RU2740319C1

RU2740319C1 - Способ повышения активности тритикаина-альфа

Info

Publication number: RU2740319C1
Application number: RU2020111500A
Authority: RU
Inventors: Андрей Александрович ЗАМЯТНИН; Вадим Владимирович Тарасов; Людмила Владимировна Савватеева; Ольга Евгеньевна Чепикова; Виктор Александрович Мануйлов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Альфа-Тритикаин"
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2021-01-13

Abstract

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии. Предложен способ повышения активности белка тритикаина-альфа, включающий инкубацию тритикаина-альфа в буферном растворе с рН 3.6-5.0 в течение 15-90 мин при 37°С. Изобретение обеспечивает увеличение эффективности расщепления субстратов - компонентов глютена - в ЖКТ у пациентов с целиакией. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, биофармакологии, а именно, к получению белка тритикаина-альфа семейства цистеиновых протеиназ пшеницы (Triticum aestivum) с высокой протеиназной активностью, в том числе способностью эффективно расщеплять компоненты глютена. Изобретение может быть использовано в целях изучения функционирования папаин-подобных цистеиновых протеиназ, а также в фармакологии и медицине для разработки ферментных терапевтических препаратов на основе тритикаина-альфа.

Уровень техники

Тритикаин-альфа является высококонсервативной папаин-подобной цистеиновой эндопротеазой пшеницы, состоящей из сигнального (лидерного) пептида, удаляющегося при активации про-пептидного домена, гранулин-подобного домена [GenBank АВ267407] и каталитического домена с каталитической триадой Cys-His-Asn. Основным преимуществом папаин-подобных цистеиновых протеиназ из семян растений на данный момент является их эндопептидазная активность, в частности, глютеназная активность - способность эффективно гидролизовать пептиды глютена (запасного белка пшеницы, состоящего из смеси мономерных глиадинов и полимерных глютенинов) или родственных запасных белков ржи и ячменя. Это свойство тритикаина-альфа позволяет считать его перспективным объектом при разработке лекарственных средств для лечения глютен-зависимых расстройств, например, целиакии.

Целиакия - аутоиммунное воспаление слизистой оболочки тонкой кишки с ее атрофией у лиц с генетически детерминированной чувствительностью к глютену, встречающееся примерно у 1% населения в мире. Единственным эффективным способом лечения больных, признанным в мире считается пожизненная строгая безглютеновая диета [Курадаа, Абхиджит Ядава, Дэниэл А. Леффлера «Существующие и новейшие стратегии лечения целиакии», Экспертная оценка клинической фармакологии, 2016 http://dx.doi.org/10.1080/17512433.2016.1200463].

Из уровня техники известен способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом [RU 2603054]. Для получения усеченной формы тритикаина-альфа пшеницы, имеющей последовательность (shortTRIT-α), рекомбинантно экспрессирующейся в бактериальной системе, проводят культивирование клеток Е. coli JM109, трансформированных плазмидой, содержащей последовательность ДНК, кодирующей белок shortTRIT-α, с последующей очисткой целевого белка shortTRIT-α методом аффинной металл-хелатной хроматографии. После чего определяют концентрацию белка shortTRIT-α, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.

Данное изобретение позволяет получить чистый белковый препарат с высоким выходом, уровнем очистки и протеолитической активности (до 50 уд.е. (нМ/с)), который при растворении лиофилизированной формы в воде характеризуется значением рН 7.8. Однако получаемой активности белка в некоторых случаях может быть недостаточно для эффективного расщепления определенных субстратов, например, богатых пролином белковых последовательностей глютена в больших количествах.

Из уровня техники известны препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата [RU 2676322]. Биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, представляет собой определенную аминокислотную последовательность, экспрессирующийся в растворимой форме. Способ получения биологически активного белкового препарата также включает трансформацию клеток плазмидами, содержащими последовательность ДНК, кодирующую белок shortTRIT-α, культивирование и выделение биологически активного препарата. Изобретение обеспечивает возможность получения тритикаина-альфа в растворимой форме на уровне секреции в клетках-хозяевах.

Данное изобретение позволяет получать препарат тритикаина-альфа с высоким и стабильным выходом, высоким уровнем очистки и функциональной активности. Однако получаемый белок также характеризуется протеолитической активностью до 50 уд.е. (нМ/с), которой для некоторых применений может оказаться недостаточно.

Из уровня техники не выявлено решений, направленных на повышение протеолитической активности тритикаина-альфа.

Технической проблемой, решаемой изобретением, является получение белка тритикаина-альфа с высокой протеолитической активностью (более 50 уд.е. (нМ/с). Тритикаин-альфа, получаемый известными способами, обладает базовой протеолитической активностью менее 50 уд.е. (нМ/с), что было показано в соответствующих материалах (например, [RU 2603054] и [RU 2676322]) с использованием субстратов - глютена и флуорогенного синтетического пептида PLVQ. При этом все препараты, полученные известными способами, характеризуются значениями рН 7.8-8.0.

Результаты проведенных исследований, представленных в настоящем изобретении, показали, что значительное повышение активности тритикаина-альфа (более, чем в 2 раза) может быть достигнуто при его инкубации в среде, приводящей к понижению рН раствора белка до значений 3.6-5.0 в течение не менее 15 мин при 37°С.

Раскрытие изобретения

Технический результат заключается в увеличении активности тритикаина-альфа, приводящей к повышению эффективности расщепления субстратов.

Технический результат достигается посредством реализации способа, заключающегося в том, что полученный любым из известных способов белок, исходно обладающий протеолитической активностью (например, активность тритикаина-альфа, рекомбинантно экспрессируемого в бактериях и полученного по способу [RU 2676322] или [RU 2603054] составляет не более 50 уд.е., где активность рекомбинантного тритикаина-альфа определяют по способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат PLVQ-AMK, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (AMK), с определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK), подвергают активации (до реакции предполагаемого расщепления субстратов) посредством помещения в среду (буферный раствор) с кислым значением рН (3.6-5.0) на время не менее 15 при 37°С. Время выдерживания белка в буферном растворе определяется тем временем, когда белок становится максимально активированным, но еще не подвергается автопротеолитическим процессам. В качестве буферного раствора может быть использован натрий-ацетатный буфер, либо любой буферный раствор, обеспечивающий поддержание кислых значений рН в указанном диапазоне значений. Оптимальными условиями для максимального повышения активности тритикаина-альфа является инкубация белка в среде с рН 4.6 в течение 90 мин при 37°С. При этом количество буфера определяется способностью поддерживать стабильное значение требуемого рН. Активированный таким образом фермент осуществляет более эффективный протеолиз (расщепление) субстратов. Полученный раствор активированного белка может выступать в качестве конечного продукта для применения в реакциях расщепления субстратов.

Повышение эффективности расщепления компонентов глютена в ЖКТ у пациентов с целиакией может быть достигнуто посредством перорального приема тритикаина-альфа, полученного указанным способом, в терапевтически эффективном количестве во время приема или сразу после приема пищи.

Способ по изобретению может быть рекомендован в случае необходимости использования фермента с повышенной активностью для расщепления иммуногенных пептидов глютена в ЖКТ у пациентов с целиакией, а также людей, страдающих различными видами глютеновой непереносимости при обеспечении формирования в ЖКТ среды с соответствующими параметрами кислотности. В условиях ЖКТ человека этих параметров можно добиться, принимая перорально тритикаин-альфа в качестве ферментативной добавки во время приема пищи, т.е. когда кислотность желудка повышается путем разбавления желудочного сока пищевыми продуктами, а для переваривания глютен-содержащих продуктов требуется в среднем от 2 до 4 ч.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется иллюстративным материалом, где на фиг. 1 представлена гистограмма, демонстрирующая специфическую (протеолитическую) активность тритикаина-альфа до и после активации при различных значениях кислотности (неактивированный фермент «0»), фермент после 15, 45 и 90 мин инкубации в среде с соответствующим значением рН) (гистограмма приведена для репрезентативности результатов, а количество гидролизованного субстрата PLVQ-AMK определяли по интенсивности флуоресценции свободного AMK с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм; скорость реакции определяли по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессии); на фиг. 2 представлены электрофореграммы в 14% полиакриламидном геле в присутствии SDS. Активация тритикаина-альфа в различных условиях (рН 2.6-7.5) в интервале времени от 2 до 90 мин. Стрелками показаны полосы, соответствующие образованию и накоплению активированной формы фермента; на фиг. 3 - электрофореграмма в 14% полиакриламидном геле в присутствии SDS. Расщепление глютена (Glt, контроль) тритикаином-альфа (Ttc-α, контроль в водном растворе) при различных рН-условиях активации.

Осуществление изобретения

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Белок может быть получен любым известным из уровня техники способом, например, по способу [RU 2603054], согласно которому культивируют клетки Е. coli JM109, трансформированные плазмидой pQE80L_shortTRIT-α, содержащей последовательность ДНК, кодирующей белок shortTRIT-α (SEQ ID NO: 2, [RU 2603054]), в среде LB с добавлением ампициллина при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, инокулируют посевным материалом питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом и растят еще 2.5-3 часа; очистку целевого белка проводят методом аффинной металл-хелатной хроматографии: осажденную центрифугированием клеточную биомассу экспрессионной культуры ресуспендируют в буфере, содержащем 0.01 М Трис-HCl, рН 8.0 и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученный после центрифугирования лизата осадок промывают исходным буфером и растворяют в буфере А, состоящем из 6 М гуанидин-хлорида и 0.05 М Трис-HCl, рН 7.8, раствор осветляют центрифугированием и наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А и тем же буфером с содержанием 8 М мочевины и 0.005 М имидазола, белок элюируют буфером А с содержанием 8 М мочевины и 0.25 М имидазола, затем элюат добавляют в охлажденный буфер 0.05 М Трис-HCl, 0.5 М аргинин-хлорид, 2 М мочевина, рН 7.8 в соотношении 1:5 и перемешивают 1 ч при 4°С, раствор диализуют против 0.05 М Трис-HCl, рН 7.8 при 4°С, супернатант, полученный после центрифугирования диализата, концентрируют на ячейке Amicon с мембраной РМ-10 (Millipore), с последующим диализом против фосфатно-солевого буфера PBS, рН 7.4, при 4°С, определяют концентрацию белка shortTRIT-α, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.

Навеску белка растворяют в воде, определяют концентрацию раствора белка и отбирают количество, соответствующее 20 нМ для реакции гидролиза 50 мкМ PLVQ-AMK в 100 мМ ацетатном буфере, рН 5.6, содержащем 100 мМ NaCl, 15 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.6 мМ ЭДТА, 0.5% ДМСО при 37°С. Количество гидролизованного субстрата PLVQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции свободного AMK с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм; скорость реакции определяли по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессии. Удельная активность тритикаина-альфа при этом составляет не более 50 уд.е. (нМ/с).

При необходимости использования фермента с повышенной активностью реализуют заявляемый способ, согласно которому полученный ранее тритикаин-альфа (в любой форме - в виде лиофилизата или раствора белка) активируют путем инкубации в соответствующей среде в течение определенного времени (т.е. в растворах с заданными значениями рН и времени). В качестве среды могут быть использованы любые буферные растворы, обеспечивающие поддержание заданных значений рН (3.6-5.0), при этом количество буфера определяется способностью поддерживать стабильное значение требуемого значения рН раствора белка. Активированный таким образом белок далее используют в протеолитических реакциях для наиболее эффективного расщепления субстратов. Так, после активации белка в кислой среде (рН 4.6) протеолитическая активность белка может достигать 300 уд.е. и выше.

Для подтверждения полученной активности тритикаина-альфа и эффективности расщепления компонентов глютена проводили протеолитическую реакцию активированного при различных условиях белка с глютеном при рН 4.6 и 37°С в течение 5 мин в весовом соотношении 1:20.

На первом этапе была исследована способность тритикаина-альфа к образованию активированной формы в диапазоне рН 2.6-7.5 в течение различных интервалов времени от 2 до 90 мин. Образцы готовили следующим образом. К лиофилизированным образцам белка, полученным выше описанными способами [RU 2676322, RU 2603054], добавляли 0.1 М буферные растворы с заданными значениями кислотности до конечной концентрации тритикаина-альфа 1 мг/мл. В качестве буферных растворов использовали глициновый (рН 2.6), ацетатный (рН 3.6, 4.6, 5,0 и 5.6) и фосфатный буфер (рН 6.5 и 7.5). Далее отбирали количество белка, соответствующее 75 мкг и помещали в тот же буфер с соответствующим значением рН для проведения реакции активации в конечном объеме 200 мкл. Реакционные смеси инкубировали в течение 2, 5, 15, 45, 90 и 120 мин при 37°С, отбирая пробы для измерения активности с использованием флуорогенного субстрата и на электрофорез.

Протеолитическую активность тритикаина-альфа до и после активации (инкубации) определяли по способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат PLVQ-AMK, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (AMK), с определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK как описано ранее [RU 2603054] (анализ проводят при 25С в реакционной смеси, состоящей из 20 нМ тритикаина-альфа и 50 мкМ PLVQ-AMK в 200 мМ ацетатном буфере, рН 5.6, содержащем 100 мМ NaCl, 15 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.6 мМ ЭДТА, 0.5% ДМСО; количество гидролизованного субстрата PLVQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции свободного AMK с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм; скорость реакции определяли по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессии).

На втором этапе была исследована способность активированной формы тритикаина-альфа, образующаяся при различных рН и времени активации, к расщеплению природного субстрата фермента - глютена. Аликвоту раствора белка в соответствующем буфере после реакции активации разбавляли в 5 раз 0.1 М ацетатным буфером, рН 4.6 до конечной концентрации 0.075 мг/мл и добавляли раствор глютена (60 мг/мл в 70% этаноле) в 20-кратном избытке. Протеолитическую реакцию проводили в течение 5 мин при 37°С, после чего отбирали пробы на электрофорез.

Оценивали образование активированной формы тритикаина-альфа по интенсивности флуоресценции метки (свободного AMK в реакции с синтетическим пептидом, фиг. 1; для репрезентативности данные по специфической активности представлены в виде гистограммы) и методом электрофореза в 14% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 2), а также образование продуктов протеолитического расщепления глютена тритикаином-альфа, активированного при различных значениях рН (фиг. 3) методом электрофореза в 14% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Сравнивали активность тритикаина-альфа неактивированного и активированного путем инкубации в буферных растворах с широким диапазоном рН, по увеличению интенсивности метки в реакции с синтетическим пептидом (фиг. 1), по наличию интенсивности окрашивания полос соответствующего размера активированной формы тритикаина-альфа в полиакриламидном геле (фиг. 2), а также по способности фермента расщеплять глютен, характеризующейся уменьшением количества и интенсивности окрашивания соответствующих глютену полос в полиакриламидном геле (фиг. 3).

Из полученных результатов по активации при различных условиях и проявлению активности активированного тритикаина-альфа следует, что заметная активация тритикаина-альфа происходит в диапазоне значений рН (3.6-5.0) при инкубации не менее 15 мин. Наиболее эффективное расщепление глютена происходит с использованием фермента, предварительно активированного при рН 4.6 в течение 90 мин. (фиг. 3; расщепление глютена при разных значениях рН происходит с разной степенью эффективности).

Таким образом, изобретение обеспечивает возможность получения активированной формы фермента с повышенной активностью, позволяющей с более высокой эффективностью расщеплять субстраты, в частности, компоненты глютена, а также обеспечивает возможность рекомендовать тритикаин-альфа к применению в качестве ферментативной добавки путем перорального введения во время или сразу после приема пищи.

Claims

1. Способ повышения активности тритикаина-альфа, включающий инкубацию тритикаина-альфа в буферном растворе с рН 3.6-5.0 в течение 15-90 мин при 37°С.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве буферного раствора используют натрий ацетатный, ацетатный буфер, или цитратный или фосфатный буферные растворы.