CN104640996B - 利用ii型曲霉菌胃蛋白酶制备明胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备明胶的方法，其包括用包含与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少70％同一性的酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料的步骤，以及制备明胶。本发明涉及通过本文所公开的方法制备的明胶。
Description
技术领域
本发明属于一种通过对胶原进行酶处理来制备明胶的方法。
背景技术
明胶是通过使胶原增溶而获得的肽和蛋白质的混合物。胶原主要是通过使用碱或酸预处理从各种动物副产品(例如骨和表皮)提取而来。
传统上，明胶可使用热水从胶原中提取，其中进行多级提取以使胶原增溶成明胶。通常，可使用三个热水提取温度级：(1)50-55℃；(2)60-65℃；和(3)70-75℃。提取中所用的水温越高，则获得的胶原增溶越高，而明胶强度越低。胶原包含三条多肽链，所谓的α链(α、α1和α2)，这些胶原肽在提取期间被增溶。增溶后，可对明胶(增溶的胶原)进行进一步的处理，例如过滤、澄清和干燥。
使用热水提取明胶的缺点是浸灰(liming)工艺和提取工艺需要大量的水和较长的时间。
作为替代，已描述用于从胶原中提取明胶的酶法工艺。酶通常用于改进或代替明胶工艺中的预处理步骤(例如浸灰)，或用于提高较低温度下热水提取期间的明胶产率。
CN102051130比较了酸性蛋白酶、胃蛋白酶(pepsin)和若干种中性蛋白酶用于从脱脂脱矿的骨中提取明胶的用途。CN102051130中所公开的方法的缺点是明胶提取中仍需要大量的水，并且要施加额外的加热步骤来获得高明胶产率。
CN102329843公开了来自黑曲霉(A.niger)的酸性蛋白酶用于从骨胶原中提取明胶的用途，其中酶促反应需要小心控制以防止酶过度反应。
本领域中已知的用于明胶提取的酶法的缺点是胶原的非特异性蛋白水解裂解。所用广谱蛋白酶如果未经小心控制就会产生小的蛋白质片段，并因此而降低明胶质量。
本发明的目的是提供一种用于酶法提取明胶的改进的方法，其中以高产率获得高质量的明胶。
发明内容
本发明涉及一种制备明胶的方法，其包括用包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料的步骤，以及制备明胶。
出人意料地发现，在用本文所公开的包含酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料的步骤期间，明胶产率高于用本领域已知的酶法所获得的明胶产率，同时保持了非常良好的明胶质量。本文所用的高产率为至少为60重量％，或至少为70重量％，或至少为75重量％的产率，良好的质量是指明胶的布卢姆值(Bloom value)为至少200，例如至少240或至少260。无需诸如加热处理的进一步的提取步骤，在用酸性蛋白酶温育胶原材料的步骤中存在这些高产率值。因此这些进一步的提取步骤可省略，本文所公开的制备明胶的方法可有利地降低生产成本。
在另一个实施方式中，本发明涉及具有相对于胶原α肽的重量至少10重量/重量％的大小为70至90kDa肽的明胶。
发明详述
本发明涉及一种制备明胶的方法，其包括用包含与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少70％同一性的酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料的步骤，以及制备明胶。
本文所用的方法中的酸性蛋白酶为最佳pH值为酸性pH值(例如介于1和6之间，或介于2和5之间，或介于3和4之间)的蛋白酶。
本文所公开的方法中有利地使用酸性蛋白酶，因为其产生具有高布卢姆值和良好胶凝性质的明胶。与已知的蛋白酶相比，本文所公开的方法中使用的酸性蛋白酶似乎可将胶原裂解成比本领域中已知的蛋白酶组合物更大的片段。
酸性蛋白酶可为倾向于在蛋白质或肽的某个特定氨基酸位置对所述蛋白质或肽进行裂解的酶。酸性蛋白酶可例如为组氨酸特异性蛋白酶。已发现，当在本文所公开的蛋白酶中使用组氨酸特异性蛋白酶时，可获得高质量的明胶。
本文所公开的方法中的酸性蛋白酶不是广谱蛋白酶。
酶组合物有利地包含酸性蛋白酶，其中所述酸性蛋白酶占所述酶组合物中的蛋白质的重量百分比至少为80％，例如占所述酶组合物中的蛋白质的重量百分比至少为85％、90％、95％、98％或99％。已发现，包含重量百分比至少为80％的酸性蛋白酶蛋白质的酶组合物产生良好质量的明胶。通过本文所公开的方法制备的良好质量的明胶包含相对于明胶中胶原α肽的重量至少10重量/重量％的大小为70至90kDa的蛋白质。
因此，本文所公开的方法中的酶组合物包含呈纯形式的酸性蛋白酶。
所述酸性蛋白酶可与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％、99％或100％同一性，或可包含SEQ ID NO:1。
所述酸性蛋白酶可源自任何合适的微生物，例如源自Rasamsonia、青霉菌(Penicillium)或曲霉菌(Aspergillus)属的真菌。优选地，酸性蛋白酶源自以下的种：踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonis emersonii)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)。
用包含酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料可在介于40℃和65℃之间，例如介于45℃和60℃之间，例如介于50℃和59℃之间，或介于52℃和58℃之间的温度下进行。
用酶组合物温育含胶原的材料可在介于1.0和4.5之间的pH，例如介于1.5和4之间的pH，例如介于2.0和3.5之间的pH下进行。
已发现，本文所公开的制备制备明胶的方法与热水、酸或碱工艺相比可在更短的时间段内进行，这具有较大的经济利益。用包含酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料可在介于0.5小时和10小时之间，例如于1小时和8小时之间或介于2小时和6小时之间的时段内进行。
本文所公开的方法中制备的明胶包括使胶原增溶。使胶原增溶包括各个胶原链或肽之间的分子(例如氢)的部分水解或裂解。已发现，通过本文所公开的方法中的用酸性蛋白酶温育胶原，与用本领域中已知的酸性蛋白酶获得的增溶的胶原的量相比，可使更高量的胶原增溶。本文所公开的制备明胶的方法还可包括将增溶的胶原与不溶性胶原分离。
所述制备明胶的方法可包括干燥明胶的另外的步骤。
在一个实施例中，本发明涉及包含相对于明胶中胶原α肽的重量至少10重量/重量％的大小为70至90kDa的肽的明胶。所述明胶优选地包含量为相对于胶原α肽的重量至少10至90重量/重量％或至少20至80重量/重量％或至少30至70重量/重量％的大小为70至90kDa的肽。所述肽的大小可介于72至88kDa，或介于74至86kDa，例如介于76至84kDa。
本发明还涉及一种制备包含相对于明胶中胶原α肽的重量至少10重量/重量％的大小为70至90kDa的蛋白质的明胶的方法，如本文上文中进一步所定义的。
在一个实施方式中，本发明还涉及通过本文所公开的方法可获得的明胶。
定义
来自IUMB的对酶的分类和命名的国际公认的方案包括蛋白酶。该体系将蛋白酶分类成内切蛋白酶和外切蛋白酶。内切蛋白酶在本文中被定义为以内切方式水解多肽中的肽键并且属于EC 3.4类的酶。内切蛋白酶根据催化机制分为亚-亚类。存在丝氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.23)、金属内切蛋白酶(EC 3.4.24)和苏氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.25)的亚-亚类。
序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列之间的关系。通常，在所比较的序列的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸序列之间的序列相关度，这根据情况通过此类序列串之间的匹配来测定。
测定同一性的方法被设计为在所测试的序列之间给出最大匹配。测定同一性和相似性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括BLASTP，公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)获得。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数为空位开放11.0、空位延伸1、Blosum 62矩阵。
含胶原的材料可为任何含胶原的物质，例如动物的骨或表皮，但也可为提取的或纯的胶原。胶原包含含有α肽(α、α1和α2)的链或肽。
明胶是肽和蛋白质的混合物并且提取自胶原，并且还可描述为胶原肽的胶原水解产物。
肽在本文中被定义为通过肽键连接的至少两条氨基酸构成的链。词语肽在本文中还可用于表示多肽。
多肽为包含至少30个氨基酸残基的链。
蛋白质由一个或多个折叠成球状或纤维形式的多肽组成。
组氨酸特异性蛋白酶为倾向于在肽或蛋白质中存在组氨酸残基的位置对肽或蛋白质进行裂解的蛋白酶。对酶裂解包括C端组氨酸残基的肽键的倾向性的测定使用EdansDabcyl底物通过LC-MC/MC来进行，例如本文“材料和方法”章节中所述。
具有广谱活性的蛋白酶对裂解蛋白质或肽时不对特定氨基酸表现出倾向性。
附图说明
图1：在pH2、3和4下用Aspergillopepsin II于50℃、55℃和65℃温育后的可溶性胶原的产率。
图2：用pH 2.5的Aspergillpepsin I(AFP)和pH 4.5的木瓜蛋白酶获得的来自骨材料的可溶性胶原的产率相对于用pH 2.5的Aspergillopepsin II(HSP)获得的来自骨材料的可溶性胶原的产率。为了比较，示出了pH4.5和pH 2.5下增溶而不添加酶的胶原的产率。
图3：Aspergillopepsin II作用所产生的胶原片段的SDS-PAGE分析。泳道1至3(从左到右)：泳道1-在pH 4.5下不添加酶于50℃温育4小时的I型胶原；泳道2–SeeBluePlus2分子量标记；泳道3–在pH 4.5下用Aspergillopepsin II于50℃温育4小时的I型胶原。箭头指示大约80kDa的肽片段。
材料和方法
Aspergillopepsin II的制备
使用例如WO 98/46772中所述的方法使Aspergillopepsin II(II型曲霉菌胃蛋白酶；An01g00530；蛋白质序列SEQ ID NO:1)的基因在黑曲霉宿主中过表达。WO 98/46772公开了如何在含有乙酰胺的琼脂板上选择转化体，以及选择目标多拷贝整合子。含有多拷贝表达盒的黑曲霉转化体被选择用来进一步生产样品材料。转化的黑曲霉菌株在改良型CSM发酵培养基中发酵，pH 6.2(该培养基含有40g/l麦芽糖、30g/l Bacto大豆蛋白胨、70g/l柠檬酸三钠盐二水合物、15g/l(NH4)2SO4、1g/l NaH2PO4*2H2O、1g/l MgSO4*7H2O、1g/l L-Arg、0.25ml/l Clerol防沫剂)。将所得的培养液过滤，过滤灭菌，然后超滤浓缩。将酶施加到Q-琼脂糖FF XK 26/20柱上，在50mmol/l pH 5.6乙酸钠中进行层析，然后用盐梯度洗脱。通过在4-12％的SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris Gel,Invitrogen)之后判断染色的蛋白质带的强度来定量各个级分中的Aspergillopepsin II蛋白质的存在。
Aspergillopepsin II蛋白酶活性(HPU)的测定
将20.0g来自牛血的血红蛋白(西格玛产品H2625)通过在室温下搅拌10分钟悬浮在大约700mL水中。在添加3.73g氯化钾(KCl)之后，用0.5mol/L盐酸将pH调节至1.75。用水将血红蛋白悬浮液的体积调节至1L。再次检查pH并调节至pH 1.75。
通过将如上文所公开制备的纯化Aspergillopepsin II溶解于含有3.73g/l KCl的KCl/HCl缓冲液(用2.0mol/L HCl调节至pH 1.75)中来制备酶溶液。为测试Aspergillopepsin II活性，将5ml血红蛋白溶液在40℃下加热，随后添加1ml活性介于5个和25个组氨酸蛋白酶单位(HPU/mL)的酶溶液来开始反应。30分钟后，通过添加5ml三氯乙酸溶液(140g/l)来终止反应以沉淀较大的肽片段。向5mL血红蛋白溶液和5ml三氯乙酸溶液的混合物中添加1.0ml酶样品来进行空白测量。将管在40℃下温育30分钟以完成沉淀。离心后，测量含有小肽的澄清上清液在275nm的光密度。将结果与1.1μg/mL L-酪氨酸溶液进行比较。
一个HPU是酶的量，该酶每分钟水解的血红蛋白的量使得溶液在275nm的光密度等于在0.1mol/L HCl溶液中含有1.10μg L-酪氨酸/ml的溶液的光密度。测试条件为：pH为1.75、温度为40℃、温育期间的血红蛋白浓度为16.7g/l。
活性(HPU/mL)＝(OD样品–OD空白/S)×11/30
其中：
Aspergillopepsin II裂解涉及组氨酸的肽键的特异性
使用E(Edans)-AAXAAK-(Dabcyl)-NH2(SEQ ID NO:2)荧光底物试剂盒来测试Aspergillopepsin II的裂解倾向性，其中“A”表示丙氨酸残基，“X”表示19个不同的各个氨基酸残基，均通过它们的单字母代码来指明。Dabcyl在底物完整时淬灭Edans荧光，在底物裂解时便不再淬灭Edans荧光。所述底物因此被称为荧光共振能量转移(FRET)肽。底物储液是用DMSO配成5mM浓度的溶液。反应混合物包含：195微升的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)或100mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)，缓冲液中加入2微升底物储液和5微升AspergillopepsinII(0.25mg/ml的50mM乙酸钠溶液，pH5.6)。将反应混合物在Tecan设备(瑞士)中于37℃下温育60分钟(λex＝340nm，λem＝485nm)。酶活性以每毫克蛋白质每分钟的相对荧光单位(rfu)测定。在于pH 4下测试的各种E(Edans)-AAXAAK-(Dabsyl)-NH2(SEQ ID NO:2)底物中，底物E(Edans)-AAHisAAK-(Dabsyl)-NH2(SEQ ID NO:3)对Aspergillopepsin II产生最高的rfu值，这意味着对裂解底物E(Edans)-AAHisAAK-(Dabsyl)-NH2的倾向性，即X位是组氨酸。
实例
实例1
通过Aspergillopepsin II进行胶原增溶的最佳条件。
源自牛跟腱的不溶性I型胶原获得自Sigma-Aldrich Chemie GmbH。制备在蒸馏水中pH范围在2至4的一系列2％(w/v)胶原悬浮液。在搅拌悬浮液期间通过添加1N硫酸来调节pH。将1.5％(v/w，以胶原干重计)Aspergillopepsin II酶(500HPU/ml)添加至胶原悬浮液。将胶原在摇振水浴中于设定温度(从50℃至65℃变动)下温育1小时。通过移除样品并在搅拌下用1M氢氧化钠使pH升至7来终止反应。随后，使悬浮液滤过沃特曼滤纸(Whatmanfilter paper)来移除固体残余物。通过总氮测定的Kjeldhal分析来测量增溶的胶原材料的蛋白质含量。仅在pH 2下测量未添加酶的胶原增溶。图1中的结果表明，在所有测试温度下，pH 2-3下所增溶的胶原的量高于pH 4下所增溶的胶原的量。65℃时pH 2下的未添加酶的胶原增溶高于50℃和55℃时的胶原增溶。
实例2
来自用Aspergillopepsin II和胃蛋白酶增溶的胶原的明胶的质量
源自牛跟腱的不溶性I型胶原获自Sigma-Aldrich Chemie GmbH。制备在蒸馏水中pH 2.5和pH 4.5的一系列4％(w/v)胶原悬浮液。在搅拌悬浮液期间通过添加1N硫酸来调节pH。将0.1％(v/w，以胶原干重计)Aspergillopepsin II(500HPU/ml)或0.1％的(v/w，以胶原干重计)来自猪胃粘膜的胃蛋白酶(Sigma-Aldrich,500U/ml)添加到胶原悬浮液中。将胶原悬浮液在摇振水浴中于50℃下温育4小时。通过从悬浮液中移除样品并用1M氢氧化钠使pH升至7来终止反应。随后，在约40℃使样品滤过沃特曼滤纸来移除固体残余物(以防止凝胶形成)。
使用纯牛明胶(Sigma-Aldrich)参考线通过折射计(便携式折射计ATAGO Tokyo)来测量以总固体百分比表示的增溶的胶原材料的蛋白质含量(产率)。
随后，将用Aspergillopepsin II和胃蛋白酶增溶的胶原样品在40℃的真空烘箱(Heraeus Instruments)中干燥，并将浓缩的明胶在温水中重新溶解至所需的蛋白质浓度。制备4％蛋白质凝胶样品来比较两种所得明胶的凝胶强度。
此外，制备两种其它样品：一种是来自Aspergillopepsin II处理过的胶原的6.6％蛋白质凝胶，另一种是来自商购牛表皮明胶(Sigma-Aldrich)的6.6％蛋白质凝胶。
冷却至室温后，将样品在8-10℃下储存过夜以凝胶定形。使用质构分析仪TA.XTPLUS(stable Micro systems)根据布卢姆方法测量4％凝胶的凝胶强度(以压缩克数计)和6.6％凝胶的布卢姆值。
表1示出了用Aspergillopepsin II进行胶原处理后的明胶(可溶性胶原)的产率为用胃蛋白酶进行处理的约3倍。此外，用Aspergillopepsin II获得的明胶与用胃蛋白酶获得的明胶相比凝胶强度增加。用Aspergillopepsin II处理后所得到的明胶具有与市售明胶相似的凝胶强度(布卢姆值)。
表1：用Aspergillopepsin II、胃蛋白酶制备的明胶和商购明胶(来自牛表皮)的产率和凝胶强度的比较。
实例3
使用Aspergillopepsin II从牛骨材料提取的明胶的布卢姆值
将100g牛骨切片用4％-6％盐酸处理以移除矿物质。盐酸浓度在浸渍过程中逐渐降至0.5％。一旦盐酸浓度保持不变，则终止脱矿质过程。
通过添加5-15％氢氧化钠溶液将pH值调节至4.2-4.4。
将骨切片用水洗涤以清洁骨表面上剩余的杂质，然后将骨粉碎至小于1-5mm的大小。
向预处理的骨颗粒中添加额外的水至湿骨与水的比率为1:7。添加0.1％(g/g湿骨)Aspergillopepsin II并在53℃下提取4小时。通过添加氢氧化钠将提取过程中的pH保持恒定在约4.2。
然后将材料以4000rpm(大约2800g)离心10分钟并收集上清液。以7:1的比率向残余物中加水并用0.1％(g/g湿骨)Aspergillopepsin II对明胶进行二次提取。二次提取在53℃下进行4小时，然后以4000rpm(～2800g)离心10分钟。
离心后根据折射计所测得的总固体含量计算产率。一次提取的产率介于50％至62％；二次提取的产率介于15％至27％。
将来自两次酶法提取的上清液合并，将pH调节至6以使酶失活。随后，使溶液滤过硅藻土并对过滤的溶液在70℃下进行真空浓缩，直至使用折射计所测的总固体含量为大约6.6％。
如上文所述使用质构分析仪测量所获得的明胶的布卢姆值(关于测定凝胶强度的方法，请参见1995年10月1日实施的中华人民共和国国家标准GB6783-94食品添加剂明胶)。
酶处理的骨材料的布卢姆值为约240g。
实例3中的结果表明可在从骨中提取胶原后使用Aspergillopepsin II获得良好质量(布卢姆值240)的明胶。
实例4
使用多种酶的骨材料明胶提取的产率。
每12小时用6％(w/w)盐酸溶液酸化骨切片，进行3天，以移除矿物质。在脱矿质过程结束时，将骨用水洗涤并用15％氢氧化钠溶液将pH调节至6。将脱矿质的骨磨碎至直径<5mm。向预处理的骨中加水至7:1的比率。在添加酶之前，用20％磷酸溶液将pH调节至所需的值。
为测试明胶提取(胶原增溶)的产率，将胶原用以下剂量为0.02％(v/w，酶:湿骨)的酶在50℃下温育4小时：
-Apergillopepsin II(500HPU/ml)，pH 2.5；
-Aspergillopepsin I(AFP 1000L,DSM产品,1000SAPU/g；EC.3.4.23.18)，pH 2.5；和
-木瓜蛋白酶(L,DSM产品，80-90U/ml)，pH 4.5；和
未添加酶的胶原样品，pH 2.5；和
未添加酶的胶原样品，pH 4.5。
通过用氢氧化钠将pH调节至6来终止酶反应，随后使材料滤过滤纸。
使用折射计来测量胶原增溶(总固体增溶)的产率。图2示出了用Aspergillopepsin II进行胶原温育导致最高产率的可溶性胶原(明胶)。
实例5
Aspergillopepsin II对胶原的特异性裂解
源自牛跟腱的不溶性I型胶原获自Sigma-Aldrich Chemie GmbH。制备在蒸馏水中pH 4.5的一系列4％(w/v)胶原悬浮液。在搅拌悬浮液期间通过添加1N硫酸来调节pH。向胶原悬浮液中添加0.1％(v/w，以胶原干重计)Aspergillopepsin II酶(500U/ml)或木瓜蛋白酶(L,DSM产品，80-90U/ml)或不添加酶。将胶原悬浮液在摇振水浴中于50℃下温育4小时。通过从悬浮液中移除样品并用1M氢氧化钠使pH升至7来终止反应。随后，在约40℃使悬浮液滤过沃特曼滤纸来移除固体残余物(以防止凝胶形成)。
使用Aspergillopepsin II酶(500U/ml)和胃蛋白酶(Sigma-Aldrich,500U/ml)在pH 2.5下进行如本文所述的pH 4.5下的类似实验。
使用Laemmli的方法通过SDS-PAGE来分析增溶材料中存在的肽产物。将样品与NuPage LDL样品缓冲液(Invitrogen Corp.)、还原剂混合并在70℃下加热10分钟。随后使用NuPage MES SDS电泳缓冲液将10μl样品加载到4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上。使用SeeBlue Plus2(Invitrogen)作为分子量标记。将凝胶用考马斯亮蓝染色。使用OptiGO扫描仪(Isogen life sciences)通过Totallab分析软件(Isogen life sciences)来测定蛋白质带的强度并计算蛋白质的重量。
图3为在pH 4.5下用Aspergillopepsin II获得的增溶的胶原的SDS凝胶的一个实例。该图示出了对应于约80kDa大小的显著的肽带。约80kDa的显著的肽带也存在于在pH2.5下用Aspergillopepsin温育的增溶的胶原中。
这种约80kDa的肽在用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶温育后不存在或几乎不可见(结果未示出)。
Claims (9)
1.制备明胶的方法，其包括用包含与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少99％同一性的酸性蛋白酶的酶组合物温育含胶原的材料的步骤，以及制备明胶，其中所述酸性蛋白酶占所述酶组合物中的蛋白质的至少90重量％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述温育在介于40℃和65℃之间的温度下进行。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述温育在介于1.5和4.5的pH下进行。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述温育在1至10小时的时段内进行。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶源自曲霉菌种。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中制备明胶包括使胶原增溶。
7.根据权利要求6所述的方法，其还包括将增溶的胶原与不溶性胶原分离的步骤。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其还包括干燥所述明胶的步骤。
9.明胶，其是根据权利要求1至8中任一项所述的方法制备的。
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