CN104655856A

CN104655856A - 一种Cortactin蛋白的应用

Info

Publication number: CN104655856A
Application number: CN201510066650.0A
Authority: CN
Inventors: 王水; 查小明; 夏添松; 梁梦迪
Original assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明公开了一种Cortactin蛋白的应用，将Cortactin蛋白用于制备乳腺癌转移诊断试剂。Cortactin蛋白可作为乳腺癌转移EMT相关标志物，用于诊断与EMT相关的乳腺癌转移。本发明通过在人源性乳腺微环境的活体动物模型中提取背景高度一致的细胞系进行高通量蛋白组学对比实验，发现Cortactin蛋白可用作乳腺癌转移EMT相关标志物，使用细胞学、分子生物学、动物模型、以及临床标本检测等方法，证明Cortactin可以调节乳腺癌细胞株EMT的状态，Cortactin的调节可以影响乳腺癌细胞株的转移效率，Cortactin表达与EMT相关的乳腺癌转移高度相关。

Description

一种Cortactin蛋白的应用

技术领域

本发明属于医药诊断试剂领域，具体涉及一种涉及Cortactin蛋白的应用，特别是涉及Cortactin蛋白作为乳腺癌转移EMT相关标志物用于制备乳腺癌转移诊断试剂。

背景技术

乳腺癌是女性第二大发病率的恶性肿瘤，乳腺癌转移是致死的主要原因。通常，乳腺癌转移是不可治愈的。在临床中，乳腺癌转移的诊断多需要借助影像学检查或医生触诊，而在乳腺癌转移的早期，很难使用现有的设备和方法进行诊断，现有技术下也没有特异性和敏感性均达到要求的诊断标志物。目前临床使用的乳腺癌分子标志物如ER、PR、Her2、Ki67、P53、CK5/6、TOPII等在乳腺癌早期和乳腺癌转移阶段的表达均未有显著差异。因此，现有的乳腺癌诊断标志物并不能诊断或预测乳腺癌转移的发生和风险。

皮细胞-间充质转化(EMT)，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。乳腺癌转移与EMT的发生机制与微环境密不可分，其特异性标志物对于临床有着极高的预后和治疗价值。但是目前，乳腺癌EMT研究的证据和手段仍不完整，不具备寻找新的EMT靶点的条件。

发明内容

本发明中的Cortactin是指皮层肌动蛋白结合蛋白，是一种微丝骨架结合蛋白。可作为Src激酶直接磷酸化的底物受到酪氨酸磷酸化信号通路的调控，从而成为信号通路与细胞骨架重要的联系分子。Cortactin与肌动蛋白纤丝的侧面相结合，并直接参与皮层细胞骨架的组建，它可以通过影响细胞运动前沿微丝骨架重组从而提高细胞迁移的能力。(Weaver,A.M.,Cortactin and tumor invasiveness.Cancer Lett,2008.265(2):p.14.)本发明的目的是提供一种Cortactin蛋白在制备乳腺癌转移诊断试剂中的应用，为乳腺癌复发转移风险的评估提供有力的工具。

进一步的，上述应用中，Cortactin蛋白可作为乳腺癌转移EMT相关标志物，用于诊断与EMT相关的乳腺癌转移。

进一步的，上述应用中，Cortactin蛋白可以作为乳腺癌转移诊断试剂反应底物，用于诊断与EMT相关的乳腺癌转移。本发明所述的诊断检测可以采用常规的技术方法，如利用抗原抗体反应的原理制备Cortactin蛋白抗体，利用抗体检测人体内Cortactin蛋白水平，或者利用Cortactin蛋白检测人体内Cortactin蛋白抗体的水平。本发明所述的诊断检测样本可以选择血浆、血清或体液等。

本发明是建立在人乳腺癌细胞株在活体内自然发生的EMT过程上。本发明以具有人源性乳腺微环境的活体动物模型为基础进行实验，该动物模型具有人源性乳腺微环境，能够较好的模拟临床。通过在人源性乳腺微环境的活体动物模型中提取背景高度一致的细胞系进行高通量蛋白组学对比实验，发现Cortactin蛋白可用作乳腺癌转移EMT相关标志物，然后使用细胞学、分子生物学、动物模型、以及临床标本检测等方法，证明Cortactin可以调节乳腺癌细胞株EMT的状态，Cortactin的调节可以影响乳腺癌细胞株的转移效率，Cortactin表达与EMT相关的乳腺癌转移高度相关。

本发明通过对乳腺癌组织的石蜡标本进行蛋白Cortactin的检测，可对乳腺癌患者转移风险进行预测，Cortactin蛋白的下调和缺失与乳腺癌转移高风险相关；目前临床上尚无成熟的乳腺癌转移相关蛋白标志物的检测，Cortactin蛋白的临床免疫组化检测将为乳腺癌复发转移风险的评估提供有力的工具。

附图说明

图1为MDA-MB-231-br银染二维凝胶电泳图。

图2为MDA-MB-231银染二维凝胶电泳图。

图3为Cortactin表达进行下调对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的细胞学形态影响。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1

创建具有人源性微环境的乳腺癌小鼠模型(参照文献Wang J,Xia TS,Liu XA,Ding Q,Du Q,Yin H,Wang S.A novel orthotopic and metastatic mouse model of breast cancer in humanmammary microenvironment.Breast Cancer Res Treat.2010Apr；120(2):337-44.PMID:19350386.公开的方法造模)。在移植正常人源性乳腺组织中接种人乳腺癌细胞，提高原位成瘤率，检测并收集对侧人源性组织中的转移乳腺癌细胞及瘤组织。用于乳腺癌EMT相关转移蛋白标志物的鉴定和提取。造模结果如表1所示：

表1病理学检查MDA-MB-231的原位成瘤和转移成瘤情况

实验组为“人乳腺-人乳腺”小鼠模型；对照组为皮下注射小鼠模型；左侧乳腺，在小鼠左侧胁腹皮下移植的人源性乳腺组织中存在乳腺癌细胞；左侧肌肉，在小鼠左侧胁腹肿瘤细胞注射处的肌肉组织中存在乳腺癌细胞；仅转移到右侧乳腺，仅在小鼠右侧胁腹皮下移植的人源性乳腺组织中发现乳腺癌转移细胞，而在其他小鼠组织中无乳腺癌转移细胞；仅转移到小鼠组织，仅在小鼠组织中发现乳腺癌转移细胞，而在小鼠右侧胁腹皮下移植的人源性乳腺组织中无乳腺癌转移细胞；转移到右侧乳腺和小鼠组织，在小鼠右侧胁腹皮下移植的人源性乳腺组织中和小鼠组织中均发现乳腺癌转移细胞；无转移，在小鼠右侧胁腹皮下移植的人源性乳腺组织中和小鼠组织中均无乳腺癌转移细胞。*：p＜0.05，与对照组相比有显著差异。实验结果表明注射在移植的人源性乳腺组织中的人乳腺癌细胞株，比直接注射在小鼠皮下更多的转移到对侧的移植乳腺原位成瘤率提高，并得到50％以上对侧转移率。将移植乳腺中生长的乳腺癌细胞进行原代培养，在外形上出现了EMT的倾向，说明在小鼠模型中出现了人源性乳腺微环境中自发的EMT。

实施例2

用实施例1创建的具有人源性微环境的乳腺癌小鼠模型上的移植乳腺的原代乳腺癌细胞株MDA-MB-231br(231br)和亲代细胞株MDA-MB-231(231)进行体外培养，对原代和亲代细胞株进行蛋白二维电泳和质谱分析，结果如图2和图3所示，其中，图1为MDA-MB-231-br银染二维凝胶电泳图，图2为MDA-MB-231银染二维凝胶电泳图，经过图1和图2的对比，得到了81个差异蛋白(图1和图2中数字和箭头指示差异蛋白所在的位置，数字与表2中81个蛋白编号(Numb栏)一一对应。)表2中，序号为75的差异蛋白为Cortactin。实验说明人乳腺癌细胞株在模拟临床的人源性乳腺微环境中发生了EMT，并且Cortactin是EMT过程的特异性蛋白。

表2MDA-MB-231亲代与原代细胞株MDA-MB-231-br差异表达蛋白

Num：蛋白编号；SpotID：质谱分析时差异蛋白点编号；Accession no：数据库蛋白编号；AC：蛋白名称缩写；Theor.mol.Mass：理论分子量；Measured mol.mass：测量分子量；Sequence coverage：匹配肽段占整个蛋白序列的覆盖率；Peptides assigned：匹配肽段；Foldchange(g/p)：差异倍数，g：MDA-MB-231-br；p：MDA-MB-231。NA：分母为0，即在MDA-MB-231中未检测到表达。

实施例3

体外培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，采用商品化的小RNA干扰技术对MDA-MB-231的Cortactin表达进行下调。实验分为空白对照组231-NC、干扰组231-sh1，干扰组231-sh2，sh1和sh2为商品化合成的两个版本的干扰片段。实验使用PGLV3-h1-GFP-puro vector慢病毒载体及sh1或sh2干扰片段构建shRNA表达载体，(PGLV3-h1-GFP-puro vector慢病毒载体及sh1和sh2干扰片段购自上海吉玛制药技术有限公司，www.GenePharma.com)。sh1序列如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2所示，sh2序列如SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4所示。sense(5'-3')GCUGAGGGAGAAUGUCUUUTT，SEQ ID NO:1；antisense(5'-3')AAAGACAUUCUCCCUCAGCTT，SEQ ID NO:2；sense(5'-3')CCAUGGCUAUGGAGGGAAATT，SEQ ID NO:3；antisense(5'-3')UUUCCCUCCAUAGCCAUGGTT，SEQ ID NO:4。分别使用shRNA1和shRNA2转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞，考察Cortactin表达进行下调对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的细胞学形态影响。结果如图3所示，结果表明干扰组231-sh1和干扰组231-sh2中，乳腺癌细胞株MDA-MB-231的Cortactin下调后出现了间质(M)向上皮(E)表型的转变，即梭形向类圆形的转变，表明Cortactin的表达状态与乳腺癌细胞的EMT直接相关。

实施例4

采用公认的乳腺癌肺转移模型：裸鼠尾静脉注射肺转移模型，以鉴定在动物水平，Cortactin表达改变对于乳腺癌细胞转移能力的改变。

建模流程：采用4周龄雌性裸小鼠，分两组，每组14只小鼠，尾静脉注射乳腺癌细胞株5×10⁵细胞/只，乳腺癌细胞株选择MDA-MB-231(231组)或小RNA干扰株(实施例3中的231sh1组细胞，其Cortactin下调)。6周后处死小鼠，检查肺部转移灶。结果表明：231组，14只小鼠中有12只出现了肺转移，肺转移率为12/14，其中肉眼转移灶大于5个的有5只(6/14)；231sh组14只小鼠中只有5只出现了肺转移，肺转移率为5/14，其中肉眼转移灶大于5个的为0只(0/14)肺转移率5/14，其中肉眼转移灶大于5个的0/14。本研究表明，在动物水平，乳腺癌细胞株Cortactin下调可以显著降低其转移能力。

实施例5

对临床标本的进行考察，研究Cortactin与乳腺癌的相关性。如表3所示。

TNM分期依据Union Internationale Contre le Cancer criteria。Cortactin表达采用免疫组化的方法：胞浆棕染为阳性(+)

每个高倍镜视野：棕染细胞比例<1％为(-)

棕染细胞≥1％，<10％为(+)

棕染细胞≥10％，<50％为(++)

棕染细胞≥50％为(+++)

-和+为低表达，++和+++为高表达

P值<0.01为有统计学差异，P值<0.001为有显著统计学差异，

表3数据表明，Cortactin表达与患者年龄、核分级无相关性，与临床分期有显著相关性，即，晚期(转移)的乳腺癌患者Cortactin高表达，早期的乳腺癌患者Cortactin低表达。

Claims

1.一种Cortactin蛋白的应用，其特征在于将Cortactin蛋白用于制备乳腺癌转移诊断试剂。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于Cortactin蛋白可作为乳腺癌转移EMT相关标志物，用于诊断与EMT相关的乳腺癌转移。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于Cortactin蛋白作为乳腺癌转移诊断试剂反应底物用于制备乳腺癌转移诊断试剂。