CN104655852A - 一种系统性红斑狼疮的诊断标志 - Google Patents

一种系统性红斑狼疮的诊断标志 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种系统性红斑狼疮的诊断标志，具体公开了一种特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂在制备用于系统性红斑狼疮的诊断和/或预后评估的诊断工具中的应用。所述血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的增高与系统性红斑狼疮的发生密切相关，可用于系统性红斑狼疮的早期诊断和/或预后评估，进而用于指导系统性红斑狼疮的治疗。

Description

一种系统性红斑狼疮的诊断标志
技术领域
本发明涉及疾病的诊断技术领域，尤其涉及一种系统性红斑狼疮的诊断标志及其应用。
背景技术
系统性红斑狼疮（SLE）是一种弥漫性、全身性自身免疫病。它有多种临床症状，会牵涉到皮肤粘膜、骨骼肌肉、肾脏及中枢神经系统性疾病，有时还会引发肺、心脏等多个其他器官和系统功能紊乱，SLE好发于青年女性，发病高峰为15～40岁，男女发病比例为1：9左右，尽管研究发现其发病有一定的家庭聚集倾向，但是其发病机制并非单一的遗传因素。目前系统性红斑狼疮的发病机制尚不明确。
研究发现，在系统性红斑狼疮患者的血清中，可检测到多种自身抗体和免疫学异常。目前对于系统性红斑狼疮的检测也通常借助于一些辅助检查，如常规检查中的血常规、尿常规等以及免疫系统的检查和自身抗体的检查可以做出诊断。目前参照的标准仍然是1997年美国风湿病学会修订的的系统性红斑狼疮分类标准。但是，该标准对早期、不典型病例容易漏诊，因此继续发现一种新的诊断标志物来作为这种疾病早期诊断和后期治疗的指导。
蛋白质糖基化修饰是一种最普遍和最多变的翻译后修饰，是特异糖链在细胞内质网中添加到蛋白质上形成寡糖链的过程，具有酶定向和位点特异性。根据与蛋白质部分连接方式的不同，蛋白质糖基化修饰分为N-糖基化和O-糖基化两种形式。N-糖链一般分为高甘露糖型、复杂型和杂合型三种。多年来，人们已对多种蛋白的糖基化修饰进行了广泛深入的研究，并清楚地认识到蛋白糖基化修饰在很多疾病的发生发展中扮演着重要角色，例如肝细胞癌中甲胎蛋白的高岩藻糖基化等。
免疫球蛋白是可溶性血清糖蛋白，可为高等脊椎动物提供针对已暴露抗原的长期保护。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白种类，占人血清免疫球蛋白的80%，是再次免疫应答后形成抗体的主要组分，在机体中发挥重要作用。糖基化在免疫球蛋白的结构和功能中扮演着重要角色。
发明内容
本发明的目的在于提出血清抗体中高甘露糖型N糖链水平可作为系统性红斑狼疮（SLE）的诊断标志，并具体提出用于特异性检测该诊断标志物的试剂在制备用于系统性红斑狼疮的诊断和/或预后评估的诊断工具中的应用；本发明所提出的系统性红斑狼疮的诊断标志的水平与系统性红斑狼疮的发生密切相关，可用于系统性红斑狼疮的早期诊断和/或预后评估，进而用于指导系统性红斑狼疮的治疗。
具体地，一方面，本发明提供了一种特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂在制备用于系统性红斑狼疮的诊断和/或预后评估的诊断工具中的应用。
上述应用中，作为优选，所述血清抗体为血清IgG型抗体。
作为优选，所述高甘露糖型N糖链为结构式分别如I、II和III所示糖链的任意一种或几种的混合物；
其中，结构式I为：
Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man-Man)Man-Man-Man；
结构式II为：
Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man)2(Man)2GlcNAc(Man)3(Man)2；
结构式III为：
Asn-GlcNAc(Fuc)-GlcNAc-Man-(Man)4(GlcNAc-Gal)(Man-GlcNAc-Gal)。
上述结构式中，Asn表示天冬氨酸，GlcNAc表示葡萄糖胺，Man表示甘露糖，Gal表示半乳糖，Fuc表示岩藻糖。
作为优选，通过免疫测定法检测血清抗体中高甘露糖型N糖链的水平；优选地，所述免疫测定法为酶免疫测定法、免疫比浊测定法、乳胶免疫凝集法、电化学发光法或荧光法；更优选地，所述免疫测定法为酶联免疫吸附测定法。
作为优选，所述特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂包括特异性识别高甘露糖型N糖链的抗体或配体。
更优选地，所述抗体为单克隆抗体或抗原结合片段；最优选地，所述抗体为鼠抗人单克隆抗体。
所述诊断工具为诊断试剂、试剂盒、蛋白芯片或免疫检测试纸。
作为优选，通过质谱法检测血清抗体中高甘露糖型N糖链的相对丰度；这种糖链的鉴定方法需要借助质谱仪。
上述应用中，通过检测待测个体的血清抗体中高甘露糖型N糖链的水平，将其与相同检测条件下的正常个体的血清抗体中高甘露糖型N糖链水平相比的增高，诊断为患有系统性红斑狼疮。
另一方面，本发明提供了一种系统性红斑狼疮的诊断工具，该诊断工具包括特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂；
优选地，所述诊断工具为诊断试剂、试剂盒、蛋白芯片或免疫检测试纸；
优选地，所述特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂为特异性识别高甘露糖型N糖链的抗体或配体。
本发明发明人基于这样一个发现，即血清抗体中高甘露糖型N糖链的高水平与系统性红斑狼疮的发生有关，提出了血清抗体中高甘露糖型N糖链水平可作为系统性红斑狼疮的诊断标志，用于系统性红斑狼疮的早期诊断和/或预后评估，进而用于指导系统性红斑狼疮的治疗。
附图说明
图1是质谱检测正常个体和SLE病人血清抗体的N糖链；其中，A为正常个体血清抗体N糖链的一级质谱图，B为SLE病人血清抗体的N糖链一级质谱图。
图2是图1中m/z909.5峰所对应的糖链的二级质谱分析图。
图3是实施例1中所述三种高甘露糖型N糖链在10个SLE病人和10个正常对照的相对丰度比较；**表示p<0.001，***表示p<0.005。
图4是质谱检测正常小鼠和SLE小鼠血清抗体的N糖链；其中，A为正常小鼠血清抗体N糖链的一级质谱图，B为SLE小鼠血清抗体N糖链的一级质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，这些实施例仅用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
使用PNGase F酶试剂盒（IBL，德国），按照厂商提供的试剂盒说明书，提取血清抗体N糖链，并对血清抗体N糖链进行一级及多级质谱分析，其过程如下：
（1）收集SLE病人血清样本，2000r/min离心10min。
（2）取上清，以1mL血清加入3mL PBS缓冲液的比例进行稀释，逐滴加入饱和硫酸铵缓冲液，静置3h后，6000r/min离心。
（3）将步骤（2）获得的沉淀进一步经过sephadex G25脱盐，然后经过proteinG柱子进一步纯化抗体，冷冻干燥得血清抗体，并保存于-20℃备用。
（4）取500微克血清抗体置于离心管中，加入5微升10×变性剂、45微升超纯水，混匀，再煮沸10min，然后离心。
（5）冷却至室温，加入5微升10×G7缓冲液、5微升10%NP-40缓冲液，加入1微升PNGase F酶，于37℃下过夜。
（6）然后干燥样品，过SEP-C18柱。样品进一步经过真空干燥以后，冰浴下加入300微升新鲜配制的还原溶液——NaBH4溶液（10mg/ml in0.01NNaCl），室温下静置过夜。
（7）冰浴下，加入几滴乙酸终止反应，然后升温至室温，并加入3ml乙醇干燥样品。
（8）为了去除样品中的硼酸盐，分别、依次向上述干燥的样品中加入3ml下列试剂：a、1%乙酸：甲醇，b、甲苯，c、1%乙酸：甲醇，d、甲苯，e、1%乙酸：甲醇，重复进行加入试剂-干燥的步骤，最终得到的干燥样品即为从血清抗体中切割下来的糖链。
（9）用1ml水溶解切割下来的糖链。
（10）准备PGC预装柱（需要亲和层析装置），分别、依次向预装柱中加入下列试剂3ml：a）1M NaOH；b）HPLC水；c）80%ACN水溶液（内含0.1%TFA；d）25%ACN水溶液（内含0.05%TFA；e）25%ACN；f）水，进行洗柱；再6-8ml用水平衡柱子。
（11）向步骤（10）所得柱子上样步骤（9）所得样品，加入8-10ml水洗脱柱子，以去除杂质和盐分；然后加入3ml25%CAN洗脱下中性的糖链（如果洗脱的糖是酸性的，需要加3ml25%ACN水溶液（内含0.1%TFA））；真空干燥样品，加入甲醇溶解样品，进行一级质谱分析，所得一级质谱图如图1所示。
（12）将一级质谱分析中相对丰度较大的峰所对应的糖链，进行多级质谱结构鉴定，以确定所对应糖链的具体结构。
试验结果：
（1）经过多级质谱鉴定，图1中三个峰所代表的结构分别如下：
m/z909.5所代表的结构是H6N2（H为六碳糖，包括半乳糖和甘露糖，N代表葡萄糖胺），即含有葡萄糖胺2个，甘露糖6个；其二级质谱图如图2所示；
m/z1443的结构为H3N10，进一步可以鉴定为10个甘露糖，3个葡萄糖胺；其二级质谱图未显示；
m/z1446所代表的结构为H8N4F1（F为岩藻糖），进一步鉴定为6个甘露糖，2个半乳糖，4个葡萄糖胺，1个岩藻糖；其二级质谱图未显示。
此3种N糖都是高岩藻糖基化N糖，其具体的结构分别如表1所示。
表1、多级质谱鉴定出的三种N糖的结构
以上表1中，△代表岩藻糖，■代表葡萄糖胺，○代表半乳糖，●代表甘露糖。
（2）根据一级质谱图，采用Student-Newman-Keulsa,,b检验分析正常和SLE病人（各10例）血清抗体中三种N-糖的相对丰度数据，并使用GraphPadPrism5软件(GraphPad Software Inc.)进行统计分析，结果如图3所示。
图3结果显示：SLE病人血清抗体中的上述三种高甘露糖型N糖链的含量明显高于正常对照，其差异具有明显的统计学意义（p<0.001）。
实施例2
构建SLE小鼠模型：
购买6-8周龄的BALB/c小鼠于SPF级动物房内饲养，待环境稳定后，随机分成两组，每组5只。实验组（即SLE模型组）小鼠一次性腹腔注射pristane（购于sigma公司）0.5mL，而对照组小鼠一次性注射PBS0.5mL。注射前后每一周取一次血，采用ELISA等方法来检测anti-dsDNA，anti-sm RNP和anti-ribosomal PO抗体的含量，最终确定SLE小鼠模型构建的成功。
处理：饲喂6个月左右处死小鼠，并取血清保留以备用。按照实施例1中的方法，提取N糖链，经过一级及多级质谱检测，其一级质谱图如图4所示；对图4所示图谱中相对丰度较大的峰所对应的糖链进行多级质谱结构鉴定，以确定所对应糖链的具体结构，结果（未显示）发现：与人中的类似，图4中相对丰度较大的峰所对应的糖链也均为高甘露糖型N糖链。
按实施例1所述分析方法，对与正常小鼠差异表达的高甘露糖型N糖链的相对丰度进行统计学分析，所得结果与实施例1中的结果类似，即SLE动物模型中的血清抗体的高甘露糖型N糖链水平较正常组小鼠明显增高。
由实施例1、2结果可知，血清抗体的高甘露糖型N糖链的水平与系统性红斑狼疮的发生高度相关，因此，可将血清抗体的高甘露糖型N糖链的水平增高作为系统性红斑狼疮的诊断标志，用于系统性红斑狼疮的早期诊断、预后评估，并进一步指导疾病的治疗。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂在制备用于系统性红斑狼疮的诊断和/或预后评估的诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清抗体为血清IgG型抗体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述高甘露糖型N糖链为结构式分别如I、II和III所示糖链的任意一种或几种的混合物；
其中，结构式I为：
Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man-Man)Man-Man-Man；
结构式II为：
Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man)2(Man)2GlcNAc(Man)3(Man)2；
结构式III为：
Asn-GlcNAc(Fuc)-GlcNAc-Man-(Man)4(GlcNAc-Gal)(Man-GlcNAc-Gal)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过免疫测定法检测血清抗体中高甘露糖型N糖链的水平；
优选地，所述免疫测定法为酶免疫测定法、免疫比浊测定法、乳胶免疫凝集法、电化学发光法或荧光法；
更优选地，所述免疫测定法为酶联免疫吸附测定法。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂包括特异性识别高甘露糖型N糖链的抗体或配体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或抗原结合片段；优选地，所述抗体为鼠抗人单克隆抗体。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断工具为诊断试剂、试剂盒、蛋白芯片或免疫检测试纸。
8.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过质谱法检测血清抗体中高甘露糖型N糖链的相对丰度。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于，通过检测待测个体的血清抗体中高甘露糖型N糖链的水平，将其与相同检测条件下的正常个体的血清抗体中高甘露糖型N糖链水平相比的增高，诊断为患有系统性红斑狼疮。
10.一种系统性红斑狼疮的诊断工具，其特征在于，包括特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂；
优选地，所述诊断工具为诊断试剂、试剂盒、蛋白芯片或免疫检测试纸；
优选地，所述特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂为特异性识别高甘露糖型N糖链的抗体或配体。
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