CN104651299A

CN104651299A - 源于人单性生殖胚泡的患者特异性干细胞系

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Publication number: CN104651299A
Application number: CN201510018547.9A
Authority: CN
Inventors: E·S·列瓦泽瓦; N·A·图罗文茨; L·N·库兹米切夫; J·D·贾纳斯
Original assignee: International Stem Cell Corp
Current assignee: International Stem Cell Corp
Priority date: 2007-04-06
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2028-04-07
Also published as: CN104651299B; AU2008236638A1; CA2683060C; CN101715485A; EP2155861A4; US9920299B2; US20080299091A1; CA2683060A1; JP2010525794A; EP2155861A1; US20160186133A1; RU2009140974A; WO2008124142A1; IL201384A; RU2511418C2; IL201384A0; EP2155861B1

Abstract

本发明公开从HLA纯合和HLA杂合供体产生HLA纯合单性生殖人干细胞(hpSC-Hhom)系的方法。这些hpSC-Hhom系显示典型的人胚胎干细胞形态学，表达适当的干细胞标记物并具有高水平的碱性磷酸酶和端粒酶活性。另外，将这些细胞系注射到免疫缺陷动物导致畸胎瘤形成。而且，在HLA杂合供体的情况下，hpSC-Hhom系只从供体亲本之一遗传单元型。SNP数据分析表明：通过单核苷酸多态性(SNP)分析评估，源于HLA杂合卵母细胞供体的hpSC-Hhom系是整个基因组纯合的。本发明公开的方法将源自动物的组分的应用减到最少，其使干细胞可更实际地进行临床应用。

Description

源于人单性生殖胚泡的患者特异性干细胞系

本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年04月07日，申请号为200880018767.X(PCT/US2008/004529)，发明名称为“源于人单性生殖胚泡的患者特异性干细胞系”。

技术领域

本发明一般性地涉及胚胎干细胞，以及更具体地涉及获得HLA纯合单性生殖人干细胞系进行基于细胞的治疗的方法。

背景技术

最初的人胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)源于获自受精卵母细胞的胚泡内细胞团(inner cell mass，ICM)，其能够无限分裂并分化成所有组织类型的细胞。胚胎干细胞是多能细胞的潜在的无限来源，所述多能细胞用于基于移植的细胞治疗。

人胚胎干细胞(ES)细胞是多能细胞，其可分化成大量细胞类型。当注射到免疫缺陷鼠中时，胚胎干细胞形成分化的肿瘤(畸胎瘤)。但是，被体外诱导以形成胚状体(embryoid bodies，EBs)的胚胎干细胞提供了胚胎干细胞系的来源，其在某些生长条件下被控制分化成表征几种组织的多种细胞类型。例如，在神经生长因子和视黄酸存在的情况下，ES细胞分化成神经元。

如果免疫排斥的问题可以解决，则人胚胎干细胞具有给予患者显著治疗益处的潜能。与受体(recipient)遗传相关的胚胎干细胞可克服这些排斥问题。目前，人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hES)源于三种来源：不育治疗后剩余的并捐赠用于研究的胚泡，从捐赠的配子(卵母细胞和精子)产生的胚泡，以及核移植(nuclear transfer，NT)的产物。死胎组织是人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells，hEG)的唯一来源。hES和hEG细胞提供显著的科学和治疗可能性，其涉及产生更专一化的细胞或组织的潜能。但是，有关hES和hEG细胞的来源的伦理关注，以及用NT进行研究会导致用NT产生人类的担心，已引发了大量的公众讨论和辩论。

哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化(parthenogeneic activation)可作为对通过精子受精/NT的替代而应用，以便制备用于胚胎干细胞产生的卵母细胞。单性生殖活化是在缺乏来自雄性配子的任何贡献的情况下，从雌性配子产生胚胎细胞，其最终发育为成体或不最终发育为成体。

与SCNT相比，卵母细胞的单性生殖活化是产生组织相容性干细胞的相对简单的方法，原因在于它不需要显微操作卵母细胞所需的复杂设备。单性生殖干细胞从未受精的卵母细胞产生并且含有卵母细胞供体(潜在患者)专有的遗传物质。进一步，在定向细胞分化后，自体细胞可被移植而没有免疫排斥的威胁。单性生殖小鼠MHC-纯合干细胞系和一种单性生殖灵长类动物杂合胚胎干细胞系(Cyno-1)已被得到并且在这些细胞系中已表明细胞多能性。

如上所述，同种异体组织和器官移植造成的最大风险是免疫排斥。风险的程度与供体和受体细胞表面抗原递呈蛋白之间的差异程度成比例。在理想的移植中，在主要组织相容性复合物(MHC)方面，供体组织与受体是组织相容的。人白细胞抗原(HLA)系统是命名人MHC的术语，并且代表对移植重要的抗原。HLA抗原匹配的供体和受体组织降低在受体中细胞毒性T-细胞应答的机会，以及因此大大增加移植物存活的可能性。

MHC I类和II类HLA单元型是共同遗传自亲本的特定组的HLA-A、-B、-DR基因座等位基因。尽管存在高度HLA多态性，但是在美国高加索人群中仅存在200个共有HLA单元型。这种HLA多样性与杂合选择系数组合，意味着发现供体-受体匹配的机率范围是一千分之一至几百万分之一，其原因在于在杂合个体中由这些等位基因变体的组合提供的独特的组织类型。

基于移植的干细胞治疗面临相同的HLA匹配问题，所述问题由于免疫排斥而限制了实体器官同种异体移植。HLA-匹配干细胞系可克服免疫排斥的风险。对于单性生殖来源的细胞，HLA杂合细胞系通过使用A23187和6-DMAP的组合激活卵母细胞而得自HLA杂合供体。由于这些细胞与卵母细胞供体是HLA-匹配的，它们提供组织-匹配衍生物的能力受到限制。

如果供体细胞是HLA纯合的，即，含有相同的每种抗原递呈蛋白的等位基因，则供体和受体之间的MHC相容性显著增加。而且，如果纯合供体细胞具有在群体中被高频率发现的单元型，则这些细胞在大量个体的基于移植的干细胞治疗中可具有用途。

发明内容

本发明公开从HLA纯合和HLA杂合供体产生HLA纯合单性生殖人干细胞(hpSC-Hhom)系的方法。这些hpSC-Hhom系显示人胚胎干细胞形态学，表达典型的干细胞标记物(即，SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81以及OCT-4)并具有高水平的碱性磷酸酶和端粒酶活性。另外，将这些细胞系注射到免疫缺陷动物中导致畸胎瘤形成。SNP数据分析表明，源于HLA杂合卵母细胞供体的hpSC-Hhom系的整个基因组是纯合的。所公开的方案将源自动物组分的应用减到最少，其使这些干细胞理想地适合于临床用途。

在一个实施方式中，公开了源于单性生殖胚泡的分离的人干细胞系，其中构成该细胞系的至少一个细胞对于一个或更多个单核苷酸多态性(SNPs)而言是杂合的，对于一个或更多个HLA等位基因而言是纯合的，或包括纯合和杂合SNPs的组合。

一方面，至少一个细胞对于HLA等位基因而言是纯合的。另一方面，至少一个细胞在被移植到无免疫应答小鼠中时形成畸胎瘤。在进一步的方面，至少一个细胞与胚泡供体是MHC相容的。

在一个相关方面，至少一个细胞与胚泡供体的一级血亲是MHC相容的，其包括至少一个细胞按照供体来源被实质上遗传印记。

一方面，至少一个细胞(i)将在体外培养中增殖一年以上，(ii)在整个培养中保持分化为内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，以及(iii)当在成纤维细胞饲养层上培养时被抑制分化。

另一方面，至少一个细胞分化成下列细胞，包括：神经元细胞、心脏细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、以及少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、角化细胞、胰岛细胞、淋巴前体细胞、肥大细胞、中胚层细胞以及内胚层细胞。在一个相关方面，至少一个细胞不具有形成存活生物体的能力。

在另一个实施方式中，公开了治疗需要该治疗的对象的方法，其包括施用包括分化细胞的细胞组合物，其中所述分化的细胞得自源于单性生殖胚泡的干细胞系，其中构成所述细胞系的至少一个细胞对于一个或更多个单核苷酸多态性(SNPs)而言是杂合的，对于一个或更多个HLA等位基因而言是纯合的，或包括纯合和杂合SNPs的组合。

一方面，对象患有疾病，所述疾病包括：帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏症、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉萎缩症、囊性纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、黄斑变性、软骨缺陷或损伤、烧伤、足部溃疡、血管疾病、尿路疾病、AIDS以及癌症。

在一个实施方式中，公开了干细胞库，其包括自体或同种异体(allogenic)干细胞，其中所述干细胞源于来自一个或更多个人供体的单性生殖活化的卵母细胞，以及其中所述干细胞是HLA纯合干细胞。一方面，根据单核苷酸多态性(SNP)标记物，每个库成员被鉴定为全同胞、半同胞或不相关。另一方面，每个库成员根据HLA-型进行表征，并且所述库成员与用于治疗用途的潜在受体是HLA-匹配的。

另一方面，卵母细胞供体与库成员是组织相容的。在一个相关方面，库成员根据卵母细胞供体来源被基因组印记，其包括库的干细胞可源于HLA杂合卵母细胞供体。在进一步的方面，库中的每个成员对于不同于其它库成员的MHC/HLA等位基因组合而言是纯合的。

一方面，库中的每个成员是至少一个或更多个HLA I类基因和HLAII类基因纯合的。在一个相关方面，HLA I类基因包括HLA A*、HLA B*、HLA以及Cw*单元型组合。在另一个相关方面，HLA II类基因包括HLA DRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQA1*以及DQB1*单元型组合。

在另一个实施方式中，公开了产生HLA纯合干细胞的方法，其包括：筛选卵母细胞供体，寻找在给定群体中常见的HLA-单元型；在体外受精(IVF)培养基中温育人中期II卵母细胞；在包括离子载体的IVF培养基中温育细胞；在包括嘌呤霉素的IVF培养基中温育细胞；以及在新鲜的IVF培养基中温育细胞，其中一个或更多个温育在不同O₂张力下进行，并且其中获自细胞的内细胞团(ICM)产生可培养的干细胞。

根据本发明的示例性方法和组合物在下文更详细地描述。

附图说明

图1显示phESC系的特征性特异性标记物。在人饲养层细胞上phESC的未分化集落(A-F)，SSEA-1阴性染色(G-L)，细胞表面标记物SSEA-3(M-R)、SSEA-4(S-X)的表达。放大倍数：(A)至(E)100倍，(F)200倍，(G)至(X)400倍。在饲养细胞上phESC集落的碱性磷酸酶阳性染色(A-F)、OCT-4(G-L)、TRA-1-60(K-R)和TRA-1-81(S-X)。放大倍数：(A、B、O、R)100倍，(C-F、M、S、X)200倍，(G-L、N、P、Q、T-W)400倍。

图2显示，phESC表明与阳性对照细胞相比高水平的端粒酶活性：“+”-来自500个细胞的提取物；“-”-热处理的细胞提取物，端粒酶失活；“对照+”-端粒酶阳性细胞提取物(应用TRAPEZE试剂盒)；“B”-CHAPS裂解缓冲液，引物-二聚体/PCR污染对照；TSR8-端粒酶定量对照模板(0.1和0.2amole/μl)；“M”-标记，DNA梯形条带。

图3显示phESC系的G-带核型分析。phESC-1(A)、phESC-3(B)、phESC-4(C)、phESC-5(D)和phESC-6(E)系具有正常的46，XX核型。phESC-7系具有47，XXX核型(F)。

图4显示将phESC体外分化为所有三个胚层的衍生物。外胚层分化通过神经元特异性标记物神经丝68(A)、NCAM(B)、βIII微管蛋白(C)和神经胶质细胞标记物GFAP(D,M)的阳性免疫细胞化学染色来显示。分化的细胞对于下列中胚层标记物是阳性的：肌肉特异性α-辅肌动蛋白(G)和结蛋白(J)、内皮标记物PECAM-1(E)和VE-钙粘蛋白(F)。内胚层分化通过α-胎蛋白(H,L)阳性染色来显示。phESC产生色素上皮-样细胞(I,K)。放大倍数：(I)100倍，(A-H,J-M)400倍。

图5显示在SCID小鼠中phESC的体内分化和畸胎瘤形成。对三个胚层的标记物进行免疫荧光染色。中胚层细胞标记物肌肉肌动蛋白围绕其它成分进行组织并且可清晰鉴别(A)。纤维连接蛋白以较高量存在对于中胚层来源的结缔组织具有特异性(B)。神经分化细胞(外胚层来源)区域是广泛的并用β微管蛋白抗体进行强烈标记(C)。不成熟的内胚层细胞标记物α-胎蛋白可在腺体外观的区域找到(D)。用DAPI对细胞核染色-(A)、(D)。放大倍数：(A)、(C)、(D)，100倍；(B)200倍。

图6显示印记基因表达的RT-PCR分析。来自丢弃IVF胚胎的两个hESC系hES1和hES2用作在下列phESC系中父本表达的基因SNRPN和PEG1_2以及母本表达的基因TSSC5和H19的表达分析的阳性对照：phESC-1；phESC-3；phESC-4；phESC-5；phESC-6和phESC-7(分别为1、3、4、5、6以及7)。PEG1_1基因是双等位基因表达的并用作另外的对照。包括GAPDH作为mRNA定量对照。RT-数据表明RT样本没有基因组污染。

图7显示hpSC-Hhom系的特异性标记物特征。来自所有四种hpSC-Hhom系的细胞表明SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、OCT-4(用DAPI进行细胞核染色)、碱性磷酸酶阳性染色，以及SSEA-1阴性染色。小鼠胚胎干细胞(ESC)用作SSAE-1染色的阳性对照。

图8显示，hpSC-Hhom系表明与阳性对照细胞相比高水平的端粒酶活性：“Kl+”-端粒酶阳性细胞提取物(应用TRAPEZE试剂盒)；“K2+”-来自500个细胞的提取物；“K-”或“-”-热处理的细胞提取物，端粒酶失活；Buf-CHAPS裂解缓冲液，引物-二聚体/PCR污染对照；TSR-端粒酶定量对照模板(0.1和0.2amole/μl)；“M”-标记物，DNA梯形条带。

图9显示人HLA纯合单性生殖干细胞系的G-带核型分析：hpSC-Hhom-1(A)和hpSC-Hhom-4(B)系具有正常的46，XX核型；hpSC-Hhom-2(C)系的15％细胞具有47，XX，+8核型-染色体8的非整倍性；hpSC-Hhom-3(D)系的4.2％细胞具有47，XX，+1核型-染色体1的非整倍性。

图10显示hpSC-Hhom-4体外分化成来自所有三个胚层的衍生物：外胚层分化是明显的，因为神经元特异性标记物神经丝68(A)和NCAM(B)是免疫细胞化学染色阳性的；内胚层分化是明显的，因为α-胎蛋白(C)的染色是阳性的；分化的细胞是中胚层标记物肌肉特异性结蛋白(D)和α-辅肌动蛋白(E)阳性的；放大倍数200倍(A-E)。

图11显示hpSC-Hhom-4的体内分化。SCID小鼠中的畸胎瘤形成。来自所有三个胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的衍生物：由间充质细胞包绕的充分形成的呼吸型腺体，苏木精/伊红(h/e)染色，放大倍数140倍(A)；可能的具有单层细胞的神经管，右侧为内胚层腺体和底部为软骨-分化，h/e染色，放大倍数70倍(B)；由间充质细胞包绕的骨骼，中心是具有立方上皮的管状腺，picrofucsin染色，放大倍数140倍(C)；充分形成的由间充质细胞包绕的骨骼和脂肪组织，h/e染色，放大倍数140倍(D)；左侧是内胚层腺体、中胚层和脂肪组织、胶原，骨骼见于右侧和底部，Kraberg染色，放大倍数70倍(E)；由间充质细胞包围绕的内胚层腺体结构，胶原纤维大量产生，Van Gieson染色，放大倍数280倍(F)；复层上皮，中心为角化过度的珠状物(pearl)，左侧为另一个腺体，h/e染色，放大倍数140倍(G)；腺体集落，h/e染色，放大倍数70倍(H)；含有产生褐色色素——可能为胆汁色素——的细胞的腺体，由脂肪组织和间充质细胞包绕，h/e染色，放大倍数140倍(I)。

具体实施方式

在描述本发明的组合物、方法以及培养方法学之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体组合物、方法以及实验条件，因为这些组合物、方法以及条件可变化。还应理解的是，本文所使用的术语目的仅在于描述具体实施方式，而不意图进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书来限制。

如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“该方法”包括一种或更多种方法，和/或本文描述类型的步骤，其在本领域技术人员阅读本公开内容等时将成为显而易见的。

本发明公开用于获得人HLA纯合单性生殖干细胞系的至少两种不同方法，所述细胞系用于基于移植的干细胞治疗。

在一个实施方式中，一个细胞系源于HLA纯合供体，其包括在卵母细胞活化过程中使用A23187和6-DMAP，阻止第二极体的挤出，从而保留MII卵母细胞的所有遗传物质。源于这些卵母细胞的干细胞的HLA基因型与供体的HLA基因型匹配(Revazova等,Cloning StemCells(2007)9(3):432-449)。在一个相关方面，也可获得来自HLA纯合供体的二倍体hpSC-Hhom-1系。

在另一个实施方式中，HLA纯合胚胎干细胞可源于HLA杂合卵母细胞供体，其包括使用A23187和嘌呤霉素的组合将卵母细胞单性生殖活化，其允许第二极体挤出。因此，活化的卵母细胞只含有一套中期II染色体的一半，其允许形成纯合基因型。例如，由钙离子载体和嘌呤霉素的组合活化的人卵母细胞的80％显示前核，第二极体挤出。进一步，细胞遗传分析表明，78％含有一套正常单倍染色体(Yamano S.等,J MedInvestigation(2000)47(1-2):1-8)。此外，用A23187和嘌呤霉素活化的人卵母细胞显示一个前核和两个极体，具有一套单倍染色体(Nakagawa K.等,Zygote(2001)9:83-88)。这种具有一套正常单倍染色体的前核单性生殖体已在小鼠模型中发育(Nakasaka H.等,Zygote(2000)8:203-208)。

使用这种方法从分离自HLA杂合供体的卵母细胞产生多个二倍体细胞系(例如但不限于hpSC-Hhom-2、hpSC-Hhom-3、hpSC-Hhom-4)。

尽管不被理论所束缚，但HLA基因型分型数据表明，HLA单元型排他性地从供体亲本之一遗传。SNP分析数据表明，这三种细胞系是整个基因组纯合的，如SNP分析所评估。例如，本发明中公开的示例性细胞系(参见实施例1)具有二倍体核型，这对应于其中二倍体干细胞系源于单倍体小鼠胚胎的早期工作(Kaufman等,J Embryol ExpMorphol(1983)73:249-261)。

卵母细胞活化后单倍体遗传物质复制的准确机制和时间是不清楚的，但是，尽管不被理论所束缚，DNA复制看起来在不存在细胞卵裂或分裂的情况下发生。在先研究表明，80％的单性生殖活化的小鼠卵母细胞保持它们的单倍体状态直到桑椹胚期，随后的源于这些胚胎的干细胞系成为二倍体(Kaufman M.H.等,1983,上文)。

除了替代疗法之外，源于hpSC-Hhom系的细胞和组织的储存在遗传疾病治疗中可具有无法衡量的价值。根据约翰霍普金斯大学(JohnHopkins University)在线人类孟德尔遗传数据库(the Online MendelianInheritance in Man，OMIM)和美国国立生物技术信息中心(the NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)，存在多于100种遗传疾病，这一目录持续扩展。实例包括阿尔茨海默氏症、糖尿病、Graves症(突眼性甲状腺肿)、血友病、亨廷顿氏症、肌肉萎缩症、帕金森氏症、镰状细胞贫血症、苯丙酮尿症-PKU和重度联合免疫缺陷病(SCID)。在这些情况中，使用获自不携带相同遗传缺陷的供体的细胞系会是重要的。

“分化”是指发生在细胞中的变化，所述变化使那些细胞呈现某些特化的功能以及失去变化成某些其它特化的功能单元的能力。能够分化的细胞可以是全能细胞、多能(pluripotent)细胞或多能性(multipotent)细胞中的任意。分化相对于成熟的成体细胞可以是部分的或完全的。

“单雌生殖(Gynogenesis)”是指在细胞活化后导致产生包含可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎，所述细胞例如卵母细胞或其它胚胎细胞类型，包括全部雌性来源的哺乳动物DNA，优选人类雌性来源，例如人类或非人类灵长动物卵母细胞DNA。这种雌性哺乳动物DNA可以通过例如至少一个DNA序列的插入、缺失或取代被遗传修饰，或可以未被修饰。例如，DNA可以通过插入或缺失期望的编码序列，或促进或抑制胚胎发生的序列被修饰。一般地，这样的胚胎将通过体外激活包含全部雌性来源DNA的卵母细胞而获得。单雌生殖包含在下面所定义的单性生殖中。它还包括其中精子的DNA没有贡献于被激活卵母细胞中的DNA的激活方法。

在一个相关的方面，卵母细胞从制备用于IVF的超排卵(superovulating)对象获得。用于IVF中的“超排卵”技术，如用激素处理雌性对象，被设计成刺激卵巢产生几个卵(卵母细胞)，而不是如在自然周期中通常的一个卵。

促进卵产生所需要的药物治疗可包括但不限于下列：醋酸亮丙瑞林(Lupron)(促性腺素释放激素激动剂)、Orgalutran、Antagon或西曲肽(Cetrotide)(促性腺素释放激素拮抗剂)、Follistim、Bravelle或果纳芬(Gonal-F)(FSH，促卵泡激素)、Repronex(FSH和LH的组合，促黄体激素)、和波热尼乐(Pregnyl)或Novarel(hCG，人绒毛膜促性腺素)。

在一个相关方面，在经阴道超声指引下可以进行卵的收集。为完成这一过程，应用超声将针通过阴道壁插入(例如，在IV镇静下)到卵巢中以定位每一个卵泡。卵泡液被抽到试管中以取得卵。

通过“单性生殖(Parthenogenesis)”(“单性生殖激活(parthenogenicallyactivated)”和“单性生殖激活(parthenogenetically activated)”被交换使用)过程，卵母细胞的激活在缺少精子穿入下发生，并且其是指包含滋养外胚层和内细胞团的早期阶段胚胎的发育，所述胚胎通过激活包含全部雌性来源DNA的卵母细胞或胚胎细胞例如卵裂球而获得。在一个相关方面，“单性生殖体”是指通过这种激活得到的所得细胞。在另一相关方面，“胚泡”是指分裂阶段的受精或激活的卵母细胞，其包含由外滋养层细胞和内细胞团(ICM)组成的中空细胞球。在又一相关方面，“胚泡形成”是指在卵母细胞受精或激活之后的过程，其中随后卵母细胞在培养基中被培养一段时间，所述时间能够使其发育成由外滋养层细胞和ICM组成的中空细胞球(例如，5到6天)。

在一个实施方式中，公开了通过单性生殖激活的卵母细胞产生克隆人类胚胎干细胞系的方法。虽然单性生殖在自然界中不是罕见的繁殖形式，但不知道哺乳动物能够进行这种繁殖形式。然而，在雌性近交系小鼠LT/Sv的卵母细胞中，可以发现比例为10％的自发单性生殖(Hoppe和Illmensee,Proc Natl Acad Sci USA(1982)79:1912-1916)，并且自发单性生殖也解释了人类葡萄胎的形成(Berkowitz和Goldstein,NewEng J Med(1990)335(23):1740-1748)。有胎盘哺乳动物的卵母细胞能够被诱导进行体外单性生殖；但是，胚胎发育是不成功的。

单性生殖激活哺乳动物卵母细胞和将激活的卵母细胞转移进入代理母亲之后，具有有限的胚胎存活：小鼠为10天；羊为21天；猪为29天；兔为11.5天(Kure-bayashi等，Theriogenology(2000)53:1105-1119；Hagemann等，Mol Repord dev(1998)50:154-162；Ozil和Huneru，Development(2001)128：917-928；Surani和Barton,Science(1983)222:1034-1036)。这种发育停滞的原因可能是由于遗传印记(genetic imprinting)。已经显示，母亲与父亲的基因组是表观遗传上不同的(epigentically different)并且这两组对于成功的胚胎发育都是必需的(Surani,Cell(1998)93:309-312；Sasaki等,(1992)6:1843-1856)。虽然不限于理论，但在单性生殖体中，所有的遗传物质应该是母系来源，因此应当缺少父系印记。父系印记被认为负责胚外(extra-embryo)组织发育，因此负责去核卵母细胞受精之后滋养层组织发育(Surani和Barton，(1983)，见上文)。因此，在动物中，去核的受精卵对于核转移和随后的单性生殖激活可以是有用的。

哺乳动物单性生殖体仅仅经历有限的发育，胚胎最终死亡。在食蟹猴(Macac fascicularis)中，体外单性生殖激活之后的中期II阶段卵母细胞中的仅仅14％在培养8天之后发育到胚泡阶段(Vrana等,Proc Natl AcadSci USA(2003)100(Suppl 1):11911-11916)。

在LT/Sv近交系小鼠的未交配雌性中，以自发激活单性生殖体形成的胚胎在几天内死亡。当从包含这些胚胎的内细胞团(ICM)的细胞进行核转移到受精的去核C57BL/6j小鼠卵母细胞中时，得到具有LT/Sv基因组的克隆小鼠(Hoppe和Illmensee,Proc Natl Acad SciUSA(1982)79:1912-1916)。因此，受精卵母细胞的使用允许单性生殖体的足月发育。在一方面，受精的去核人卵母细胞能够被用于支持包含供体细胞核的单性生殖胚胎的发育，直到胚泡阶段。

“多能细胞”是指来自通过激活包含全部雌性或雄性来源DNA的细胞而产生的胚胎的细胞，其可以在未分化状态下在体外保持长期时期、理论上为无限的时期，其可以产生不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层、和内胚层。细胞的多能状态优选地通过在合适条件下培养内细胞团或来自胚胎的内细胞团的细胞而保持，所述胚胎由雄核发育或雌核发育方法产生，所述条件例如，通过在成纤维细胞饲养层或其它饲养层或包含白血病抑制因子(LIF)的培养物上培养。这种培养细胞的多能状态可以通过多种方法确认，例如，(i)确认表征多能细胞的标志物的表达；(ii)包含表达多能细胞基因型的细胞的嵌合动物的产生；(iii)将细胞注入到动物例如SCID小鼠中，在体内产生不同的分化细胞类型；以及(iv)在体外，观察到细胞分化(例如，当在缺少饲养层或LIF下培养时)为胚状体和其它分化细胞类型。

“二倍体细胞”是指细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有全部雄性或雌性来源的二倍DNA内容物。

“单倍体细胞”是指细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有单倍DNA内容物，其中单倍DNA是全部雄性或雌性来源。

激活是指一种过程，其中例如——但不限于此，在减数分裂中期II中，受精或未受精卵母细胞进行这样的过程：所述过程一般包括染色单体对的分离，第二极体挤出，产生具有单倍数目染色体的卵母细胞，每一染色体具有一条染色单体。激活包括这样的方法，通过该方法，包含全部雄性或雌性来源DNA的细胞被诱导发育成具有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎，这对于产生多能细胞是有用的，但其本身可能不能发育成存活的后代。例如，激活可以在下面的一种条件下进行：(i)不引起第二极体挤出的条件；(ii)引起极体挤出但其中极体挤出被抑制的条件；或(iii)抑制单倍体卵母细胞第一次细胞分裂的条件。

“中期II’是指细胞发育的一个阶段，其中细胞的DNA内容物由单倍数目染色体组成，每一染色体由二条染色单体表示。对于本发明，人中期II卵母细胞单性生殖活化后的第二减数分裂的抑制和二倍体胚胎的产生导致MHC-杂合phESC的获得。

通常，哺乳动物输卵管和子宫中的氧张力远小于在正常大气中发现的氧张力的一半(Fischer和Bavister,J Reprod Fertil(1993)99:673-679；Kaufman等,Comp.Biochme Physiol Comp Physiol(1994)107:673-678)。对于IVF后人胚胎的成功培养，已使用20％以及5％的氧浓度。但是，增加的氧可产生可诱导凋亡的活性氧种类(Van Soom等,Theriogeology(2002)57:1453-1465)。已报道，低氧浓度增加植入前胚胎的存活性，帮助它们的正常发育并给予健康胚泡形成的较高发生率，其通过更多细胞数量和内细胞团(ICM)的良好形成显示(Dumoulin等,Hum Reprod(1999)14:465-469)。在以往的研究中，使用具有高(20％)氧含量的气体混合物，人单性生殖胚胎在体外发育(Lin等,Stem Cell(2003)21:152-161；Cibelli等,J Reg Med(2001)2:25-31)。

在一个实施方式中，ICM分离和phESC培养的方法包括使用人皮肤成纤维细胞，以及细胞用人脐带血清(HUCBS)而不是用动物血清繁殖并将它们用做饲养细胞。phESC系的衍生和培养可在为hESC培养设计的VitroHES培养基(Vitrolife)中添加HUCBS进行。例如，在hESCs产生中使用HUCBS具有对ICM生长和phESC繁殖的正效应(例如，添加HUCBS与缺乏HUCBS相比，在VitroHES培养基中的phESC生长更好)。进一步，与免疫外科和胰蛋白酶处理相比，通过从滋养外胚层生长的机械剪切从全胚泡中分离ICMs显示为更温和与优选的方法。此外，该方法允许与动物衍生试剂之间相互作用的排除。

虽然本发明的phESC系显示hESC系表现出的一般特征，但是它们也显示独特的特征，其包括实际上与卵母细胞供体的基因型相同的基因型，如见于单性生殖衍生的猴ES细胞系Cyno-1(Vrana等,2003,ProcNatl Acad Sci USA(2003)100:11911-11916)。同样地，与SCNT比较，从单性生殖胚胎产生hESC系可以是产生MHC-匹配的和可能组织相容的胚胎干细胞的较好方法。

如小鼠和猴单性生殖干细胞的以往研究已显示的，这些细胞可形成畸胎瘤，其具有来自所有三个胚层的衍生物(Lin等,2003,见上文；Vrana等,见上文)。在选择性培养条件下，猴单性生殖胚胎干细胞已分化成神经细胞和功能性的多巴胺能和5-羟色胺能神经元(Vrana等,2003,见上文)。本发明的phESC也可体外和体内分化成所有三个胚层的衍生物并且是多能性的。此外，来自phESC的胚状体能够产生搏动的心肌细胞样细胞。

本发明表明产生单性生殖人胚胎干细胞的方法，其中实验性数据显示，phESC可分化成在治疗人类变性疾病中可具有重大价值的功能性细胞。

在一个实施方式中，中期II卵母细胞在不同的O₂张力气体环境下通过温育卵母细胞而激活。在一个相关方面，低O₂张力气体环境由包含大约2％、3％、4％、或5％的O₂浓度的气体混合物产生。在进一步相关的方面，气体混合物包含大约5％CO₂。进一步地，气体混合物包含大约90％N₂、91％N₂或93％N₂。这种气体混合物区别于含有5％CO₂的空气，其大约有约5％CO₂、20％O₂和75％N₂。

“O₂张力”是指在流体(例如，液体或气体)中的氧气的分压(气体混合物的单一成分施加的压力)。低张力是当氧分压(pO₂)低时的情况，高张力是当pO₂高时的情况。

“确定成分培养基条件”是指培养细胞的环境，其中详细描述了最佳成长所需要的其中成分的浓度。例如，取决于细胞的用途(例如，治疗应用)，从包含异种蛋白质的条件中取出细胞是重要的；即，培养条件是无动物条件或无非人动物蛋白质。在一个相关方面，“体外受精(IVF)培养基”是指包含受精卵母细胞能够在其中或其上成长的化学限定物质的营养系统。

“胞外基质(ECM)基底(Extracellular matrix substrate)”是指支撑最佳生长的细胞下的表面。例如，这种ECM基底包括但不限于：Matrigel、层粘连蛋白、明胶和纤连蛋白基底。在一个相关方面，这样的基底可以包括胶原蛋白IV、巢蛋白，肝素硫酸盐蛋白聚糖，包括不同的生长因子(例如，bFGF、表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、血小板衍生生长因子、神经生长因子和TGF-β-1)。

“胚胎(Embryo)”是指细胞激活产生的胚胎，所述细胞例如，卵母细胞或包含所有雄性或雌性来源DNA的其它胚胎细胞，其可以任选地被修饰，其包括可辨别的滋养外胚层和内细胞团，其不能产生存活的后代并且其中DNA为全部雄性或雌性来源。内细胞团或其中包含的细胞对于如前面所定义的多能细胞的产生是有用的。

“内细胞团(ICM)”是指产生胎儿组织的胚胎内部部分。在本文中，这些细胞被用于在体外提供多能细胞的持续来源。而且，ICM包括从雄核发育或雌核发育得到的胚胎的内部部分，即，包含所有雄性或雌性来源DNA的细胞激活后得到的胚胎。例如，这种DNA将是人DNA，例如，人类卵母细胞或精子DNA，其可以被遗传修饰或可以不被遗传修饰。

“滋养外胚层”是指产生胎盘组织的早期胚胎的另一部分，包括从雄核发育或雌核发育得到的胚胎的组织，即，包含所有雄性或雌性来源例如人类卵巢或精子的DNA的细胞激活得到的胚胎。

“分化细胞”是指具有特定分化状态即非胚胎状态的非胚胎细胞。三种最早分化的细胞类型是内胚层、中胚层和外胚层。

“实质上相同的”指关于特定特征的性质相同，其如此相近以至于在测量差异(例如，通过HLA分型、SNP分析和类似方法)能力内基本上相同。

“组织相容的”是指生物体耐受外来组织移植的程度。

“基因组印记”是指这样的机制，通过该机制，基因组中的许多基因根据它们的亲本来源被单等位基因地表达。

“同型异源性”，包括其语法上的变化，是指在细胞或个体中存在相同类型的线粒体DNA(mtDNA)。

“异质性”，包括其语法的变化，是指在细胞或个体中存在一种以上类型的线粒体DNA(mtDNA)的混合物。

“单亲的”是指一个或更多个细胞或个体，另一细胞或个体从其中产生并且对其保持次生性(subsidiary)。

“机械地分离”是指通过物理力分离细胞集合体的过程。例如，这种过程将排除可能含有非人物质的酶(或其它细胞分裂产品)的应用。

在天然环境中，来自卵巢的未成熟卵母细胞(卵)经历成熟过程，其导致通过减数分裂进展到减数分裂中期II。随后卵母细胞停滞在中期II。在中期II中，细胞的DNA内容物由单倍数目的染色体组成，每个染色体由二条染色单体表示。

这样的卵母细胞可以通过冷藏被无限保存，例如通过用糖显微注射，但不限于此。

在一个实施方式中，提供了从冷藏的卵母细胞或单性生殖体产生人类干细胞的方法，包括：向卵母细胞或单性生殖体的细胞质中显微注射冷藏剂，冷冻卵母细胞或单性生殖体到低温温度使它进入休眠状态，在休眠状态下储存卵母细胞或单性生殖体，解冻卵母细胞或单性生殖体，在高O₂张力下在离子载体存在下单性生殖激活卵母细胞，随后在低O₂张力下使卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触，培养激活的卵母细胞或单性生殖体直到胚泡形成，从胚泡分离内细胞团(ICM)，和在人饲养细胞层上培养ICM细胞，其中培养ICM细胞在高O₂张力下进行。

在一方面，如所述取得的卵母细胞被转移到改良型、等张的IVF——其被胚胎测试矿物油(Sigma)覆盖，或任何其它适合的培养基中。如果期望，卵母细胞可以用与计划进行显微注射的量浓度相同的细胞外糖温育。例如，为注入0.1M糖，卵母细胞可以在DMEM/F-12中用0.1M糖平衡。在一方面，冷藏剂包含比标准DMEM低的Na⁺浓度(即，低Na⁺介质(media))。在一相关方面，冷藏剂包含比标准DMEM更高的K⁺浓度(即，高K⁺)。在另一相关方面，冷藏剂包含比标准DMEM更低的Na⁺和更高的K⁺浓度(即，低Na⁺/高K⁺介质)。在一方面，冷藏剂包括有机缓冲剂，包括但不限于HEPES。在另一方面，冷藏剂包括抑制凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)的部分。

可选地，卵母细胞可以任选地用任何其它实质上不可渗透的溶质例如NaCl平衡，以在显微注射之前降低它们的细胞体积。相对于在显微注射之前没有在高渗介质中温育的卵母细胞，细胞体积的这种最初的降低可以导致较小最终体积的显微注射卵母细胞。这种较小最终体积可以最小化卵母细胞膨胀引起的任何可能的负面影响。用于制备显微注射的细胞的这种一般程序也可以用于其它细胞类型(例如，激活的卵母细胞、hES细胞和类似细胞)。

随后卵母细胞用冷藏剂显微注射。显微注射设备和程序在本领域被充分表征，并且已知用于注射小分子到细胞中的显微注射设备可以在本发明中使用。在示例性显微注射步骤中，卵母细胞可以在10psi压力下被显微注射30毫秒。另一个标准显微注射技术的实例为由Nakayama和Yanagimachi描述的方法(Nature Biotech.16:639-642,1998)。

可用于该方法的冷藏剂包括具有低温保护性质和一般不可渗透的任何化学物质。具体地，冷藏剂可以包括单独的糖或糖与其它传统冷藏剂混合在一起。碳水化合物糖例如海藻糖、蔗糖、果糖和蜜三糖可以被显微注射为浓度少于或等于大约1.0M，更优选地，少于或等于约0.4M。在一方面，浓度为0.05到0.20M之间，包括0.05和0.20M。此外，细胞外糖或传统冷藏剂可以在储存之前被加入。如果细胞在显微注射之前在高渗溶液中被温育，在显微注射之后实质上不可渗透的溶质可以允许保持在介质中，或可以通过用含有更低浓度的这种溶质或不含这种溶质的介质洗涤细胞而从培养基中去除。

一些糖或多糖——其通常不透过细胞膜，因为它们太大以至于不能穿过细胞膜——对于冷藏目的具有优良的物理化学和生物学性质。虽然这些糖通常自身不渗透细胞膜，但利用所描述的方法，这些通常非渗透性的糖可以被细胞内显微注射，产生有利效果。

非渗透性糖——其对细胞具有稳定或保存作用，在本方法中特别用作冷藏剂——包括：蔗糖、海藻糖、果糖、葡聚糖和蜜三糖。在这些糖中，海藻糖——葡萄糖的非还原二糖——已经显示了在低浓度下在稳定细胞结构方面的优异效应。细胞外糖脂或糖蛋白的加入也可以稳定细胞膜。

在冷藏剂显微注射之后，细胞被制备用于储存。多种冷冻和/或干燥方法可以被用于制备储存用细胞。具体地，本文描述三种方法：真空或风干、冷冻干燥和冻融方法。干燥方法具有稳定的生物材料可以在环境温度下被运输和储存的优点。

通常地，在投入液氮进行储存之前，加载有1到2M DMSO的卵母细胞以非常慢的冷却速率(0.3到0.5℃/分钟)被冷却到中间温度(-60℃到-80℃)。然后样品可以在此温度下被保存。

随后悬浮材料可以在冷藏温度下被保存所希望的时间，例如，通过使小瓶留在液氮(LN₂)中。

真空或风干或冷冻干燥蛋白质的方案在本领域中被充分表征(Frank等,“Materials Science and the Production of Shelf-StableBiologicals”BioPharm,October 1991,p.39；Shalaev等,“Changes in thePhysical State of Model Mixture during Freezing and Drying:Impact onProduct Quality,”Cryobiol.33，14-26(1996))，并且这些方案可以被用于制备使用描述的方法储存的细胞悬浮液。除风干之外，可以用来从细胞悬浮液中去除水的其它对流干燥方法包括氮气或其它气体的对流。

对本发明方法有用的示例性蒸发真空干燥方法可以包括在12孔板上的孔中各放置20μl并且在环境温度下真空干燥2小时。当然，可以使用其它的干燥方法，包括干燥小瓶中的细胞。以这种方式制备的细胞可以被干燥保存，并且通过在DMEM中或任何其它适合培养基中稀释而再水合。

使用冷冻干燥制备用于储存的细胞的本发明的方法由冷冻细胞悬浮液开始。虽然本领域已知的冷冻方法可以被使用，但本文针对冻融方法所描述的简单投入冷冻(plunge freezing)方法也可以被用于冷冻干燥方案中的冷冻步骤。

冷冻之后，可以应用二阶段干燥过程。在第一阶段，升华作用能被加入以便蒸发冷冻水。在样品中的纯晶体冰已经被升华之后，进行第二干燥。冷冻干燥的细胞能够被保存并且以如上面针对真空干燥所述的相同方式被水合。随后存活细胞可以被恢复。

细胞从冷冻或干燥状态恢复之后，任何外部的冷藏剂可以任选地从培养基中去除。例如，可以通过加入具有较低浓度冷藏剂的相应培养基来稀释培养基。例如，恢复细胞可以在含有比用于细胞储存的糖浓度低的糖的培养基中温育大约五分钟。对于这一温育，培养基可以包含与用作冷藏剂的糖相同的糖；不同冷藏剂，例如半乳糖；或任何其它实质上不可渗透的溶质。为了最小化由培养基渗透性降低而诱发的任何渗透震扰，细胞外冷藏剂的浓度可以通过进行多次这种稀释步骤而缓慢地降低，每次稀释使用更低浓度的冷藏剂。这些稀释步骤可以重复，直到不存在细胞外冷藏剂或直到冷藏剂的浓度或培养基的渗透性降低到所期望的水平。

单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、自体干细胞和源自它们的分化细胞可以以允许细胞应将来需要而复苏的方式被储存或“库存(banked)”。单性生殖激活的卵母细胞和自体或同种异体干细胞的等分试样可以在任何时间被移出，成长为许多未分化细胞的培养物和随后分化成特定的细胞类型或组织类型，并且随后可以被用于治疗疾病或替代对象中的功能异常组织。一方面，细胞从供体单性生殖得到，所述细胞能够被保存，使得个体或近亲能够长时期地得到细胞。另一方面，细胞从人群中常见的HLA-单元型纯合供体单性生殖得到，所述细胞可被储存以使具有相同或几乎相同HLA-单元型的个体可在延长的时间段得到细胞。一方面，细胞从人群中常见的具有HLA-单元型的供体单性生殖得到，以及细胞可被储存以使具有相同或几乎相同的HLA-单元型的个体可在延长的时间段得到细胞。

在一个实施方式中，提供用于储存单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体或同种异体干细胞样品和其分化衍生物的细胞库。在另一个实施方式中，提供了施用这种细胞库的方法。美国专利申请公开号20030215942在此引入全文作为参考，其提供了干细胞库系统的实例。

使用如上面所描述的方法，单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体或同种异体干细胞样品和其分化衍生物的分离和体外繁殖以及它们的冷藏帮助建立可移植人干细胞“库”。因为有可能储存较小的细胞等分试样，建库过程可以占据相对小的空间。因此，许多个体的细胞可以以短期或长期基础、以相对少的费用被储存或“库存”。

在一个实施方式中，在加工和储存之前或之后，使一部分样品可用于测试。

本发明还提供记录或指示(indexing)单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体或同种异体干细胞样品和其分化衍生物的方法，以便当需要定位样品时，它可以容易地被找回(retrieved)。任何指示和检索系统(indexing and retrieval system)都可以被用于实施此目的。任何合适的储存系统类型都可以被应用，以便能够储存单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体同种异体干细胞和其分化衍生物。样品可以被设计以储存单独的样品，或可以被设计以储存数百、数千、甚至数百万的不同细胞样品。

储存的单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体或同种异体干细胞样品和其分化衍生物可以被指示，以便可靠和准确地找回。例如，每一样品可以以字母数字编码、条形码、或任何其它方法或它们的组合来标记。还可以有可得到的和可读的信息列表，其能够识别每一单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体同种异体干细胞样品和其分化衍生物和它们在库中的位置以及能够识别库外的细胞样品的来源和/或类型。这种指示系统可以以本领域任何熟知的方式操作，例如，手工地或非手工地操作，例如，可以应用计算机和常规软件。

在一个实施方式中，使用指示系统组织细胞样品，以便对于供体的使用，无论什么时间需要，样品都将是可得到的。在其它实施方式中，细胞样品可以被与起初供体相关的个体使用。在可选的实施方式中，细胞样品可以被具有与细胞样品的HLA-单元型匹配的HLA-单元型的个体使用。一旦被记录到指示系统中，细胞样品可以用于匹配目的，例如，匹配程序将确定具有匹配类型信息的个体以及个体将具有被提供匹配样品的选择。

储存库系统(storage banking system)可以包括用于储存多个记录的系统，所述记录与多个个体和多个细胞样品有关。每条记录可包含类型信息，与细胞样品或具体个体相关的基因型信息或表型信息。在一个实施方式中，系统将包括交叉匹配表(cross-match table)，其将样品类型与想接受样品的个体的类型相匹配。

在一个实施方式中，数据库系统储存库中的每一单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体或同种异体干细胞样品或其分化衍生物的信息。某些信息与每一样品关联储存。信息可以与具体供体，例如，供体的身份和供体的医疗史相关。例如，每一样品可以是HLA分型的并且HLA类型信息可以与每一样品关联储存。储存的信息还可以是可利用信息。每一样品储存的信息是可搜索的，并且以样品可以被定位和立即提供给客户这样的方式确定样品。

因此，本发明的实施方式使用基于计算机的系统，所述系统包含信息例如供体、提交日期、提交细胞的类型、存在的细胞表面标志物类型、细胞的HLA类型、关于供体的遗传信息、或其它相关的信息、以及例如保藏记录和储存样品的位置的储存细节、和其它有用的信息。

术语“基于计算机的系统”是指硬件，软件，和任何用于储存、搜索和检索关于储存细胞的信息的数据库。基于计算机的系统优选地包括上面所描述的存储介质，和用于存取和操作数据的处理器。这种实施方式的基于计算机系统的硬件包括中央处理单元(CPU)和数据库。技术人员可以容易地知道，任何一种目前可用的基于计算机系统都是适合的。

在一个实施方式中，计算机系统包括与母线(bus)相连的处理器，母线与主存储器(优选地执行为RAM)和许多辅助存储设备例如硬盘驱动器和可移动介质存储设备相连。可移动介质存储设备可以表现为，例如，软盘驱动器、DVD驱动器、光盘驱动器、只读光盘驱动器(compactdisk drive)、磁带驱动器等。可移动存储介质例如软盘、只读光盘、磁带等可以被插入到可移动储存设备中，所述可移动存储介质包含记录在其中的控制逻辑和/或数据。计算机系统包括合适的软件，用于在插入可移动介质存储设备中时阅读来自可移动介质存储设备的控制逻辑和/或数据。关于单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞的信息可以以众所周知的方式存储在主存储器、任何辅助存储设备、和/或可移动存储介质中。在运行期间，用于存取和处理这些数据的软件(例如搜索工具、比较工具等)保留在主存储器中。

如本文所用，“数据库”是指存储器，其能够存储与单性生殖激活的卵母细胞集合和/或自体或同种异体干细胞集合——包括其分化衍生物——和供体相关的任何有用信息。

与存储的单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体或同种异体干细胞和其分化衍生物相关的数据可以以多种格式在多种数据处理程序中被存储和操作。例如，数据可以作为文本存储在文字处理文件中，如Microsoft WORD或WORDPERFECT，ASCII文件，html文件，或以本领域技术人员熟悉的多种数据库程序如DB2、SYBASE、或ORACLE存储在pdf文件中。

“搜索程序(search program)”是指一个或更多个程序，其在基于计算机的系统上执行，以便搜索与数据库中的冷藏样品有关的细节或比较与数据库中的冷藏样品有关的信息。“检索程序(retrieval program)”是指一个或更多个程序，其可在基于计算机的系统上执行，以便识别数据库中的感兴趣参数。例如，检索程序可以用于发现适合具体特征的样品，具有特定标志物或DNA序列的样品，或用于发现对应于具体个体的样品位置。

能够被储存于一个细胞库中的细胞样品的数目没有上限。在一个实施方式中，来自不同个体的数百个产品会被储存在一个库或储存设备(storage facility)中。在另一个实施方式中，多达数百万的产品可被储存在一个储存设备中。单个储存设备可以被用于储存单性生殖激活的卵母细胞和/或自体干细胞样品，或多个储存设备可以被应用。

在本发明的一些实施方式中，储存设备可以具有用于组织和指示储存的细胞样品的任何方法的手段，诸如，例如，自动机器人检索机构和细胞样品操作机构。设备可以包括用于处理细胞样品的微操作装置。已知的常规技术可以被用于有效储存和找回细胞样品。示例性技术包括但不限于：机器视觉(Machine Vision)、机器人、自动引导车系统(Automated Guided Vehicle System)、自动储存和检索系统、计算机集成制造、计算机辅助工艺设计、统计过程控制等。

与需要样品的个体有关的类型信息或其它信息可以被记录在系统中，其可以被用于鉴定合适的匹配产品，诸如，例如，数据库系统，指示系统等。一旦在系统中被记录，则个体与供体细胞样品的类型之间可以进行匹配。在优选的实施方式中，供体样品来自与需要样品的个体相同的个体。然而，也可以使用相似但不相同的供体/受体匹配。对于具有匹配类型标识符的个体，匹配样品是可得的。在本发明的一个实施方式中，个体的识别信息与细胞样品关联储存。在一些实施方式中，匹配过程发生在大约收获样品的时间，或可以发生在处理、存储期间的任何时间，或在出现需求时。因此，在本发明的一些实施方式中，匹配过程发生在个体实际需要细胞样品之前。

当个体需要单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品——包括其分化衍生物——时，如果期望，可以在几分钟内找到它并且使其可用于研究、移植或其它目的。也可以进一步处理样品以便制备样品用于移植或其它需求。

通常地，被阻止在中期II的卵母细胞排卵和经过精子受精。精子在所谓的激活过程中开始完成减数分裂。在激活过程中，染色单体对分离，第二极体被挤出，以及卵母细胞保留单倍数目的染色体，每一个染色体具有一条染色单体。精子贡献染色体的另一单倍体互补物，以便形成具有单个染色单体的完整的二倍体细胞。随后染色体在第一次细胞周期期间经过DNA合成而发展。这些细胞随后发育成为胚胎。

与之对照，本文所描述的胚胎通过细胞的人工激活而发育，所述细胞一般为包含所有雄性或雌性来源DNA的哺乳动物卵母细胞或卵裂球。如背景技术中讨论的，在文献中已经报道了未受精卵母细胞的人工激活方法。这样的方法包括物理方法，例如，机械方法如刺破、操作培养中的卵母细胞；热方法例如冷却和加热；反复电脉冲；酶处理例如胰蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶；渗透处理；离子处理例如利用二价阳离子和钙离子载体，例如离子霉素和A23187；麻醉剂的使用例如醚、乙醇、丁卡因、利诺卡因、普鲁卡因、吩噻嗪；镇定剂例如甲硫哒嗪、三氟啦嗪、氟奋乃静、氯丙嗪；蛋白质合成抑制剂的使用，例如环己酰亚胺(放线菌酮)、嘌呤霉素；磷酸化作用抑制剂的使用，例如蛋白激酶抑制剂，如星形孢菌素、2-氨基嘌呤、鞘氨醇和DMAP；它们的组合；以及其它方法。

这些激活方法是本领域熟知的，并且在例如美国专利第5,945,577号中讨论。

在一个实施方式中，在中期II的人细胞，一般是包括所有雄性或雌性来源DNA的卵母细胞或卵裂球，被人工激活用于引起卵母细胞的人工激活。

在一个相关的方面，激活的细胞，例如，卵母细胞——其为二倍体，被允许发育成为包含滋养外胚层和内细胞团的胚胎。这可以使用已知的方法和帮助胚泡发育的培养基来实现。

在单雌生殖胚胎已经被培养产生可辨别的滋养外胚层和内细胞团之后，内细胞团的细胞随后被用于产生希望的多能细胞系。这可以通过将来自内细胞团的细胞或整个内细胞团转移到抑制分化的培养物上而完成。这可以通过将内细胞团细胞转移到抑制分化的饲养层上而完成，例如成纤维细胞或上皮细胞，诸如从出生后人类组织得到的成纤维细胞等，或产生LIF的其它细胞。为将细胞保持在未分化状态，可以使用其它的因子/成分以提供合适的培养条件，包括但不限于：加入条件培养基(Amit等，Developmental Biol(2000)227:271-278)、bFGF和TGF-β1(含有或不含有LIF)(Amit等,Biol Reprod(2004)70:837-845)、激活gp130/STAT3途径的因子(Hoffman和Carpenter,NatureBiotech(2005)23(6):699-708)、激活PI3K/Akt，PKB途径的因子(Kim等，FEBS Lett(2005)579:534-540)、为骨形成蛋白(BMP)超家族成员的因子(Hoffman和Carpenter(2005)，见上文)、以及激活规范/β-联蛋白(canonical/β-catenin)Wnt信号途径的因子(例如，GSK-3-特异性抑制剂；Sato等，Nat Med(2004)10：55-63)。在一相关方面，这些因子可以包含含有饲养细胞和/或ECM基底的培养条件(Hoffman和Carpenter(2005)，见上文)。

在一方面，内细胞团细胞在人出生后包皮或皮肤成纤维细胞或产生白血病抑制因子的其它细胞上，或在白血病抑制因子存在的情况下被培养。在一相关的方面，在ICM种植之前，饲养细胞被失活。例如，饲养细胞可以使用抗生素被有丝分裂失活。在一个相关方面，抗生素可以是但不限于丝裂霉素C。在一个相关方面，饲养细胞可使用辐射而失活。

培养将在这样的条件下实现，所述条件将细胞维持在未分化的多能状态下达延长的时期，理论上无限期。在一个实施方式中，卵母细胞在高O₂张力下用钙离子载体被单性生殖激活，随后使卵母细胞在低O₂张力下与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触。从单性生殖激活的卵母细胞得到的ICM在高O₂张力下被培养，其中例如使用含有20％O₂的气体混合物维持细胞。在一方面，可培养是指能够或适于被培养。在一相关方面，在胚泡培养四天之后，机械地进行ICM分离，其中培养在饲养细胞上进行。这样的培养，例如，消除了使用来自动物来源的材料的需求——如免疫外科的情况。

在一相关的方面，用于ICM的培养基补充有非动物血清，包括但不限于人脐带血清，其中血清在确定成分培养基中存在(例如，IVF，可从MediCultA/S,Denmark；Vitrolife,Sweden；或Zander IVF，Inc，VeroBeach,FL获得)。另一方面，所提供的培养基和过程不含动物产品。在一相关方面，动物产品是那些来自非人来源的产品，包括血清、干扰素、趋化因子、细胞因子、激素以及生长因子。

本发明产生细胞的多能状态可以通过多种方法确认。例如，可以测试细胞中特征性ES细胞标志物的存在或不存在。在人类ES细胞的情况下，这种标志物的实例如上述被鉴定，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT4，它们在本领域中是已知的。

而且，可以通过将细胞注射到合适的动物例如SCID小鼠中和观察分化细胞和组织的产生来确认多能性。确认多能性的又一方法是，使用对象多能细胞产生嵌合动物以及观察引入细胞对不同细胞类型的贡献。生产嵌合动物的方法在本领域中是公知的，并且在美国专利第6,642,433号中描述。

确认多能性的又一方法是，在有利于分化的条件下(例如，成纤维细胞饲养层的移除)培养时，观察到ES细胞分化为胚状体和其它分化细胞类型。这一方法已经被使用，并且已经确认，对象多能细胞在组织培养中产生胚状体和不同的分化细胞类型。

得到的多能细胞和细胞系，优选人多能细胞和细胞系——其来自全部雌性来源的DNA，具有多种治疗和诊断应用。在多种疾病状态的治疗中，这种多能细胞可以被用于细胞移植治疗或基因治疗(如果被遗传修饰)。

就此而言，已知小鼠胚胎干(embroyonic stem，ES)细胞能分化成几乎任何细胞类型。因此，根据本发明产生的人多能(ES)细胞应当具有类似的分化能力。根据本发明的多能细胞将根据已知方法被诱导分化而得到期望的细胞类型。例如，根据本发明产生的人ES细胞可以被诱导分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、视网膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿路细胞等，这是通过在分化培养基中和在提供进行细胞分化的条件下培养这些细胞来实施的。引起ES细胞分化的培养基和方法与合适的培养条件一样，是本领域已知的。

例如，Palacios等,Proc,Natl.Acad,USA,92；7530-7537(1995)教导了造血干细胞从胚细胞系的产生，其通过使干细胞接受诱导过程实施，所述诱导过程包括：最初，在缺乏视黄酸的悬浮培养基中，培养这种细胞的聚集体，随后，在包含视黄酸的相同培养基中进行培养，随后，将细胞聚集体转移到提供用于细胞粘附的基底上。

而且，Pedersen,J,.Reprod.Fertil.Dev.,6:543-552(1994)是综述性论文，其引用了公开体外分化胚胎干细胞产生多种分化细胞类型的方法的许多论文，所述细胞类型包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞等。

并且，Bain等，Dev.Biol.,168：342-357(1995)教导了体外分化胚胎干细胞产生具有神经元特性的神经细胞。这些参考文献是用于从胚细胞或干细胞获得分化细胞的示例性的已报道方法。因此，使用已知的方法和培养基，本领域技术人员可以培养对象ES细胞，包括基因工程化的或转基因的ES细胞，以获得希望的分化细胞类型，例如，神经细胞、肌细胞、造血细胞等。通过本文所描述的方法产生的多能细胞可被用于获得任何希望的分化细胞类型。

例如，hpSC-Hhom系的主要组织相容性复合物(MHC)纯合性可独特地适于治疗应用。根据卵母细胞供体的HLA单元型和供体的生物亲本的HLA-单元型对卵母细胞供体进行适当的选择，并采用FDA批准的制造方法，有可能产生这样的细胞系库，其组织衍生物可共同地与相当数量的个体进行MHC-匹配。已表明，针对常见类型选择的仅十个HLA纯合人胚胎干细胞系的一组可对37.7％的英国受体提供完全的HLA-A、HLA-B和HLA-DR匹配，以及对67.4％提供有益匹配(Taylor C.J.等,Lancet(2005)366(9502):2019-2025)。使用美国人群计算表明，每个种群存在接近200个常见单元型(Mori M.等,Transplantation(1997)64:1017-1027)。HpSC-Hhom-4系携带最常见的单元型，可能对这些人群中接近5％个体提供MHC匹配。因此，hpSC-Hhom系理想地适合于建立与该人群HLA-匹配的分化细胞和组织储存库(repository)，其可用于即时临床应用。可能的关注是造血衍生物，其可潜在地在杂合受体中引起移植物抗宿主病(Billingham,RE.,Harv Led(1966)62:21-78)，在这种情况下，患者特异性单性生殖干细胞可提供解决方法。

分化的人类细胞的治疗用途是空前的。例如，人造血干细胞可以被用于需要骨髓移植的医学治疗中。这种过程被用于治疗许多疾病，例如，晚期癌症如卵巢癌和白血病，和损害免疫系统的疾病如AIDS。造血干细胞可以如下取得，例如，通过将来自雄性或雌性癌症或AIDS患者的雄性或雌性DNA与去核卵母细胞整合，得到如上述的多能细胞，和在有利于分化的条件下培养这样的细胞，直到得到造血干细胞。这样的造血细胞可以被用在包括癌症和AIDS的疾病的治疗中。

可选地，通过在产生神经细胞系的分化条件下培养对象多能细胞(the subject pluripotent cells)，所述多能细胞可以被用于治疗患有神经疾病的患者。能够通过移植这样的人神经细胞治疗的具体疾病示例性地包括：帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、ALS和脑性麻痹等。在帕金森氏症的具体情况下，已经证实，移植的胎儿脑神经细胞与周围细胞正确连接并且产生多巴胺。这可以使得帕金森氏症的症状长期逆转。在一个相关的方面，神经前体可以用于恢复(reanneal)切断的/受伤的神经纤维，以便在手、腿和脊髓损伤后恢复运动。

本发明的一个目标是提供多能人细胞的基本上无限的供给，所述细胞可用于产生合适于卵母细胞供体自体移植或HLA-匹配受体同种异体移植的分化细胞。当用于同种异体细胞移植治疗时，源于不育治疗后剩余的胚泡或使用NT产生的人胚胎干细胞和它们的分化后代可能被受体的免疫系统排斥。单性生殖衍生的干细胞应产生分化的细胞，所述分化的细胞会减轻与目前移植方法相关的显著问题，即，可由于卵母细胞供体相关的宿主-对-移植物或移植物-对-宿主排斥而发生被移植组织的排斥。常规地，通过施用抗排斥药物例如环孢霉素来防止或减轻排斥。但是，这些药物具有明显不利的副作用，例如免疫抑制、致癌性质，并且非常昂贵。如公开的方法产生的细胞在某些情况下应消除，并在其它情况下应至少大大降低卵母细胞供体相关的对抗排斥药物的需求。

本发明的另一个目标是提供基本上无限的多能人细胞供应，所述细胞可以被用于产生适合于卵母细胞供体家族成员(例如，同胞)的同种异体移植的分化细胞。这种细胞与卵母细胞供体的直系家族成员的细胞在免疫和遗传方面将是相似的，因此被供体的家族成员排斥的可能性低。

本方法的另一个目标是，与SCNT比较时，哺乳动物卵母细胞的单性生殖激活是相对简单的方法，并且使得用更少的细胞操作产生干细胞。

已经显示，在干细胞产生方面，哺乳动物卵母细胞的单性生殖激活比需要用机械操作卵母细胞的方法(例如，SCNT)更有效。

SCNT的一个缺点是，线粒体呼吸链活性不足的对象表现出与通常在SCNT胎儿和子代中遇到的表现型异常惊人相似的表现型(Hiendleder等,Repro Fertil Dev(2005)17(1-2)：69-83)。细胞通常仅仅含有一种类型的线粒体DNA(mtDNA)，其被称为同型异源性，但是，异质性确实存在，通常作为突变和野生型mtDNA分子的组合或形成野生型变体的组合(Spikings等，Hum Repro Update(2006)12(4):401-415)。因为异质性可以导致线粒体疾病，因此存在多种机制以确保仅仅母系的传送(maternal-only transmission)。但是，随着绕过用于维持同型异源性的正常机制的方案(例如，胞浆运输(CT)和SCNT)越来越多的应用，扰乱的线粒体功能对于来自这些来源的干细胞可以是固有的。

在一方面，因为单性生殖体是单亲的，异质性的可能性被最小化。

可以由细胞疗法治疗的其它疾病和状况示例性地包括：脊髓损伤，多发性硬化症，肌肉萎缩症，糖尿病，肝病——包括急性疾病(病毒性肝炎、药物过量(对乙酰氨基酚)和其它)、慢性疾病(慢性肝炎和其它(通常导致肝硬化))、遗传性肝脏疾病(血友病B、因子IX缺乏、胆红素代谢缺陷、尿素循环缺陷、溶酶体贮积病、a1-抗胰蛋白酶缺陷和其它)，心脏疾病，软骨替代(cartilage replacement)、烧伤、足部溃疡、胃肠疾病、脉管疾病、肾病、视网膜疾病、尿路疾病以及衰老相关疾病和状况。

这种方法可以被用于替代缺陷的基因，例如，缺陷的免疫系统基因、囊性纤维化基因，或被用于引入引起治疗有利的蛋白质表达的基因，所述蛋白质例如生长因子、淋巴因子、细胞因子、酶等。

例如，编码脑衍生生长因子的基因可以被引入根据本发明产生的人多能细胞中，该细胞分化成神经细胞并且该细胞被移植进入帕金森患者体内以延缓这种病期间神经细胞的丢失。

并且，对象多能人ES细胞可用作体外分化模型，尤其用于涉及临床和生物学研究中的基因的研究。这种研究包括但不限于早期发育调控、再生医学或药物开发。例如，与感兴趣基因一起转录的报告基因(例如，绿色荧光蛋白(gfp)，荧光素酶等)的插入可用于研究疾病、发育生物学、再生医学或药物开发。而且，使用对象ES细胞产生的分化的细胞组织和器官可用于药物研究。

进一步，对象ES细胞或由其得到的分化细胞可以被用作产生其它ES细胞和细胞集落的核供体。

更进一步地，根据本公开内容得到的多能细胞可以用于鉴定参与胚胎发生的蛋白质和基因。这可以通过例如差异表达实施，即，通过比较根据本发明提供的多能细胞中表达的mRNAs和当这些细胞分化成不同的细胞类型例如神经细胞、心肌细胞、其它肌细胞、皮肤细胞等时所表达的mRNA。因此，有可能确定哪种基因参与特定细胞类型的分化。

进一步地，具有特定遗传缺陷如导致杜兴肌营养不良(Duchene’sMuscular Dystrophy)的遗传缺陷的ES细胞和/或它们的分化后代，可以被用作研究与该遗传缺陷相关的特定疾病的模型。

并且，本公开内容的另一个目标是，以不同浓度以及在不同细胞培养条件下，例如，在不同细胞基质中或在不同的气体分压下培养，使根据所述方法产生的多能细胞系暴露于不同生长因子的混合物，以便确定诱导期望的分化细胞类型产生和繁殖的条件。

下述的实施例意图说明本发明而不是限制本发明。

实施例

人单性生殖胚胎发生干细胞的产生

材料和方法

供体选择和知情同意方法

供体从女性集合中征集，其首先被提供至IVF中心，并且查明其符合根据临床指导的IVF方法。

每个可能的供体由她的医生接洽并被告知该研究并提供咨询。如果供体选择参加，则向供体提供以俄语起草的全面知情同意文件(由独立的基于美国ESCRO委员会审查和批准)，其概述了研究目的和过程。如果可能的供体有疑问，可由医生进行处理。只有签署知情同意文件的可能的供体参加该研究。

供体自愿地捐献卵母细胞而没有支付金钱。供体签署知情同意文件，其陈述，所有的捐献材料被用于研究而不是用于生殖目的，即，衍生人ES细胞和它们的分化后代的方法的发展。

根据针对人类细胞、组织以及基于细胞和组织的产品的FDA合格测定指南(FDA HCT/Ps,2004)和俄罗斯公共卫生部第67号(02.26.2003)，确定研究合格性。其包括全面的医学检测，具有X-射线、血液(包括肝功能检测)和尿液分析。供体还被筛查沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、梅毒、HIV、HBV和HCV。

根据HLA型进一步筛选参加研究的可能的供体和亲本。

在该方法中，收获卵母细胞的优先选择是成功的IVF方法。选择最佳的完全发育成熟的卵丘卵母细胞复合体进行IVF。如果收获的卵母细胞总数小于11，则将该女性从用于研究目的的捐赠中自动去除。

供体超排卵

每一供体在她们月经周期的第3天到第13天经受应用FSH(Gonal-F,Lab.Serono,Switzerland)的卵巢刺激。总计给予1500IU。在供体月经周期的第10天到第14天，以0.25mg/天注射促性腺素释放激素拮抗剂Orgalutran(Organon,Holland)。在供体月经周期的第12天到第14天，每天提供注射75IU FSH+75IU LH(Menopur,Ferring GmbH,Germany)。如果超声波检查显示卵泡直径为18mm到20mm之间，则在供体月经周期的第14天施用单剂量的8000IU hGC(Choragon,FerringGmbH,Germany)。在大约第16天，hCG注射之后35小时，进行经阴道穿刺。通过超声波引导的针抽吸，将来自麻醉供体囊状卵泡的卵泡液收集到无菌试管中。

卵母细胞活化和单性生殖胚胎的培养

从卵泡液中选出卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在冲洗培养基(MediCult)中冲洗，随后在20％O₂、5％CO₂，37℃潮湿气氛下，在通用IVF培养基(Universal IVF medium)(Medicult)中孵育2小时，用液体石蜡(MediCult)覆盖。在激活之前，COCs用SynVitro Hyadase(MediCult)处理而去除卵丘细胞，随后在的通用IVF培养基中孵育30分钟，用石蜡覆盖。除了A23187处理外，在湿润的环境下在37℃使用减少O₂的气体混合物(90％N₂+5％O₂+5％CO₂)进行卵母细胞和胚胎的进一步培养，其在COCs培养所述的条件下进行。通过将卵母细胞连续暴露于5μM A23187(Sigma)五分钟以及10μg/ml嘌呤霉素(Sigma)或ImM6-DMAP(Sigma)四小时，在通用IVF培养基中进行活化，用石蜡覆盖，然后在通用IVF培养基中谨慎地洗涤卵母细胞。然后，将卵母细胞置于新鲜的IVF培养基中，培养后用石蜡覆盖。次日(第一天)，使用顺序的BlastAssist系统培养基(MediCult)，根据厂商的建议，将单性生殖活化的卵母细胞培养至胚泡期。从衍生的胚泡中，在第五天从六个培养物中分离内细胞团(ICM)。

胚泡内细胞团的分离和hpSC-Hhom的培养

用0.5％链霉蛋白酶(Sigma)处理去除透明带。将全胚泡置于丝裂霉素C有丝分裂失活的人新生皮肤成纤维细胞(NSF)的饲养层上(Revazova等,2007,上文)，在为hpSC-Hhom培养设计的培养基中培养。当胚泡粘附后滋养层细胞铺展时，ICM成为可见。另外培养三至四天后，使用精细拉长的玻璃移液管通过从滋养外胚层生长物中机械剪切ICM来分离ICM。分离的ICM置于新鲜的饲养层上并另外培养三至四天。将第一个集落机械地切出，并在培养五天后重新铺板。在培养五至六天后，得到所有的传代细胞。较早传代集落被机械地分成块并重新铺板。用胶原酶IV处理和机械分离进行hpSC-Hhom的进一步传代。在湿润气氛下在37℃、5％CO₂下进行hpSC-Hhom繁殖。

对于ICM和hpSC-Hhom的培养，我们使用VitroHES(Vitrolife)，其补充有4ng/ml hrbFGF(Chemicon)、5ng/ml hrLIF(Chemicon)和10％人脐带血清。用于NSF培养的培养基由90％DMEM(高葡萄糖，具有L-谷氨酰胺)(Invitrogen)、10％人脐带血清和青霉素-链霉素(100U/100μg)(Invitrogen)组成。在培养基制备前，对人脐带血清进行梅毒、HIV、HBV和HCV筛选。

hpSC-Hhom的表征

为了免疫染色胚胎干细胞标记物，用4％多聚甲醛将hpSC-Hhom集落在室温固定20分钟，以鉴定SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4，在-20℃用100％甲醇固定5分钟以鉴定其余标记物。所用单克隆抗体包括：来自Chemicon的SSEA-1(MAB4301)、SSEA-3(MAB4303)、SSEA-4(MAB4304)、TRA-1-60(MAB4360)和TRA-1-81(MAB4381)，以及来自Santa Cruz Biotechnology的OCT-4(sc-9081)。第二抗体包括：来自Molecular Probes(Invitrogen)的Alexa Fluor 546(橙色-荧光)和488(绿色-荧光)，用DAPI染核(Sigma)。用AP试剂盒和TRAPEZE试剂盒(Chemicon)检测碱性磷酸酶和端粒酶活性。用常规方法制备染色体切片。根据胰蛋白酶-Giemsa技术进行G-带分析，并且在每种情况下对30-100个中期染色体进行核型分析。

胚状体形成和神经分化

将HpSC-Hhom集落机械地分成块和置于用2％琼脂糖(Sigma)预包被的24-孔簇集板(cluster plate)中，在含有85％Knockout DMEM、15％人脐带血清、l×MEM NEAA、1mM Glutamax、0.055mM P-巯基乙醇、青霉素-链霉素(50U/50μg)(除血清外均来自Invitrogen)的培养基中。在悬浮液中培养胚状体14天，然后铺板进行生长发育或在悬浮液中另外培养一周。

在一周时间内，在分化培养基DMEM/F12、B27、2mM Glutamax、青霉素-链霉素(100U/100μg)和20ng/ml hrbFGF(均来自Invitrogen)中，通过培养附着至培养皿表面的两周大的胚状体，诱导神经分化。一些胚状体产生具有神经形态的分化细胞，其它被分开并另外培养产生神经球。

在与用于产生胚状体的相同培养基中，在铺至粘附表面上培养五天后，搏动胚状体(beating embryoid bodies)自发出现。

hpSC-Hhom分化衍生物的免疫细胞化学

胚状体、神经球或收缩胚状体被铺在聚-D-赖氨酸(Sigma)处理的小盖玻片(VWR Scientific Inc.)上并在适当的分化培养基中培养约一周。对于免疫染色，在-20℃用100％甲醇固定分化细胞5分钟。

对于检测外胚层标记物，我们使用单克隆小鼠抗神经丝68抗体(Sigma)、抗人CD56(NCAM)抗体(Chemicon)和抗βIII微管蛋白抗体(Chemicon)来显示神经元标记物。抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Chemicon)用于检测神经胶质细胞标记物。

对于检测三周大的胚状体或收缩胚状体中的中胚层标记物，将单克隆小鼠抗结蛋白抗体(Chemicon)、抗人α辅肌动蛋白抗体(Chemicon)用作肌肉特异性标记物，将抗人CD31/PECAM-1抗体(R&D Systems)、抗人VE-钙粘蛋白(CD 144)抗体(R&D Systems)用作内皮标记物。

对于检测胚状体中的内胚层标记物，使用单克隆小鼠抗人α-胎蛋白抗体(R&D Systems)。第二抗体Alexa Fluor 546(橙色荧光)和488(绿色荧光)来自Molecular Probes(Invitrogen)。用DAPI染核(Sigma)。HLA基因型分型

对供体和它们的亲本进行HLA单元型和HLA基因型分型的研究。用来自Dynal(Invitrogen)的Dynabeads DNA Direct Blood从血液、卵丘细胞、hpSC-Hhom和NSF中提取基因组DNA。用等位基因特异性测序引物(PCR-SSP,Protrans)通过PCR进行HLA基因型分型。所有测试根据厂商推荐进行。.

Affimetrix SNP微阵列分析

通过酚/氯仿提取方法，从血液、卵丘细胞、hpSC-Hhom和NSF分离基因组DNA。用Affimetrix Mapping 250K Nsp Arrays对从三个供体、四个hpSC-Hhom系和NSF获得的DNA样品进行基因型分型。由于包含252,973个二进制(binary)SNP标记物的原始数据组超过确定基因组样品等价性(equivalency)所需的数目，其被减少以简化计算。

下列标准用于选择基于遗传考虑的标记物：1)标记物中的杂合性程度越高，它们提供的鉴定SNP样本来源的信息越多。二进制SNP标记物的杂合性最大值设为0.5(is capped at a maximum of 0.5)。只选择杂合性大于0.375的SNP标记物(即在高加索人群中，没有等位基因具有小于0.25或大于0.75的频率)；2)使用所有22对常染色体；3)去除可靠性低的标记物，因为普通来源样品的鉴定是对基因型分型误差高度敏感的。在Affymetrix数据组中，高置信度得分相对应于低可靠性，因此去除这些具有高置信度得分的标记物。在默认设置中，如果它的置信度得分超过0.25，则对标记物不进行呼叫(call)。通过对所有12个样本只选择那些置信度得分小于或等于0.02的标记物，对可靠性应用甚至更为严格的要求。

应用这些标准，SNP标记物的数量从252,973个降至4,444个。采取一个最终步骤来降低标记物数量(不进行随机采样)，其通过只选择那些标记物间距为至少0.1cM(1Mbp＝1cM)的标记物而实施，因为相互距离很近的标记物提供较少的信息，原因在于在它们之间存在紧密连锁。这些步骤产生3,993个标记物的最终选择。

因此，用Relcheck(版本0.67,copyright(C)2000Karl W.Broman,Johns Hopkins University,得到GNU General Public License version 2许可(1991年6月))分析所选择的3,993个标记物。Relcheck提供测定一对SNP样本之间关系的方法。这基于计算似然比，用于观察根据样本之间的遗传关系的标记物的给定构型。使用Relcheck基于的知识是由于同卵双生双胞胎具有相同DNA，所以两个样本之间的等价性测试可通过检测是否那些样本可能来自同卵双生双胞胎来进行。运行Relcheck，假定基因型分型误差率为大约0.4％。Relcheck程序鉴定五种类型的关系：同卵双生双胞胎、父母/子女对、全同胞(full siblings，full sibs)、半同胞(half siblings，half sibs)和不相关(Boehnke M.等,Am JHum Genet(1997)61:423-429；Broman K.W.等,Am J HumGenet(1998)63:1563-1563)。

为了测定供体和干细胞样本15条染色体中杂合SNPs的比例，对6个干细胞系、4个供体以及1个对照样本分析用于早期分析的1495个随机取样的SNP标记物。

通过对染色体1-12中的每一条取最后一个可用的p标记物(短臂)和第一个可用的q标记物(长臂)之间的中点来测定每条染色体着丝粒的定位。对于近端着丝粒染色体13-15，在p臂上没有SNP标记物，因此假定着丝粒在位置0(q臂的起点)。

下列数值用作chr 1-15的着丝粒定位(以距p臂末端的Mbp计)：

染色体# Mbp

chrl＝131.5051

chr2＝92.7926

chr3＝93.1514

chr4＝51.0889

chr5＝46.8726

chr6＝60.5099

chr7＝57.8019

chr8＝45.3089

chr9＝54.6881

chr10＝39.0399

chr11＝52.7549

chr12＝35.6473

chr13＝0

chr14＝0

chr15＝0

对于每一个SNP标记物，计算在具体染色体上距着丝粒的绝对距离(即，从着丝粒的两个方向被等同处理，所有“负”距离被转换为正距离)。为了计算杂合子的比例，染色体距离(距着丝粒)被分为15个间隔(在输出中称为“bins”)。每个间隔在长度上为10Mbps。分配给每个“bin”的数字相当于那个间隔在染色体距离上的上限。所有单位都以百万碱基对(Mbp)表示。例如：

Bins＝10相当于距着丝粒的间隔[0,10]Mbp。

Bins＝70相当于距着丝粒的间隔[60,70]Mbp。

Bins＝150相当于距着丝粒的间隔[140,150]Mbp。

原始Affiymetrix SNP数据组提供的碱基对距离用于保持与之前数据分析的一致性。对于每个间隔，通过在那个间隔中所有SNPs的杂合性指示变量的平均值来评估杂合性的比例。

对于供体和干细胞，杂合性变量储存供体(2、12、10、11)和干细胞样本(3、4、5、9、6、7、8)在每个SNP标记物位置的杂合性指示变量的平均值。纯合性比例的相应值可通过从1中减去杂合子值而容易地得到。

内部对照正确地鉴定了源于作为“同卵双生双胞胎”的相同hpSC-Hhom系的分裂培养物之间的配对的基因型关联。

印记基因分析

如所述提取总RNA(Chomcznski和Sacchi,AnalBiochem(1987)162:156-159)并用异丙醇沉淀。使用无RNAse的DNAse处理(Promega)去除剩余的基因组DNA。在20μl的反应体积中，使用RevertAid M-MuLV逆转录酶(Fermentas)从1μg总RNA合成cDNA。使用Taq DNA聚合酶(Fermentas)用1μl cDNA进行PCR反应。根据厂商说明书进行所有反应。

引物序列和PCR条件如下：TSSC5(Lee等,CancerRes(1998)58:4155-4159)正向引物5’-GCTCTTCATGGTCATGTTCTCCA-3’(SEQ ID NO:1)和反向引物5’-GGAGCAGTGGTTGTACAGAGG-3’(SEQ ID NO:2)，在94℃4min条件下进行1个循环；94℃1min、55℃1min和72℃1min进行33个循环。产物大小为364bp。H19(Hashimoto等,NatGenet(1995)9:109-110)正向引物5’-TACAACCACTGCACTACCTG-3’(SEQ ID NO:3)和反向引物5’-TGGCCATGAAGATGGAGTCG-3’(SEQ ID NO:4)，在94℃4min条件下进行1个循环；94℃1min、52℃1min和72℃1min进行38个循环。产物大小为148bp。PEG1_1(Li等,J BiolChem(2002)277:13518-13527)正向引物5’-GAG TCC TGT AGG CAAGGT CTT ACC T-3’(SEQ ID NO:5)和反向引物5’-CTT GCC TGA AGACTT CCA TGA GTG A-3’(SEQ ID NO:6)，在94℃4min条件下进行1个循环；94℃1min、55℃1min和72℃1min进行35个循环。产物大小为155bp。PEG1_2(Li等,2002,见上文)正向引物5’-GCT GCTGGC CAG CTC TGC ACG GCT G-3’(SEQ ID NO:7)和反向引物5’-CTTGCC TGA AGA CTT CCA TGA GTG A-3’(SEQ ID NO:8)，在94℃4min条件下进行1个循环；94℃1min、65℃1min和72℃1min进行39个循环。产物大小为230bp。SNRPN(Glenn等,Hum MolGenet(1993)2:2001-2005)正向引物5’-CTTAGCTGAGACACCAAGAGG-3’(SEQ ID NO:9)和反向引物5’-GCAGCATCTTGCTACTCTTGC-3’(SEQ ID NO:10)，在94℃4min条件下进行1个循环；94℃1min、55℃1min和72℃1min进行33个循环。产物大小为246bp。GAPDH(Adjaye等,Gene(1999)237:373-383)正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(SEQ ID NO:11)和反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ ID NO:12)，在94℃4min条件下进行1个循环；94℃1min、55℃1min和72℃1min进行21个循环。产物大小为450bp。

用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳(5μl/道)分析PCR产物，用溴化乙锭染色，并使用Biolmaging系统(UVP)记录。重复进行RT-PCR实验，结果可重复。GAPDH用作遍在表达对照。通过在每个PCT组中包括RT-阴性样本(在逆转录步骤不含逆转录酶)作为对照，排除基因组污染。

畸胎瘤形成和评价

所有动物操作由实验动物保护国际评估和认证联合会(theAssociation for the Assessment and Accreditation of Laboratory AminalCare International，AAALAC)认证的俄罗斯科学院俄罗斯生物有机化学协会的分支——生物学实验室(the Biological Testing Laboratory-Branchof Shemyakin&Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of theRussian Academy of Sciences)(Pushchino,Moscow Region,Russia)进行。

由获自Charles River laboratories Research Model and Services(德国)的CB17/ICR-PRKDC-SCID CRL鼠繁殖的免疫缺陷SCID-米色小鼠用于畸胎瘤形成。为了注射至小鼠中，使用IV型胶原酶将hpSC-Hhom从培养皿上酶分离，然后和重悬为小块。将大约两百万至五百万hpSC-Hhom细胞注射至后肢上部皮下空间。大约两个月后，取出已形成的畸胎瘤并用4％多聚甲醛固定。将一半的组织在蔗糖中低温防护并将另一半置于5％琼脂-琼脂中，然后使用振动切片机将其切成60μm的切片。将切片置于载玻片之上并用苏木精/伊红、Kraberg、Van Gieson和picrofucsin染色。

注射约两百万至五百万丝裂霉素C处理的用作phES细胞饲养层的人成纤维细胞作为对照。在对照动物中未观察到畸胎瘤生长。

实施例1.单性生殖体的产生

年龄均超过31岁的五个卵母细胞供体参与该研究。使用激素刺激获得卵母细胞，其最初意图是体外受精(IVF)。从五个供体获得总共46个卵泡卵母细胞复合体(COCs)并用于该研究(表1)。

表1.单性生殖体和单性生殖胚胎干细胞系的产生。

¹-两个卵母细胞未被激活；²-一个卵母细胞在激活后退化；³-一个卵母细胞未被激活；⁴-两个卵母细胞处于中期I期并被弃除；⁵-单性生殖的活化的卵母细胞总数＝40；⁶–得到的胚泡总数＝23

在卵母细胞活化前，将COCs维持在环境氧张力下。在去除卵丘细胞后，只将具有明显的第一极体的正常中期II卵母细胞用于活化操作。用5μM离子霉素活化卵母细胞五分钟，然后用6-DAMP温育四小时以防止挤出第二极体并产生二倍体胚胎。根据厂商的建议使用标准IVF方法和在减少的氧(90％N₂+5％O₂+5％CO₂)下，在Medical培养基中进行卵母细胞和胚胎的操作和培养。在单性生殖活化后，只有40个卵母细胞能够卵裂。这些方法使得在胚胎培养的第五天或第六天产生23个胚泡。其中11个胚泡具有可见的ICMs(表1)。

单性生殖hESC系的衍生

在用于临床应用的hESCs的衍生和培养中，如果不能消除动物来源的组分，将其减到最少是十分重要的。为了这个目的，一些研究者不使用免疫外科进行ICM分离，而使用机械方法从全胚泡分离ICMs(Kim等,Stem Cells(2005)23:1228-1233)。培养基和饲养细胞也可能含有动物病原体。为了消除可能的污染，研究者已使用人细胞作为饲养细胞来代替小鼠成纤维细胞(Cheng等，StemCells(2003)21:131-142；Hovatta等,Hum Repro(2003)18:1404-1429；Stojkovic等，Stem Cells(2005)23:306-314)或已在无饲养细胞和无血清条件下培养hESCs(Amit等,2004；Klimanskaya等,Lancet(2005)365:1636-1641)。考虑到这些以往的研究，修改用于ICM和phESC分离的培养条件。

对于phESC的衍生和培养，将丝裂霉素C有丝分裂失活的人新生皮肤成纤维细胞(NSF)用作饲养细胞。这些细胞最初用含有人脐带血清代替动物血清的培养基来衍生和繁殖。phESC培养基由补充源于脐带血的人血清、hrbFGF和hrLIF的VitroHES培养基(Vitrolife)组成。在37℃、5％CO₂、湿润气氛下繁殖phESC。

所有衍生的单性生殖胚泡最初用0.5％链霉蛋白酶处理以去除透明带。使用胰蛋白酶处理(Li等,Mol Reprod Dev(2003)65:429-434)和常规免疫外科(Solter和Knowles,Proc Natl Acad Sci USA(1975)72:5099-5102)从第一卵母细胞供体获得来自两个胚泡的良好形成的ICMs。进一步，在所述产生phESC的条件下将ICMs置于人饲养细胞上。来自胰蛋白酶处理胚泡的ICM不产生活细胞。衍生自免疫外科后的ICM显示细胞生长，引起phESC-1细胞系的产生。其它21个全胚泡最初在所述条件下置于饲养细胞上。从铺展的滋养层细胞上通过机械剪切分离ICMs并将其重置于新鲜的饲养细胞上。以这种方式，产生五个phESC系(phESC-3至phESC-7)(表1)。

phESC系的表征

phESC系显示在hESCs中期待的形态并且形成集落，其具有紧密叠集的细胞、明显的核仁和小的细胞质与核的比例(图1)。这些细胞表达常规hES细胞标记物SSEA-3、SSEA-4、(图1)TRA-1-60、TRA-1-81和OCT-4、(图1续)并不表达SSEA-1——未分化的小鼠胚胎干细胞的阳性标记物(图1)。源于所有系的细胞均表明高水平的碱性磷酸酶(图1续)和端粒酶活性(图2)。

G-带核型分析显示，除了phESC-7系之外，phESC系具有正常人46，XX核型(图3)。大约91％来自phESC-7系的细胞具有47，XXX核型并且9％的细胞具有48，XXX，+6核型。通过细胞系中100个中期细胞的分析，观察到不同程度的X染色体异型性：大约12％的phESC-1和phESC-6系细胞显示X染色体异型性；42％的phESC-5系细胞以及分别为70％、80％和86％的phESC-7、phESC-3和phESC-4细胞系显示X染色体异型性(图3)。

phESC的分化能力

在经历35代的十个月培养过程中，phESC-1系保持未分化。其它细胞系成功地培养超过至少21代。来自所有phESC系的细胞在悬浮液培养中形成囊胚状体，并在体外分化后产生所有三个胚层——外胚层、中胚层和内胚层——的衍生物(图4)。大约5％的来自phESC-1系的胚状体在铺板后五天产生搏动细胞。phESC-6系产生色素上皮样细胞(图4L、K)。外胚层分化由神经元特异性标记物神经丝68(图4A)、NCAM(图4B)、βIII-微管蛋白(图4C)和神经胶质细胞标记物GFAP(图4D,M)的阳性免疫细胞化学染色显示。分化的细胞是中胚层标记物阳性的，其包括肌肉特异性标记物α-辅肌动蛋白(图4G)和结蛋白(图4J)，以及内皮标记物PEC AM-1(图4E)和VE-钙粘蛋白(图4F)。内胚层分化由分化的衍生物的α-胎蛋白阳性染色显示(图4H,L)。phESC系形成所有三个胚层衍生物的能力通过皮下注射phESC至免疫缺陷小鼠和大鼠来进行体内研究(图5)。在注射后大约两个月，来自所有phESC系的细胞能够形成畸胎瘤。组织学检测表明存在有组织的结构，包括：上皮；囊；平滑肌；脂肪组织；造血组织；神经管和腺上皮。免疫组织化学分析显示，β-微管蛋白(图5C)——外胚层标记物、纤维连接蛋白(图5B)和肌肉肌动蛋白(图5A)——中胚层标记物、以及α-胎蛋白(图5D)——内胚层标记物染色阳性。这些数据表明，phESC可在体内分化为三个胚层，其产生人体内发现的所有细胞类型。

phESC系的DNA-序型分析

进行所有phESC系、供体体细胞和饲养细胞的比较DNA-序型分析。这些研究使用Affymetrix单核苷酸多态性(SNP)微阵列(Mapping50K Hind 240Arrays)以确定phESC与供体体细胞的遗传相似性。选择15条常染色体(染色体1-15)上的总计1459个SNP标记物，标记物间距离中值为1.12Mbp。phESC系和它们的关联供体体细胞之间的全配对基因型关联被鉴定为“全同胞”(遗传匹配)，并且所有的其它组合对被鉴定为“不相关”。内部对照鉴定了源于作为“同卵双生双胞胎”的相同phESC系的分裂培养物之间的配对基因型关系(表2)。

表2.鉴定来自phESC和相关供体的DNA样本。

DNA样本分析的编号如下：1-人新生皮肤成纤维细胞、2-phESC-7系供体、3-phESC-7系、4-phESC-1系、5-phESC-1系、6-phESC-3系、7-phESC-4系、8-phESC-5系、9-phESC-6系、10-phESC-6系供体、11-phESC-3至phESC-5系供体、12-phESC-l系供体。

输出中的IBS列显示标记物数目，其中一对都被测定并具有所陈述的相同的0、1或2个等位基因。(对于在没有基因型分型误差的理想条件下的同卵双生双胞胎，所有标记物必须均为IBS＝2。)该输出未直接显示P(观察的标记物1，给定关联)，但其显示LOD得分＝log₁₀{P(观察的标记物1，假定关联)/P(观察的标记物1关联，其获得最大可能性并因此进行呼叫)}作为相似性的度量。该LOD得分越小，两个样本之间假定关联的可能越小。

SNP标记物的对比分析显示，整体上看，在距着丝粒的距离上，供体细胞似乎不显示杂合性趋势的清晰模式，但是，与中部的杂合性比例比较，由于可能的染色体组合，干细胞显示接近着丝粒和端粒的杂合性比例有些低(表A-I)。

表A.杂合供体/干细胞染色体Bins。

杂合供体干细胞染色体bin

染色体	Bins	频率	供体杂合	干细胞杂合
						1459	0.37	0.207
	10	91	0.407	0.053
					20	135	0.33	0.111
	30	185	0.358	0.19
					40	169	0.408	0.285
	50	157	0.385	0.268
					60	153	0.353	0.204
	70	123	0.354	0.188

杂合供体干细胞染色体bin

染色体	Bins	频率	供体杂合	干细胞杂合
						80	113	0.345	0.239
	90	118	0.371	0.228
						100	88	0.398	0.24
	110	49	0.393	0.233
						120	29	0.302	0.222
	130	26	0.365	0.231
						140	20	0.4	0.193
	150	3	0.5	0.048
					1		142	0.373	0.198
2		150	0.327	0.187
					3		111	0.41	0.229
4		133	0.346	0.179
					5		121	0.39	0.263
6		115	0.387	0.205
					7		103	0.379	0.205
8		93	0.401	0.187
					9		66	0.314	0.171
10		88	0.375	0.273
					11		78	0.385	0.19
12		77	0.403	0.161
					13		78	0.324	0.192
14		62	0.379	0.279
					15		42	0.345	0.194
1	20	9	0.361	0.063
					1	30	14	0.357	0.153
1	40	12	0.354	0.214
					1	50	15	0.35	0.229
1	60	21	0.369	0.211
					1	70	19	0.461	0.211
1	80	9	0.333	0.175
					1	90	13	0.288	0.176
1	100	13	0.327	0.198
					1	110	8	0.469	0.214
1	120	6	0.333	0.19
					1	130	3	0.667	0.571
2	10	3	0.333	0
					2	20	11	0.386	0.182
2	30	13	0.269	0.176
					2	40	6	0.25	0.167
2	50	19	0.303	0.263
					2	60	13	0.423	0.308
2	70	10	0.275	0.171
					2	80	13	0.327	0.176
2	90	19	0.342	0.226
					2	100	7	0.214	0.082
2	110	4	0.375	0.143
					2	120	7	0.25	0.122
2	130	11	0.318	0.143
					2	140	11	0.386	0.156
2	150	3	0.5	0.048
					3	10	9	0.417	0.016
3	20	.15	0.333	0.057
					3	30	12	0.354	0.167

杂合供体干细胞染色体bin

染色体	Bins	频率	供体杂合	干细胞杂合
					3	40	11	0.455	0.351
3	50	3	0.083	0.143
					3	60	12	0.438	0.286
3	70	12	0.458	0.202
					3	80	14	0.5	0.347
3	90	12	0.375	0.25
					3	100	9	0.472	0.429
3	110	2	0.375	0.286
					4	10	13	0.423	0.121
4	20	9	0.25	0.143
					4	30	15	0.283	0.152
4	40	15	0.367	0.2
					4	50	11	0.409	0.195
4	60	8	0.375	0.179
					4	70	7	0.286	0.163
4	80	9	0.278	0.206
					4	90	9	0.389	0.222
4	100	7	0.321	0.204
					4	110	8	0.375	0.196
4	120	7	0.321	0.184
					4	130	8	0.313	0.179
4	140	7	0.429	0.204
					5	10	12	0.417	0.083
5	20	12	0.292	0.119
					5	30	11	0.409	0.325
5	40	14	0.411	0.306
					5	50	10	0.45	0.257
5	60	8	0.219	0.107
					5	70	8	0.344	0.25
5	80	8	0.406	0.339
					5	90	8	0.375	0.214
5	100	7	0.536	0.286
					5	110	9	0.5	0.508
5	120	8	0.344	0.393
					5	130	4	0.375	0.321
5	140	2	0.375	0.357
					6	10	13	0.404	0.022
6	20	14	0.286	0.082
					6	30	11	0.364	0.208
6	40	12	0.542	0.488
					6	50	10	0.4	0.329
6	60	18	0.347	0.19
					6	70	8	0.344	0.161
6	80	8	0.25	0.179
					6	90	7	0.429	0.245
6	100	10	0.55	0.229
					6	110	4	0.313	0.143
7	10	6	0.292	0.024
					7	20	12	0.333	0.071
7	30	16	0.313	0.143
					7	40	14	0.429	0.337
7	50	16	0.484	0.402
					7	60	15	0.433	0.171

杂合供体干细胞染色体bin

染色体	Bins	频率	供体杂合	干细胞杂合
					7	70	9	0.389	0.19
7	80	5	0.3	0.171
					7	90	7	0.214	0.061
7	100	3	0.5	0.381
					8	10	8	0.313	0.036
8	20	10	0.425	0.129
					8	30	15	0.483	0.162
8	40	13	0.346	0.253
					8	50	11	0.364	0.208
8	60	4	0.25	0.143
					8	70	10	0.45	0.314
8	80	6	0.375	0.167
					8	90	11	0.455	0.169
8	100	5	0.4	0.257
					9	20	9	0.25	0.016
9	30	15	0.35	0.133
					9	40	10	0.45	0.229
9	50	13	0.269	0.209
					9	60	9	0.278	0.254
9	70	6	0.25	0.167
					9	80	4	0.313	0.214
10	10	7	0.5	0.163
					10	20	15	0.367	0.181
10	30	19	0.289	0.248
					10	40	12	0.375	0.298
10	50	6	0.5	0.381
					10	60	9	0.333	0.349
10	70	2	0.375	0.286
					10	80	8	0.406	0.393
10	90	7	0.357	0.286
					10	100	3	0.5	0.238
11	10	7	0.357	0.02
					11	20	8	0.375	0.161
11	30	15	0.45	0.267
					11	40	15	0.4	0.219
11	50	16	0.469	0.268
					11	60	7	0.143	0.061
11	70	6	0.333	0.119
					11	80	4	0.313	0.179
12	10	13	0.481	0.011
					12	20	9	0.306	0.143
12	30	13	0.385	0,132
					12	40	12	0.458	0.226
12	50	9	0.5	0.238
					12	60	5	0.25	0.114
12	70	7	0.214	0.163
					12	80	3	0.333	0.333
12	90	4	0.563	0.393
					12	100	2	0.5	0.071
13	20	1	0.25	0
					13	30	4	0.375	0.179
13	40	10	0.325	0.214
					13	50	7	0.393	0.306

杂合供体干细胞染色体bin

染色体	Bins	频率	供体杂合	干细胞杂合
					13	60	9	0.25	0.048
13	70	8	0.344	0.143
					13	80	9	0.25	0.27
13	90	7	0.464	0.429
					13	100	11	0.341	0.208
13	110	11	0.295	0.065
					13	120	1	0	0
14	20	1	0.25	0.143
					14	30	7	0.429	0.265
14	40	8	0.531	0.518
					14	50	8	0.344	0.321
14	60	9	0.444	0.27
					14	70	6	0.333	0.119
14	80	8	0.219	0.125
					14	90	7	0.286	0.184
14	100	6	0.417	0.333
					14	110	2	0.5	0-571
15	30	5	0.3	0.171
					15	40	5	0.4	0.286
15	50	3	0.167	0.143
					15	60	6	0.5	0.19
15	70	5	0.1	0.086
					15	80	5	0.5	0.257
15	90	7	0.429	0.245
					15	100	5	0.25	0.171
15	110	1	0.25	0

表B.染色体Bins、杂合性/频率，染色体01。

表C.染色体Bins、杂合/频率，染色体02和03。

表D.染色体Bins、杂合/频率，染色体12和04。

表E.染色体Bins、杂合/频率，染色体12和05。

表F.染色体Bins、杂合/频率，染色体11和16。

表G.染色体Bins、杂合/频率，染色体11和07。

表H.染色体Bins、杂合/频率，染色体11和08。

表I.染色体Bins、杂合/频率，染色体10和09。

杂合10 09染色体bin

染色体	bins	频率	杂合10	杂合09
							1459	0.378	0.222
	10	91	0.473	0.066
						20	135	0.319	0.178
	30	185	0.314	0.227
						40	169	0.467	0.402
	50	157	0.357	0.21
						60	153	0.405	0.216
	70	123	0.358	0.138
						80	113	0.363	0.257
	90	118	0.373	0.237
						100	88	0.432	0.216
	110	49	0.408	0.184
						120	29	0.31	0.207
	130	26	0.308	0.269
						140	20	0.2	0.1
	150	3	1	0.333
					1		142	0.387	0.218
2		150	0.353	0.253
					3		111	0.405	0.243
4		133	0.346	0.218
					5		121	0.413	0.198
6		115	0.409	0.243
					7		103	0.359	0.233
8		93	0.398	0:118
					9		66	0.333	0.273
10		88	0.341	0.273
					11		78	0.372	0.167
12		77	0.429	0.182
					13		78	0.423	0.256
14		62	0.339	0.226
					15		42	0.333	0.214
1	20	9	0.556	0.222
					1	30	14	0.357	0.071
1	40	12	0.333	0.333
					1	50	15	0.267	0.2
1	60	21	0.429	0.286
					1	70	19	0.526	0.263
1	80	9	0.222	0.222
					1	90	13	0.077	0
1	100	13	0.385	0.308
					1	110	8	0.625	0.125
1	120	6	0.5	0.167
					1	130	3	0.667	0.667
2	10	3	0.333	0
					2	20	11	0.364	0.364
2	30	13	0.308	0.308
					2	40	6	0	0
2	50	19	0.263	0.263
					2	60	13	0.615	0.231
2	70	10	0.3	0.2
					2	80	13	0.538	0.385
2	90	19	0.421	0.368
					2	100	7	0.571	0.571

杂合10 09染色体bin

染色体	bins	频率	杂合10	杂合09
					2	110	4	0	0
2	120	7	0.286	0.286
					2	130	11	0.182	0.091
2	140	11	0.182	0
					2	150	3	1	0.333
3	10	9	0.333	0
					3	20	15	0.4	0.067
3	30	12	0.333	0.25
					3	40	11	0.636	0.636
3	50	3	0	0
					3	60	12	0.333	0.25
3	70	12	0.417	0.25
					3	80	14	0.571	0.357
3	90	12	0.25	0.167
					3	100	9	0.444	0.222
3	110	2	0.5	0.5
					4	10	13	0.615	0.154
4	20	9	0.111	0.111
					4	30	15	0.2	0.067
4	40	15	0.267	0.133
					4	50	11	0.545	0.182
4	60	8	0.375	0.375
					4	70	7	0	0
4	80	9	0.222	0.222
					4	90	9	0.667	0.667
4	100	7	0.286	0
					4	110	8	0.5	0.375
4	120	7	0.429	0.429
					4	130	8	0.25	0.25
4	140	7	0.286	0.286
					5	10	12	0.417	0
5	20	12	0.25	0.167
					5	30	11	0.455	0.455
5	40	14	0.5	0.357
					5	50	10	0.7	0.2
5	60	8	0.375	0
					5	70	8	0.25	0
5	80	8	0.375	0.375
					5	90	8	0.5	0.5
5	100	7	0.571	0
					5	110	9	0.444	0.111
5	120	8	0.125	0
					5	130	4	0.5	0.5
5	140	2	0	0
					6	10	13	0.462	0.154
6	20	14	0.286	0.143
					6	30	11	0.364	0.364
6	40	12	0.583	0.583
					6	50	10	0.3	0.3
6	60	18	0.278	0.278
					6	70	8	0.375	0.375
6	80	8	0.375	0.25
					6	90	7	0.714	0

杂合10 09染色体bin

染色体	bins	频率	杂合10	杂合09
					6	100	10	0.7	0
6	110	4	0	0
					7	10	6	0.5	0.167
7	20	12	0.25	0.25
					7	30	16	0.313	0.313
7	40	14	0.571	0.571
					7	50	16	0.25	0.25
7	60	15	0.6	0.2
					7	70	9	0.444	0
7	80	5	0.2	0
					7	90	7	0	0
7	100	3	0	0
					8	10	8	0.25	0
8	20	10	0.4	0.3
					8	30	15	0.467	0.2
8	40	13	0.308	0.154
					8	50	11	0.364	0.182
8	60	4	0.5	0.25
					8	70	10	0.5	0
8	80	6	0.5	0
					8	90	11	0.455	0
8	100	5	0.2	0
					9	20	9	0.333	0.111
9	30	15	0.133	0.067
					9	40	10	0.6	0.5
9	50	13	0.385	0.385
					9	60	9	0.333	0.333
9	70	6	0.167	0.167
					9	80	4	0.5	0.5
10	10	7	0.571	0
					10	20	15	0.267	0.133
10	30	19	0.263	0.263
					10	40	12	0.417	0.417
10	50	6	0.167	0.167
					10	60	9	0.222	0.222
10	70	2	0.5	0.5
					10	80	8	0.375	0.375
10	90	7	0.571	0.571
					10	100	3	0.333	0.333
11	10	7	0.571	0.143
					11	20	8	0.25	0
11	30	15	0,333	0.333
					11	40	15	0.267	0.267
11	50	16	0.563	0.188
					11	60	7	0.286	0
11	70	6	0.5	0
					11	80	4	0	0
12	10	13	0.538	0
					12	20	9	0.333	0.333
12	30	13	0.154	0.077
					12	40	12	0.75	0.5
12	50	9	0.444	0
					12	60	5	0.4	0

杂合10 09染色体bin

染色体	bins	频率	杂合10	杂合09
					12	70	7	0.286	0.286
12	80	3	0.333	0.333
					12	90	4	0.25	0
12	100	2	1	0.5
					13	20	1	1	0
13	30	4	0.25	0
					13	40	10	0.7	0.7
13	50	7	0.429	0.286
					13	60	9	0.444	0
13	70	8	0.375	0
					13	80	9	0.222	0.111
13	90	7	0.429	0.429
					13	100	11	0.364	0.364
13	110	11	0.455	0.273
					13	120	1	0	0
14	20	1	0	0
					14	30	7	0.571	0.571
14	40	8	0.5	0.5
					14	50	8	0.125	0.125
14	60	9	0.444	0.222
					14	70	6	0.333	0
14	80	8	0.125	0
					14	90	7	0.286	0
14	100	6	0.5	0.5
					14	110	2	0	0
15	30	5	0.4	0
					15	40	5	0.6	0.4
15	50	3	0	0
					15	60	6	0.333	0.333
15	70	5	0	0
					15	80	5	0.6	0.6
15	90	7	0.286	0.286
					15	100	5	0.2	0
15	110	1	1	0

染色体＝所考虑的染色体编号；Bins＝具体间隔，具有距着丝粒的10Mbp间隔的给定上限数字；频率＝所考虑染色体和间隔的每个组合的SNP标记物的数量；其它列是所考虑染色体和间隔的每个组合的杂合性比例；染色体＝.,bins＝。

行：在样本中所有1459个标记物的全部累加；染色体＝.,bins＝**系：间隔-与-间隔累加，所有染色体总和；染色体＝**,bins＝.

行:染色体-与-染色体累加，所有间隔总和；染色体＝**,bins＝**系：染色体和间隔的每个组合的累加。

在所有7对中，干细胞显示比它们的供体细胞对应物低的杂合性比例。整体上看，在距着丝粒的距离上，供体细胞似乎不显示杂合性趋势的清晰模式，但是干细胞显示与中部的杂合性比例比较，接近着丝粒和端粒的杂合性比例有些低。

基于HLA-分型结果，衍生自所有phESC系的干细胞显示与卵母细胞供体是MHC-匹配的，使其成为产生用于治疗用途的细胞的可能方法(表3)。用作饲养细胞的人成纤维细胞的遗传物质HLA-分析显示，没有来自人成纤维细胞的物质污染phESC系(表3)。

表3.HLA-分型结果。

印记基因分析

人胚胎中基因印记的变化可归因于与母本或父本表达的基因连锁的疾病的发生(Gabriel等,Proc Natl Acad Sci USA(1998)95:14857-14862)。phESC中印记的研究需要详细的调查，因为可能影响phESC分化和它们衍生物的功能性。作为预备研究，在未分化的phESC中进行人印记基因TSSC5、H19、PEGl和SNRPN的表达分析(Morison等,TrendsGenet(2005)21:457-465)(图6)。源于丢弃的IVF胚胎的两个hESC系用作对照。在所有phESC系以及也在对照系中观察到母本表达基因TSSC5(Morison等,2005,上文)和H19(Morison等,2005,上文)的转录物。人PEGl基因从两个可选的启动子转录(Li等,2002,上文)。来自第一启动子的基因区是双等位基因表达的，以及来自第二启动子的基因区(同工型1)是父本表达的(Li等,2002,上文)。来自第一启动子的PEGl基因表达在phESC系中不受影响。PEGl基因父本表达区和父本表达的SNRPN基因的分析(Morison等,2005,上文)表明，与对照hESC系相比，这些基因的表达在phESC系中明显下调(图6FP)。这些结果提供所述phESC系单性生殖来源的进一步的证据。

实施例2.来自HLA纯合供体的hpSC-Hhom系的衍生。

对于分离HLA纯合单性生殖人干细胞系的最初目的，使用来自HLA纯合供体的卵母细胞。供体(供体1)和她的亲本的HLA基因型分型表明两个亲本均是杂合的。相同单元型A*25、B*18、DRB1*15从每个亲本遗传，供体具有HLA纯合基因型A*25、A*25、B*18、B*18、DRB1*15、DRB1*15(表5，例1)。

从供体1获得十九个卵泡卵母细胞复合体(COCs)，其中七个用于研究(表4)。

表4.单性生殖体和HLA纯合单性生殖人干细胞系的来源。

使用前述方案用A23187和6-DMAP处理进行单性生殖活化(Revazova等，2007，上文)。四个单性生殖胚胎到达胚泡期，其中一个可进行hpSC-Hhom-1系分离。

通过SNP分析，hpSC-Hhom-1系细胞和供体1体细胞之间的基因型关联鉴定为“全同胞”(遗传匹配)。SNP标记物比较显示，供体1细胞显示出表现杂合性模式，而hpSC-Hhom-1细胞显示较低的杂合性比例。

HLA基因型分型表明，hpSC-Hhom-1系是HLA纯合的：A*25、A*25、B*18、B*18、DRB1*15、DRB1*15，并且与供体完全HLA匹配(表5，例1)。

表5.HLA基因型分型。

粗体强调供体母本的HLA单元型；下划线强调供体父本的HLA单元型，每个由供体然后由hpSC-Hhom系遗传。

来自HLA杂合供体的hpSC-Hhom系的衍生

由于HLA纯合卵母细胞供体很少发生，从获自HLA杂合供体的卵母细胞分离HLA纯合细胞系被寻求。总计，十八个COCs获自供体2，其中七个捐赠用于研究(表4)。使用不同的方案用A23187和嘌呤霉素处理将这些卵母细胞进行单性生殖活化。18小时后，在活化的卵母细胞中观察到第二极体挤出和一个前核的形成。从这些合子产生三个胚泡，允许两个hpSC-Hhom系的分离：hpSC-Hhom-2和hpSC-Hhom-3。

卵母细胞供体2的体细胞与hpSC-Hhom-2和hpSC-Hhom-3系之间进行的SNP分析显示为“父母/子女对”的关系。另外，与供体的杂合体细胞不同，这两个细胞系均显示整个基因组(所评估的SNP标记物)为纯合的。

基于HLA-基因型分型结果，来自这两个系的细胞显示HLA纯合：hpSC-Hhom-2系显示HLA基因型A*68、A*68、B*18、B*18、DRB1*13、DRB1*13，hpSC-Hhom-3系显示HLA基因型A*02、A*02、B*13、B*13、DRB1*07、DRB1*07(在所研究的基因座)。而且，每个hpSC-Hhom系遗传不同的HLA单元型，一个来自供体的父本，另一个来自供体的母本。在hpSC-Hhom-2系纯合状态中发现供体父本的HLA单元型(A*68、B*18、DRB1*13)，在hpSC-Hhom-3系纯合状态中发现供体母本的HLA单元型(A*02、B*13、DRB1*07)(表5，例2)。

从HLA杂合供体卵母细胞分离hpSC-Hhom系，根据HLA单元型进行选择。

作为最终步骤，进行具有中人群中已知高频率的HLA单元型的hpSC-Hhom系的分离。IVF候选物的HLA单元型筛选产生两个HLA杂合卵母细胞供体，其携带常见单元型。根据出版的HLA单元型频率表(Mori M.等，Transplantation(1997)64:1017-1027)，供体3(HLA单元型A*02、B*08、DRB1*03)和供体4(HLA单元型A*01、B*08、DRB1*03)(表5，例3和例4)携带美国人群中发现的常见单元型。但是，对于杂合HLA基因型，每个供体不但携带常见单元型，而且也携带一个较少见的单元型。因此，不可能完全准确地预测在分离的hpSC-Hhom系中会存在哪种单元型。

A23187和嘌呤霉素用于供体卵母细胞的单性生殖活化。从供体3的卵母细胞分离hpSC-Hhom系不成功，其中获得二十个COCs，10个卵母细胞捐赠用于研究。这些都没有达到胚泡期。而且，用于该供体的IVF方法在实现怀孕方面不成功。总之，这些发现可反映出来自这一特定供体的卵母细胞的较差质量(表4)。

从供体4获得27个COCs，十四个卵母细胞被捐赠用于研究。卵母细胞单性生殖活化后，获得两个胚泡，从其中分离hpSC-Hhom-4系(表4)。

通过SNP分析，hpSC-Hhom-4和供体4体细胞之间的基因型关联被鉴定为“父母/子女对”，与例2相似。与供体的杂合体细胞比较(1,174个杂合SNP标记物)，HpSC-Hhom-4系显示整个基因组(所评估的SNP标记物)为纯合的。

根据HLA基因型分型，hpSC-Hhom-4系是HLA纯合的(在所评估的基因座)并且具有美国人群中最常见的许多种群所共有的HLA单元型(表6)：A*01、B*08、DRB1*03(表5，例4)。

表6.在美国人群中根据种群的HLA单元型A*01,B*08,DRB1*03的频率和等级(改编自Mori M.等,1997,上文)。

种群^a	频率(％)^b	等级^c

CAU	5.1812	1
			NAT	4.7439	1

AFR	1.2491	2
			LAT	1.6733	3
ASI	0.3195	54

^a高加索美国人(Caucasian American，CAU)，土著美国人(Native American，NAT)，

非洲裔美国人(African-American，AFR)，拉丁裔美国人(Latin American，LAT)

和亚洲裔美国人(Asian-American，ASI)。

^bHLA-A,-B,-DR单元型频率

^c在每个种群中的各自等级

IVF操作引起四个供体中的三个怀孕(供体1、2和4)。高IVF成功率很大程度上归因于选择具有IVF怀孕的良好预后的供体。有趣的是，从供体2分离两个hpSC-Hhom系，其中供体由她的IVF操作怀了双胞胎。

hpSC-Hhom系的表征

来自所有hpSC-Hhom系的细胞显示所期望的人胚胎干细胞的形态学，形成致密叠集的集落，以及显示明显的核仁，具有小的细胞质核比。所有细胞表达常见的人胚胎干细胞标记物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT-4，而不表达SSEA-1——未分化的小鼠胚胎干细胞的阳性标记物(图7)。所有系显示高水平的碱性磷酸酶(图7)和端粒酶活性(图8)。

G-带核型分析表明，hpSC-Hhom-1和hpSC-Hhom-4系具有正常人46，XX核型(图9,A和B)。HpSC-Hhom-2和hpSC-Hhom-3系均源于单一供体，其显示核型异常。大约15％来自hpSC-Hhom-2系的细胞显示非整倍的染色体8：47，XX，+8核型(图9，C)；4.2％来自hpSC-Hhom-3系的细胞显示非整倍的染色体1：47，XX，+1核型(图9，D)。在对100个中期细胞分析时，在任何细胞系中都没有观察到X染色体异型(图9)。

HpSC-Hhom-4系保持未分化未分化超过27代。其它细胞系成功地培养超过至少21代。来自hpSC-Hhom-4系的细胞在悬浮培养中形成囊胚状体，并在体外分化后产生所有三胚层——外胚层、中胚层和内胚层——的衍生物(图10)。外胚层分化由神经元特异性标记物神经丝68(图10A)和NCAM(图10B)的阳性免疫细胞化学染色证实。分化的细胞对中胚层肌肉特异性标记物结蛋白(图10C)和α-辅肌动蛋白(图10D)也是阳性的。内胚层分化由α-胎蛋白的阳性染色证实(图10E)。

所有hpSC-Hhom系形成所有三胚层衍生物的能力通过皮下注射hpSC-Hhom细胞至免疫缺陷小鼠中而被进一步体内研究(图11)。在注射后大约两个月，所有hpSC-Hhom系能够形成畸胎瘤。未观察到畸胎癌的形成。也注射约四百万丝裂霉素C处理的用作phSC-Hhom细胞饲养层的人成纤维细胞作为对照，并且未显示畸胎瘤生长。

细胞移植物的组织学检测表明存在组织化的结构，包括：各种腺体类型(一些产生褐色色素，可能是胆汁色素)、软骨分化、良好形成的骨、间充质细胞、胶原纤维的高产量、脂肪组织、神经管和具有角化不全珠(pearls)的复层扁平上皮(图11)。这些发现表明，hpSC-Hhom在体内会分化成源于所有三胚层的组织。

虽然本发明已经参考上述实施例进行了描述，但是应理解，修改和变化包括在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅由所附权利要求书所限定。

Claims

1.分离的多能人干细胞系，其源于单性生殖胚泡，其中所述胚泡和所述干细胞系缺少父系印记，其中构成所述细胞系的至少一个细胞是：

a)一个或更多个单核苷酸多态性(SNPs)杂合的；或

b)一个或更多个HLA等位基因纯合的；或

c)(a)和(b)的组合。

2.权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞是HLA等位基因纯合的。

3.权利要求1所述的分离的细胞系，其中当被移植到无免疫应答小鼠中时，所述至少一个细胞形成畸胎瘤。

4.权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞与未受精的卵母细胞供体是MHC相容的。

5.权利要求4所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞与胚泡供体的一级血亲是MHC相容的。

6.权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞根据供体来源被实质上遗传印记。.

7.权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞(i)会在体外培养中增殖一年以上，(ii)在整个培养中保持分化为内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，以及(iii)当在成纤维细胞饲养层上培养时被抑制分化。

8.权利要求7所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞分化成下列细胞，选自：神经元细胞、心脏细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、以及少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、角化细胞、胰岛细胞、淋巴前体细胞、肥大细胞、中胚层细胞以及内胚层细胞。

9.权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞由于缺少父系印记而不具有形成可存活生物体的能力。

10.权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一个细胞表达一个或更多个选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81以及OCT-4的标记物。

11.包括分化细胞的细胞组合物在制备用于治疗下列疾病的药物中的应用：帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏症、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉萎缩症、囊性纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、黄斑变性、软骨缺陷或损伤、烧伤、足部溃疡、血管疾病、尿路疾病、AIDS以及癌症，其中所述分化的细胞源于权利要求1所述的干细胞系。

12.多能干细胞库，其包括自体或同种异体干细胞，其中所述干细胞源于来自一个或更多个人供体的单性生殖活化的卵母细胞，以及其中所述干细胞是HLA纯合干细胞并且缺少父系印记。

13.权利要求12所述的库，其中根据单核苷酸多态性(SNP)标记物，每个库成员被鉴定为全同胞、半同胞或不相关。

14.权利要求12所述的库，其中所述卵母细胞供体与所述库中的成员是组织相容的。

15.权利要求12所述的库，其中所述库的成员根据所述卵母细胞供体来源被基因组印记。

16.权利要求12所述的库，其中干细胞源于HLA杂合或HLA-纯合的卵母细胞供体。

17.权利要求12所述的库，其中每个成员对于不同于其它库成员的MHC/HLA等位基因组合而言是纯合的。

18.权利要求12所述的库，其中每个成员是至少一个或更多个HLA I类基因和HLA II类基因纯合的。

19.权利要求12所述的库，其中所述HLA I类基因选自HLA A*、HLA B*、HLA以及Cw*单元型组合。

20.权利要求12所述的库，其中所述HLA II类基因选自HLADRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQA1*以及DQB1*单元型组合。

21.权利要求12所述的库，其中每个成员(i)会在体外培养中增殖一年以上，(ii)在整个培养中保持分化为内胚层、中胚层和外胚层组织之一或全部的衍生物的潜能，以及(iii)当在成纤维细胞饲养层上培养时被抑制分化。

22.权利要求21所述的库，其中每个成员保持这样的核型，其中染色体是整倍体并且在延长培养中不改变。.

23.权利要求12所述的库，其中每个成员可分化成外胚层、中胚层和内胚层生殖系细胞。

24.权利要求12所述的库，其中每个库成员根据HLA-型表征，并且每个成员与潜在受体是HLA-匹配的。

25.细胞库，其包括HLA-纯合多能干细胞，其中所述干细胞源于来自HLA-纯合或HLA-杂合人卵母细胞供体的单性生殖活化的卵母细胞并且其中所述干细胞缺少父系印记。

26.权利要求25所述的细胞库，其中所述干细胞通过与给定群体中常见的HLA-单元型的同一性来分选。

27.权利要求25所述的细胞库，其中所述细胞库包括冷藏的自体或同种异体干细胞。