快速分离培养基等。目前关于两面针内生真菌的分离培养基的研究和应用未见公开文献报道。本发明的培养基显著提高了所分离得到的两面针内生真菌的数量，避免了在内生真菌分离过程中的漏筛，而且具有保存菌种时间长，菌株继代培养稳定性好等优点。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种适合两面针内生真菌分离和保存的培养基。
本发明所述的两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于两面针枝叶粉、玉米粉、葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉和水组成。
所述的两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于，两面针枝叶粉15-60g、玉米粉15-60g、葡萄糖10-20g、酵母膏1-2g、无机盐0.7-2.1g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
所述的两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于，优选的两面针枝叶粉36g、玉米粉36g、葡萄糖17g、酵母膏1.6g、无机盐1.6g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
所述的两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于所述的无机盐为其特征在于所述的无机盐为K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O、NaCL按重量份1∶1∶1∶1的比例混合而成。
所述的两面针内生真菌的分离培养基在两面针内生真菌的培养、保存中的应用。
本发明有以下显著效果：
(1)显著提高了从两面针各部位所分离得到的两面针内生真菌的数量。
(2)对已经获得的两面针内生真菌菌株具有保存菌种时间长，菌株继代培养稳定性好的优点。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该指出的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
两面针枝叶粉16g、玉米粉60g、葡萄糖11g、酵母膏1g、无机盐0.8g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例2
两面针枝叶粉58g、玉米粉15g、葡萄糖19g、酵母膏2g、无机盐2g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例3
两面针枝叶粉30g、玉米粉30g、葡萄糖15g、酵母膏1.2g、无机盐1.4g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例4
两面针枝叶粉36g、玉米粉36g、葡萄糖18g、酵母膏1.5g、无机盐1.6g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例5
两面针枝叶粉26g、玉米粉25g、葡萄糖17g、酵母膏1.6g、无机盐1.2g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例6
两面针枝叶粉45g、玉米粉48g、葡萄糖13g、酵母膏1.4g、无机盐1.2g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例7
两面针枝叶粉54g、玉米粉55g、葡萄糖19g、酵母膏1.1g、无机盐2.1g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例8
两面针枝叶粉36g、玉米粉36g、葡萄糖18g、酵母膏1.5g、无机盐1.6g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例9
两面针枝叶粉26g、玉米粉24g、葡萄糖15g、酵母膏1.7g、无机盐1.7g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
将两面针枝叶粉和玉米粉加蒸馏水1L，沸煮0.5h，过滤后的滤液依次加入规定量的葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉，最后以蒸馏水补足1L，在高压蒸汽灭菌器内121℃(压力0.1MPa)条件下，灭菌30min后取出备用。
实施例10
实施例1～9所制得的培养基作为分离培养基，以马铃薯琼脂培养基(PDA)和玉米粉琼脂培养基(CMA)作为对照培养基，采用组织分离法对两面针根、茎、叶和果实部分的内生真菌进行分离，将表面消毒过的根、茎和果实部分在超净工作台上用无菌刀片去除表皮组织，并切割成长、宽、高约5mm的小块，叶片则直接切割成长宽约5mm的小块，每3个组织块放在PDA平板上，在25℃下避光培养，设3个重复。对所分离的内生真菌进行反复纯化，得到单一菌落后保存于4℃统计所分离得到的内生真菌数量，结果见表1。
表1 发明实例培养基对两面针内生真菌的分离效果
从表中可见实施例1～9所制得的培养基作为分离培养基，对两面针根、茎、叶和果实部分的内生真菌进行分离，所得到的菌株数量明显高于对照PDA培养基和CMA培养基。
实施例11
以马铃薯琼脂培养基(PDA)和玉米粉琼脂培养基(CMA)作为对照培养基，将实施例10中从两面针根、茎、叶和果实部分所分离得到的内生真菌菌株分别接种于实施例1～9所制得的培养基中，在4℃冰箱保存1年后进行复壮，检查两面针各部位分离得到的内生菌株的存活率，结果见表2。
表2 发明实例培养基对两面针内生真菌的保存效果
从表中可见将两面针根、茎、叶和果实部分所分离得到的内生真菌菌株接种于实施例1～9所制得的培养基中，其存活率明显高于对照PDA培养基和CMA培养基。
Claims (5)
1.一种两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于由两面针枝叶粉、玉米粉、葡萄糖、酵母膏、无机盐、琼脂粉和水组成。
2.如权利要求1所述两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于，两面针枝叶粉15-60g、玉米粉15-60g、葡萄糖10-20g、酵母膏1-2g、无机盐0.7-2.1g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
3.如权利要求1所述两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于，两面针枝叶粉36g、玉米粉36g、葡萄糖17g、酵母膏1.6g、无机盐1.6g、琼脂粉20g，蒸馏水补足1L。
4.如权利要求3所述两面针内生真菌的分离培养基，其特征在于所述的无机盐为K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O、NaCL按重量份1∶1∶1∶1的比例混合而成。
5.如权利要求1所述的两面针内生真菌的分离培养基在两面针内生真菌的分离、保存中的应用。
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| CN104673685B (zh) | 2018-11-16 |
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