CN104623648B - 一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其通过将生产用种子菌菌体经过离心收集、洗涤、机械破碎、制粒等工艺。应用该工艺制备的微粒抗原大大简化了细菌灭活疫苗生产流程，可使细菌灭活疫苗具备同时激活体液免疫和细胞免疫的能力，同时该工艺扩大了疫苗佐剂可选择范围；该工艺的应用可大幅降低菌体抗原使用浓度和缩短生产时间，从而降低疫苗生产成本；该工艺使疫苗制备免于使用甲醛等化学灭活剂，消除了有害化学物质的食品残留等隐患。

Description

一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺

技术领域

本发明涉及到生物医药技术领域，具体涉及一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺。

背景技术

作为一种对动物群体疫病的有效控制手段，动物疫苗技术优化和新型动物疫苗技术开发得到世界各国相关研究机构的重视。细菌灭活疫苗是先对筛选的细菌进行人工培养，然后用化学灭活剂(甲醛)将其灭活，最后与佐剂进行疫苗配制。目前我国使用的兽用细菌灭活疫苗有猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗、猪链球菌灭活疫苗、仔猪产气荚膜梭菌、禽多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病灭活苗和猪萎缩性鼻炎灭活疫苗等。按照传统方法制备的细菌灭活疫苗通常只引发体液免疫，对细胞免疫系统无激发作用；由细菌灭活疫苗引起的免疫反应抗体滴度下降较快，需多次接种后才能产生保护性免疫；此外，传统的细菌灭活疫苗一直存在甲醛残留的隐患。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其依次包括如下步骤：

a.取种子菌，然后将种子菌进行发酵培养，发酵培养结束后，离心收集培养基中的菌体，所述离心处理的相对离心力为6000-8000xg、离心时间为10-20min；

b.将经过a步骤收集到的菌体重悬于生理盐水中，所述生理盐水的体积为经过a步骤得到的菌体湿重的50～100倍体积(W︰V)，接着进行搅拌使菌体均匀分散在生理盐水中；接着离心收集菌体，所述离心处理的相对离心力为6000-8000xg、离心时间为10-20min；

c.将b步骤收集到的菌体重悬于200～500倍体积(W︰V)的生理盐水中，得到菌液，所述菌液中菌体的浓度为1×10¹⁰CFU/mL，接着充分搅拌至均匀分散；

d.将c步骤获得的菌液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、300～700bar的压力下进行菌体破碎，重复三次，得到菌体裂解液；接着对菌体裂解液进行无菌检验；

e.取经过d步骤中进行无菌检验合格(该处的无菌检验合格是指菌体裂解液中无生物活性的细菌)的菌体裂解液，在低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机进行制粒，制粒工作压力为1000～1200bar、温度为2～8℃，重复三次，得到菌体裂解悬液；

f.将经过e步骤得到的菌体裂解悬液用生理盐水或PBS调整为4×10⁹～8×10⁹CFU/mL。

本发明中，优选的方案为还包括步骤g.按照疫苗制备要求对f步骤得到菌体裂解液(即疫苗抗原)进行无菌检验等；检验合格后，按照佐剂乳化说明对制备的抗原进行乳化，疫苗制备好之后，按照《中国兽药典》附录方法对疫苗进行质量检验。

本发明中，优选的方案为所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒粒径为20-500nm。

本发明中，优选的方案为所述d步骤的无菌检验操作具体为：在超净工作台中，将菌体裂解液划线接种到种子菌适宜生长的培养基中，在种子菌适宜生长的温度下培养12-24h，观察是否有菌落生长，无菌落生长，则无菌检验合格，。

本发明中，优选的方案为所述种子菌为经过筛选、鉴定、可直接用于细菌灭活疫苗制备的菌种。所述种子菌包括但不限于嗜水气单胞菌种子菌”。

本发明中，优选的方案为所述a步骤中的相对离心力为8000xg，离心时间为15min。

本发明中，优选的方案为所述b步骤中的搅拌工艺具体为：在转速为300r/min的速度下搅拌15min。

本发明中，优选的方案为所述b步骤中的相对离心力为8000xg，离心时间为15min。

本发明中，优选的方案为所述d步骤中：对菌体进行破碎的压力为500bar。

本发明中，优选的方案为所述d步骤的无菌检验操作具体为：在超净工作台中，将菌体裂解液划线接种到LB固体平板培养基中，在37℃的温度下培养18h，观察是否有菌落生长，无菌落生长，则无菌检验合格。

本发明中，优选的方案为所述e步骤中的制粒工作压力为1200bar。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明的工艺，将种子菌菌体经过离心收集、洗涤、机械破碎、制粒等工艺，将细菌抗原制成纳米颗粒，获得了获得一种均质、稳定的微粒抗原；应用该工艺制备的微粒抗原扩大了疫苗佐剂可选择范围(传统的细菌灭活疫苗只能使用铝胶佐剂和矿物油佐剂)，可选择制备油包水型(W/O)、水包油包水型(W/O/W)和水包油型(O/W)疫苗，；该工艺的应用可大幅降低菌体抗原使用浓度和缩短生产时间，将菌体抗原量降低1000倍后仍可达到良好的免疫效果，菌体抗原使用效率的提高可显著减低疫苗生产成本；经机械破碎和微粒化处理的抗原一方面有利于吞噬细胞的吞噬及抗原呈递细胞的活化和抗原呈递，菌体内物质的释放(如CpG)可有效激活细胞免疫。该工艺使疫苗制备免于使用甲醛等化学灭活剂，消除了有害化学物质的食品残留等隐患。

下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细说明。

附图说明

下面结合附图进一步阐明本发明的实施例。

图1为实施例2中的嗜水气单胞菌攻毒后草鱼累积死亡率数据图。

具体实施方式

实施例1

改善嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其依次包括如下步骤：

a.取嗜水气单胞菌种子菌，然后将种子菌进行发酵培养(培养基的体积为10L)，发酵培养结束后，离心收集培养基中的菌体，所述离心处理的相对离心力为8000xg、离心时间为15min；

b.将经过a步骤收集到的菌体重悬于生理盐水中，所述生理盐水的体积为经过a步骤得到的菌体湿重的100倍体积(W︰V)，接着进行搅拌使菌体均匀分散在生理盐水中；接着离心收集菌体，所述离心处理的相对离心力为8000xg、离心时间为15min；

c.将b步骤收集到的菌体重悬于200倍体积(W︰V)的生理盐水中，得到菌液，所述菌液中菌体的浓度为1×10¹⁰CFU/mL，接着充分搅拌至均匀分散；

d.将c步骤获得的菌液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在温度为5℃、500bar的压力下进行菌体破碎，重复三次，得到菌体裂解液(即该步骤收集到的穿出液)；接着对菌体裂解液进行无菌检验；无菌检验操作具体为：在超净工作台中，将菌体裂解液划线接种到LB固体平板培养基中，在37℃的温度下培养18h，观察是否有菌落生长，无菌落生长，则无菌检验合格；

e.取经过d步骤中进行无菌检验合格的菌体裂解液，在低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机进行制粒，制粒工作压力为1200bar、温度为5℃，重复三次，得到菌体裂解悬液(即该步骤收集到的穿出液)；

f.将经过e步骤得到的菌体裂解悬液用生理盐水或PBS调整为6×10⁹CFU/mL。

实施例2

在步骤a中，取少量含有嗜水气单胞菌种子菌的培养基液体接种LB平板培养基中，应用平板菌落计数法计数，测得全菌计数；将实施例1中得到的菌体裂解悬液用生理盐水分别调整至相当于全菌计数2×10⁸CFU/mL、2×10⁷CFU/mL、2×10⁶CFU/mL的浓度；接着将这三种浓度的菌体裂解悬液与等体积的铝胶佐剂进行搅拌混合，搅拌的转速为3000r/min，搅拌时间为8min，得到三份疫苗，然后将三份疫苗标记并分装，在4℃的温度下保存，然后按照《中国兽药典》附录方法进行质检，质检合格后进行动物实验。

1.疫苗安全评价

取体重100g健康草鱼200尾，水族箱中养殖观察1周后随机分为5组，每组40尾。第1-3组分别肌肉注射3种不同浓度的疫苗，疫苗浓度分别为：第1组，2×10⁸CFU/mL；第2组，1×10⁷CFU/mL；第3组，1×10⁶CFU/mL；第4组肌肉注射灭菌生理盐水；第1-4组的注射量均为0.2mL/尾鱼；第5组不做任何注射，作为空白对照。接种后逐日观察草鱼的进食情况、活跃程度，注射部位是否溃烂等变化，连续观察14天，详细结果见表1：

表1单剂量接种仔猪临床表现结果

实验结果显示，在疫苗注射后的观察期内，水族箱养殖和肌肉注射造成各组均有少量死亡(5.0-7.5％)，不同浓度疫苗注射组(第1-3组)与对照组(第4、5组)死亡率没有显著差异(P＞0.05)，对死亡鱼进行剖检，均系注射部位溃烂导致细菌感染，未见嗜水气单胞菌相关的出血症状。观察期内，所有存活草鱼进食情况和行为均未见异常，观察期结束，所有鱼未见注射部位溃烂。说明制备疫苗安全性良好。

2.效果评价

取体重100g健康草鱼240尾，水族箱中养殖观察1周后随机分为6组，每组40尾。第1-3组分别肌肉注射3种不同浓度的疫苗，疫苗浓度分别为：第1组，2×10⁸CFU/mL；第2组，1×10⁷CFU/mL；第3组，1×10⁶CFU/mL；第4组肌肉注射甲醛灭活的嗜水气单胞菌疫苗(细菌浓度为1×10⁸CFU/mL)，第5组肌肉注射灭菌生理盐水；第1-5组的注射量均为0.2mL/尾鱼；第6组不做任何免疫或攻毒，作为空白对照。疫苗接种21天，分别用2×10⁵CFU/mL的草鱼嗜水气单胞菌对1-5组草鱼进行攻毒，0.2mL/尾鱼，腹腔注射。

攻毒后连续14天观察记录草鱼死亡数。根据累积死亡率和攻毒后天数做图，具体详见附图1，应用Mann-Whitney U检验分析各疫苗处理组相对于其对照组累积死亡率的差异显著性。

实验结果显示，应用嗜水气单胞菌对草鱼攻毒后，各疫苗免疫组(第1-4组)累积死亡率均低于未免疫组(第5组)二者差异显著(P<0.01)，注射灭菌生理盐水的第5组14日内累积死亡率达到72.5％。

从该结果可以看出，应用本法制备的嗜水气单胞菌灭活苗的免疫效力普遍好于应用甲醛进行灭活的疫苗，较低剂量(第3组，菌体浓度为1×10⁶CFU/mL)疫苗的免疫效力可达到高剂量甲醛灭活苗(第4组，菌体浓度为1×10⁸CFU/mL)同样的免疫效果(P＞0.05)。经机械破碎、制粒后的细菌疫苗的抗原性和免疫原性显著提高。

实施例3

将实施例1中得到的菌体裂解悬液用生理盐水分别调整至相当于全菌计数2×10⁶CFU/mL的浓度；分别用商品化的矿物油佐剂和表明活性剂佐剂制备3种不同剂型的细菌灭活苗(即油包水型(W/O)、水包油包水型(W/O/W)和水包油型(O/W)疫苗)，按照《中国兽药典》附录方法进行质检。

对于菌体抗原，传统疫苗乳化工艺只能选择铝胶佐剂或矿物油佐剂制备油包水剂型(W/O)的疫苗，试验结果显示，用经过本工艺制备的菌体抗原(实施例1中得到的菌体裂解悬液)，可选择多种类型佐剂进行不同剂型的疫苗配制，配制的疫苗均质、稳定，符合疫苗的各项物理性状检测标准(表2)。动物实验的结果表明，不同剂型的疫苗安全性良好。

表2.不同佐剂配制疫苗的稳定性

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于依次包括如下步骤：

a．取种子菌，然后将种子菌进行发酵培养，发酵培养结束后，离心收集培养基中的菌体，所述离心处理的相对离心力为6000-8000xg、离心时间为10-20min；所述种子菌为嗜水气单胞菌；

b．将经过a步骤收集到的菌体重悬于生理盐水中，所述生理盐水的体积为经过a步骤得到的菌体湿重的50～100倍体积，接着进行搅拌使菌体均匀分散在生理盐水中；接着离心收集菌体，所述离心处理的相对离心力为6000-8000xg、离心时间为10-20min；

c．将b步骤收集到的菌体重悬于200～500倍体积的生理盐水中，得到菌液，所述菌液中菌体的浓度为1×10¹⁰CFU/mL，接着充分搅拌至均匀分散；

d．将c步骤获得的菌液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、300～700bar的压力下进行菌体破碎，重复三次，得到菌体裂解液；接着对菌体裂解液进行无菌检验；无菌检验操作具体为：在超净工作台中，将菌体裂解液划线接种到种子菌适宜生长的培养基中，在种子菌适宜生长的温度下培养12-24h，观察是否有菌落生长，无菌落生长，则无菌检验合格；

e．取经过d步骤中进行无菌检验合格的菌体裂解液，在低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机进行制粒，制粒工艺制得的微粒粒径为20-500nm；制粒工作压力为1000～1200bar、温度为2～8℃，重复三次，得到菌体裂解悬液；

f．将经过e步骤得到的菌体裂解悬液用生理盐水或PBS调整为4×10⁹～8×10⁹CFU/mL。

2.根据权利要求1所述的可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于：所述a步骤中的相对离心力为8000xg，离心时间为15min。

3.根据权利要求1所述的可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于所述b步骤中的搅拌工艺具体为：在转速为300r/min的速度下搅拌15min。

4.根据权利要求1所述的可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于：所述b步骤中的相对离心力为8000xg，离心时间为15min。

5.根据权利要求1所述的可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于所述d步骤中：对菌体进行破碎的压力为500bar。

6.根据权利要求1所述的可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于所述d步骤的无菌检验操作具体为：在超净工作台中，将菌体裂解液划线接种到LB固体平板培养基中，在37℃的温度下培养18h，观察是否有菌落生长，无菌落生长，则无菌检验合格。

7.根据权利要求1所述的可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其特征在于：所述e步骤中的制粒工作压力为1200bar。