CN104623701A

CN104623701A - 一种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒方法及获得的制剂

Info

Publication number: CN104623701A
Application number: CN201410830921.0A
Authority: CN
Inventors: 陈海; 王强; 蒋德席; 冉曙光; 杨德军; 何海兵
Original assignee: SICHUAN YUANDA SHUYANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104623701B

Abstract

本发明公开了一种高效灭活凝血酶原复合物中细小病毒PPV的方法，经S/D灭活的凝血酶原复合物制剂冻干后再经干热处理，干热处理的方法是80℃处理2～10h，再在100℃处理30～120min。本发明还公开了该方法制备得到的血酶原复合物制剂。本发明灭活方法可以有效灭活猪细小病毒(PPV)大于4log，本发明方法制得的凝血酶原复合物制剂，除了病毒安全性更高，长期稳定性更好，于2～8℃放置3年全检合格，其FIX回收率90％以上，第Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ凝血因子无显著损失，且维持良好比例。同时，本制备方法成本低廉，比传统80℃72小时干热灭活成本低。

Description

一种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒方法及获得的制剂

技术领域

本发明涉及血浆制品领域，具体涉及一种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒方法及获得的制剂。

背景技术

凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)，它含有凝血因子IX、II、X、及少量其他血浆蛋白。主要用于预防和治疗因凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ及Ⅹ缺乏导致的出血，如乙型血友病、严重肝病及弥散性血管内凝血(DIC)等，还可用于逆转抗凝剂(如香豆素类、茚满二酮等)诱导的出血，对已产生凝血因子Ⅷ抑制性抗体的甲型血友病患者也有作用。

凝血酶原复合物是多种凝血因子组成的复合物，是一种特殊的血液制品。由于血液制品来源于人血浆，通常由多人份血浆混合后经特定分离纯化技术制备而成，理论上经血液传播的疾病也可经血液制品传播，目前，常见的血液制剂携带并传播的病毒主要有HBV、HCV、HIV和HTLV-1、CMV、EBV、HAV、细小病毒等。

为了提高血液制品的安全性，根据相关指导原则要求，血液制品生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法，同时，全球公认的有效的灭活病毒效果应该达到4.0log以上，我国监管部门也严格要求干热处理工艺灭活猪细小病毒PPV达到4.0log以上。

血液制品病毒灭活方法分为物理灭活方法和化学灭活方法，物理灭活方法通常有巴氏消毒法、干热法、γ射线辐照法、短波紫外线法，化学方法通常有有机溶剂/去污剂(S/D)处理法、低pH值孵放法、辛酸灭活法、光化学法。化学灭活方法仅对脂包膜病毒有较好的效果，而对非脂包膜病毒的效果微乎其微，且化学灭活方法中需要添加一种或多种生化试剂，其长期安全性还须验证。(宋清爽等，“血液制品病毒灭活及去除工艺进展”，生物技术通讯，2012年04期)。大多数生物制品大都采用真空冷冻干燥的方法制成终制品，干热灭活法是较为可行的终端灭活方式。

目前，干热灭活通常采用80℃处理72小时，或100℃处理30分钟的工艺。其中，80℃处理72小时的干热灭活工艺，成本高，各种凝血因子活性损失大；尽管100℃处理30分钟的干热灭活工艺，成本虽低，但事实上病毒灭活效果却不佳，特别是难以有效灭活细小病毒(如PPV)，Kim等报道100℃水浴30min处理，仅使PPV(猪细小病毒)的滴度下降了1.90log。项庆军等在“最终干热处理对凝血因子浓缩剂中非包膜病毒的作用”中报道，采用90℃10hr的干热灭活工艺，对CPV(犬细小病毒)灭活仅2.1log(国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册，1995年06期)。

另外，因凝血酶原复合物不稳定，分离纯化时，需在最终配制时加入保护剂，使产品能耐受冻干及干热处理。目前，为了保证凝血酶原复合物的最终效价，需要同时加入多种干热保护剂，成本也较高。若采用单一干热保护剂，则保护效果不佳，难以保证凝血酶原复合物的效价，如，公开号：1524578的专利申请公开了一种在凝血酶原复合物溶液中加入精氨酸等作为干热保护剂的方法，其中，精氨酸的加入量可以为0.1％～5％，优选为0.5％和1％，且必须联合使用甘氨酸和或蔗糖，但是，申请人实际应用时，发现其对凝血酶原复合物的保护效果并不理想，尤其是在同甘氨酸和或蔗糖配伍时，干热处理后制品颜色变黄，复溶外观差，有蛋白絮状物析出，可见异物不合格，而且人凝血因子的活性回收率不高，尤其是因子II、VII回收率不理想。申请人试验还发现采用80℃处理72h的方式,人凝血因子IX的活性损失高达约20％，这一结果与王益寿等研究结果一致(中国输血杂志1998年第11卷第4期P195，人凝血酶原复合物的病毒灭活与验证)。所以，公开文献采用80℃处理72h的方式难以保证本发明产品的效价回收率，而采用100℃处理30min不能保证耐热非脂包膜病毒(如PPV)的安全性(Santagostino E.et al.,“Transmission of Parvovirus B19by Coagulation Factor Concentrates Exposed to 100 Degrees C Heat After Lyophilization,”Transfusion 37(5),517–522(May 1997)。

改进凝血酶原复合物干热处理工艺，以确保灭活病毒效果达标，而且要保证理化性质合格(特别是复溶外观，可见异物)和生物学活性(尤其是FIX和FII、FVII、FXI活性回收率)、以及维持有效期内的稳定性是十分必要和迫切的。

发明内容

本发明提供了一种新的高效灭活凝血酶原复合物中细小病毒PPV的方法及获得高度稳定的凝血酶原复合物制剂的制备方法，以及该方法制得的凝血酶原复合物制剂。

申请人通过试验惊讶地发现，采用本发明80℃处理4h，再在100℃处理30～60min的干热灭活方式，可以有效保证产品的外观和效价回收率，其中，80℃处理4h，再在100℃处理30min的方式，效价回收率最高(97.8％)，而80℃处理4h，再在100℃处理60min的方式，不仅有充分效保证凝血因子IX的效价回收率(97.0％)，还因灭活时间更长，确保了耐热细小病毒(如PPV)可灭活大于4log以上，生产的产品安全性更高。本发明所制备得到的人凝血酶原复合物具有良好的稳定性：2～8℃保存期长达36个月，按中国药典全检合格。

另外，本发明灭活方法较传统80℃72小时干热灭活方法，时间缩短90％以上。

本发明凝血酶原复合物制剂的病毒灭活工艺，步骤如下：取凝血酶原复合物制剂冻干品，干热处理，其中，干热处理的方法是80℃处理2-10h，再在100℃处理30-60min。

优选地，所述干热处理的方法是80℃处理4h，再在100℃处理30～60min。

进一步优选地，所述干热处理的方法是80℃处理4h，再在100℃处理60min。

本发明凝血酶原复合物制剂制备方法，它包括如下步骤：

(1)取血浆，分离纯化得到含凝血酶原复合物的溶液；

(2)在步骤(1)所得溶液中，加入溶液2～4％(w/v)的精氨酸或其盐类，分装、冻干，按照前述方法干热处理，即可。

步骤(1)中，所述分离纯化方法为：用凝胶吸附血浆，洗脱，将洗脱液超滤，病毒灭活，二次凝胶吸附，洗脱，即可。

步骤(1)中，所述含凝血酶原复合物的溶液中，人凝血因子IX的活性不低于10IU/ml，人凝血因子II的活性不低于10IU/ml、人凝血因子X的活性不低于10IU/ml，人凝血因子VII的活性不低于5IU/ml。

步骤(2)中，所述精氨酸或其盐类的加入量为溶液的2.4～4％(w/v)，进一步优选地为2.4～2.5％，再进一步优选为2.4％。

所述精氨酸的盐类为盐酸精氨酸。

本发明还提供了前述方法制备得到的凝血酶原复合物制剂。

采用本发明病毒灭活方法，可以有效灭活耐热细小病毒，安全性高；同时，本发明方法制得的凝血酶原复合物制剂稳定性好，2～8℃ 36个月全检合格，第Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ凝血因子无显著损失，且维持良好比例；本发明灭活方法较传统80℃72小时干热灭活方法，时间缩短90％以上，生产成本显著降低。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是制备本发明凝血酶复合物制剂的示意图。

具体实施方式

实验材料：枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸、肝素钠、DEAESephedex A50(注：以下简称DEAE-A50)凝胶均为市售品。

实施例1 本发明凝血酶原复合物制剂的制备

如图1所示示意图，制备本发明凝血酶复合物制剂：

1、凝血酶复合物溶液的制备

Ⅰ、分离纯化

收集吸附血浆后的A50凝胶，用3-10倍凝胶量的洗涤液(溶液组成：0.1～0.3M NaCl，0.01～0.03M柠檬酸钠，pH:6.5～7.5)冲洗凝胶，然后再用3～10倍凝胶量的洗脱液(配方：0.01～0.03M枸橼酸钠+1M～2M氯化钠，pH6.5～7.5)将制品洗脱下来，收集洗脱蛋白液进行超滤。

II、S/D灭活

将11％S/D浓液(配方：11％吐温-80+3.3％磷酸三丁酯)缓慢加入蛋白浓缩液中，边搅拌边加入，使Tween 80终浓度为0.8～1.2％，TNBP终浓度为0.24～0.36％,pH值6.5～7.5,加入完毕后于24～26℃下保温6小时。

III、精制

(1)制品的再吸附

将S/D灭活后的蛋白液按血浆总量0.5～1.5％加入预平衡的DEAE－A50凝胶，搅拌吸附30～90分钟后收集A50凝胶，用3～10倍凝胶量的洗涤液(溶液组成：0.1～0.3M NaCl，0.01～0.03M柠檬酸钠，pH:6.5～7.5)冲洗凝胶。

(2)纯化超滤

然后再用3-10倍凝胶量的洗脱液(配方：0.01～0.03M枸橼酸钠+1M～2M氯化钠，pH6.5～7.5)将制品洗脱下来，收集洗脱蛋白液进行超滤。将制品浓缩至IX因子效价在30IU/ml以上，即得凝血酶原复合物溶液。

经检测，所得凝血酶原复合物溶液中，人凝血因子IX的活性为10～40IU/ml，人凝血因子II的活性为不低于10IU/ml、人凝血因子X的活性为不低于10IU/ml，人凝血因子VII的活性为不低于5IU/ml。

2、干热灭活

(1)取步骤1制备得到的凝血酶原复合物溶液，加2％(w/v)的精氨酸，除菌、分装、冻干；

(2)干热处理：在80℃处理4h，再在100℃处理60min，即得本发明凝血酶原复合物制剂。

实施例2 本发明凝血酶原复合物制剂的制备

如图1所示示意图，制备本发明凝血酶复合物制剂：

1、凝血酶复合物溶液的制备

同实施例1。

2、干热灭活

(1)取步骤Ⅰ制备得到的凝血酶原复合物，加3％(w/v)的精氨酸，除菌、分装、冻干；

(2)干热处理：在80℃处理10h，再在100℃处理30min，即得本发明凝血酶原复合物制剂。

实施例3 本发明凝血酶原复合物制剂的制备

1、制备方法

1、凝血酶复合物溶液的制备

同实施例1。

2、干热灭活

(1)取步骤Ⅰ制备得到的凝血酶原复合物，加4％(w/v)的盐酸精氨酸，除菌、分装、冻干；

(2)干热处理：在80℃处理2h，再在100℃处理60min，即得本发明凝血酶原复合物制剂。

实施例4 本发明凝血酶原复合物制剂制备方法的筛选试验

一、实验方法

(一)凝血酶原复合物制剂的制备

1、制备方法

1、凝血酶复合物溶液的制备

同实施例1。

2、干热灭活

(1)取步骤Ⅰ制备得到的凝血酶原复合物溶液，加如下几种保护剂：①2％甘氨酸；②2％甘氨酸+1％精氨酸；③2.4％精氨酸；④2.5％精氨酸；⑤3％精氨酸；⑥1％精氨酸；⑦1.5％精氨酸；⑧4.5％精氨酸；⑨5％精氨酸，除菌、分装、冻干；

其中，①号、②号是以甘氨酸或甘氨酸与精氨酸的混合物为保护剂的制剂；③号～⑤号为本发明制剂；⑥号～⑨号是以精氨酸为保护剂的制剂，精氨酸的用量在本发明范围外。

(2)干热处理：在80℃处理4h，再在100℃处理60min，即得。

(二)凝血酶原复合物样品的准备

取步骤(一)制备的凝血酶原复合物制剂，用灭菌注射用水复溶，并观察或检测复溶时间、外观、凝血因子IX回收率等指标。

二、实验结果

实验结果见表1。

表1 不同保护剂对凝血酶原复合物的影响

注：复溶时间>15min不符合规定。

如表1所示：采用甘氨酸或甘氨酸与精氨酸的混合物为保护剂时(①号、②号)，复溶后，外观不合格，凝血因子IX的回收率低；

仅采用精氨酸为保护剂时，随着精氨酸加入的增加，凝血因子IX的效价回收率先增加，后降低，再升高。精氨酸加入量为凝血酶原复合物溶液的1.5％以下时(⑦号、⑧号)，凝血因子IX的效价回收率低，不高于90.2％，而精氨酸加入量为2.4％以上时，凝血因子IX的效价回收率高于95.8％，其中，精氨酸加入量为2.4％时，凝血因子IX的效价回收率最高，为98.88％。同时，随着精氨酸加入的增加，复溶时间延长，当精氨酸加入量为凝血酶原复合物溶液的4.5％以上时(⑨号、⑩号)，复溶时间过长，超过了15min，稳定性差，不能用于临床使用。

因此，本发明方法中，凝血酶原复合物溶液中精氨酸加入量为2.4～4％时(③号～⑤号)，优选为2.4～2.5％，最优选为2.4％。

实验结果说明，本发明采用在凝血酶原复合物溶液中，加入2.4～4％(w/v)精氨酸作为干热保护剂的方式，可以在干热灭活过程中，有效维持凝血酶原复合物的活性，制备得到的凝血酶原复合物制剂，效价高，复溶时间短，稳定性好，外观合格。

以下以实验例的方式来说明本发明的有益效果：

实验例1 本发明病毒灭活方法的效果验证

1、检测方法

取样点：按照实施例1的方法制备凝血酶原复合物制剂，分别取冻干前、冻干后以及80℃处理4h，再100℃后15、30、60分钟进行干热灭活，每批共5个取样点。采用96孔盘微量细胞病变法检测样品中的病毒滴度。

指示病毒:PPV病毒病毒滴度:6.44LgTCID50/O.lml

培养细胞:ST细胞滴定方法:96孔盘微量细胞病变法

2、检测结果

在80℃处理4h，再在100℃处理60min后凝血酶原复合物检测结果见表2。

表2 细小病毒残留滴度检测结果

由上表可以看出，采用本发明灭活方法灭活后，细小病毒残留量最高仅0.56LgTCID₅₀/0.lml，灭活细小病毒PPV达到4.56log以上。

实验结果说明，本发明方法可以有效灭活细小病毒。

实验例2 本发明病毒灭活方法与传统灭活方法的对比

一、实验方法

(一)凝血酶原复合物制剂的制备

1、制备方法

1、凝血酶复合物溶液的制备

同实施例1。

2、干热灭活

(1)取步骤Ⅰ制备得到的凝血酶原复合物溶液，加2.4％、1.5％、2.4％、2.5％或者3.0％(w/v)的精氨酸，除菌、分装、冻干；

(2)干热处理：

①：在80℃处理4h，再在100℃处理30min。

②：在80℃处理4h，再在100℃处理60min。

③：在80℃处理72h。

(二)凝血酶原复合物制剂的制备

二、实验结果

实验结果见表3。

表3 不同干热灭活方式对凝血酶原复合物制剂影响

注：-：表示未检测。

如表3所示，采用80℃处理72h的方式难以保证本发明产品的效价回收率。而采用本发明80℃处理4h，再在100℃处理30～60min的干热灭活方式，可以有效保证本发明产品的外观和效价回收率，其中，80℃处理4h，再在100℃处理30min的方式，效价回收率更高，而80℃处理4h，再在100℃处理60min的方式，因灭活时间更长，安全性更高。

另外，本发明灭活方法较传统80℃72小时干热灭活方法，时间缩短90％以上，生产成本显著降低。

实验例3 本发明方法制备的凝血酶原复合物制剂的稳定性

1、检测方法

取实施例1制备的凝血酶原复合物制剂，规格为300IU/瓶，批号20110511、20110512、20110513，内包装材料均为中性硼硅玻璃输液瓶、注射用卤化丁基橡胶瓶塞、铝塑复合瓶盖，检测其稳定性。

稳定性试验包含25±2℃条件12个月加速试验和2～8℃条件36个月长期试验，重点考察项目外观、pH、II因子效价、VII因子效价、IX因子效价、X因子效价、人凝血酶活性、水分含量、活化的凝血因子活性，按中国药典三部2010年版检测，其中0，12，24，36个月按《制检规程》全检。

2、试验结果

2.1 加速试验结果总结见表4：

表4 加速试验结果总结表

2.2 长期试验结果

三批人凝血酶原复合物中试制品在2～8℃条件下保存36个月，各主要指标均无明显变化。总结见表5：

表5 长期稳定性试验结果总结表

通过对前述方法制备得到的人凝血酶原复合物2～8℃长期保存36个月数据的分析表明：样品保存至第36个月，样品全检合格。

实验结果说明，本发明方法制备的人凝血酶原复合物符合《中国药典》的规定，生物活性指标无显著变化，产品质量稳定性好。

综上，采用本发明方法灭活凝血酶原复合物制剂，病毒安全性高，可有效灭活加入的耐热细小病毒，同时，本发明方法制得的凝血酶原复合物制剂稳定性好，2～8℃3年全检合格，第Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ凝血因子无显著损失，且维持良好比例；本发明灭活方法较传统80℃72小时干热灭活方法，时间缩短90％以上，生产成本显著降低，具有良好的工业应用前景。

Claims

1.一种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒的方法，其特征在于：步骤如下：取凝血酶原复合物制剂冻干品，干热处理，其中，干热处理的方法是80℃处理2～10h，再在100℃处理30～120min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述干热处理的方法是80℃处理4h，再在100℃处理30～120min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述干热处理的方法是80℃处理4h，再在100℃处理60min。

4.一种凝血酶原复合物制剂的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取血浆，分离纯化得到含凝血酶原复合物的溶液；

(2)在步骤(1)所得溶液中，加入溶液2～4％(w/v)的精氨酸或其盐类，分装、冻干，按照权利要求1～3任意一项所述方法进行干热处理，即可。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述分离纯化方法为：用凝胶吸附血浆，洗脱，将洗脱液超滤，病毒灭活，二次凝胶吸附，洗脱，即可。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述含凝血酶原复合物的溶液中，人凝血因子IX的活性不低于10IU/ml，人凝血因子II的活性不低于10IU/ml、人凝血因子X的活性不低于10IU/ml，人凝血因子VII的活性不低于5IU/ml。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述精氨酸或其盐类的加入量为溶液的2.4～4％(w/v)。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述精氨酸或其盐类的加入量为溶液的2.4～2.5％(w/v)。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述精氨酸或其盐类的加入量为溶液的2.4％(w/v)。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述精氨酸的盐类为盐酸精氨酸。

11.权利要求4～10任意一项方法制备得到的凝血酶原复合物制剂。