CN104611404A - 鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的鉴定方法。利用该方法成功鉴定了甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种为真杂种。一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，其特征在于包括有以下步骤：(1)采样：(2)分别称取0.2-0.3g花蕾、花、角果后，分别用pH7.8的磷酸缓冲液，含2mmolASA、5mmolEDTA-Na2在冰浴下匀浆，12000r/min下离心10min，取上清液于-20℃冰箱中保存备用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶和浓缩胶浓度分别为7％和4％，pH值分别为8.8和6.8；电极缓冲液用Tris-甘氨酸系统，pH值8.3，上样量为30μL；电泳开始时，稳压100v，样品过浓缩胶后调制成200v,电泳时间约5h；电泳完成后放入染色液联苯胺溶液中染色，直至可见清晰的蓝色条带，流水冲洗后，照相保存；迁移率Rf值为原点到条带的迁移距离/原点到指示剂的距离。

Description

鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法

技术领域

本发明涉及甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的鉴定方法。利用该方法成功鉴定了甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种为真杂种。

背景技术

远缘杂交是指不同种、属或亲缘关系更远的物种间进行的杂交，包括种间杂交、属间杂交和亚种间杂交。远缘杂交是育种的一种重要手段，是创造植物新类型和作物新品种的重要途经。通过远缘杂交，可打破种、属间的界限，使的不同物种间的遗传物质交流或结合成为可能，有目的地进行植物性状改良，形成生命力更强的新物种和新品种。根据新形成的物种是否完全含有双亲的染色体组，可将远缘杂交创造的新物种分为二类：由双亲的两套来源和性质不同的染色体组结合形成的完全双二倍体新物种和由2个亲本的一部分染色体组结合形成的不完全双二倍体新物种。

杂种优势的利用是大幅度提高作物产量和改良作物品种的有效措施之一。中国从20世纪60年代起开始了油菜杂交种的研究，是世界上最早禹城杂交油菜并大面积推广的国家，目前，中国油菜杂交种种植面积已超过总面积的60％，油菜杂种优势利用研究处于国际领先水平。冬油菜是北方的主要作物之一，利用品种的杂种优势来提高冬油菜的越冬率是行之有效的方法之一。虽然传统的田间形态学鉴定仍是目前最为普遍使用的品种真实性和种子纯度鉴定方法,但利用过氧化物同工酶鉴定品种真实性和种子纯度较为少见。利用过氧化物同工酶成功的鉴定了甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种，为进一步研究不同种、属冬油菜间的杂交种的鉴定提供了技术依据。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法。本发明为了弥补以往利用传统的田间形态学鉴定品种真实性和种子的纯度的不足，提供一种利用过氧化物同工酶鉴定作物杂交种真伪的方法。为进一步研究不同种、属冬油菜间的杂交种的鉴定提供了技术依据。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，其主要特点在于包括有以下步骤：

(1)采样：每年4月-6月份在田间摘取油菜的花蕾、花、角果，在3-5分钟内放入冰

盒，带回实验室，保存于4℃冰箱待用；

(2)分别称取0.2-0.3g花蕾、花、角果后，分别用pH7.8的磷酸缓冲液，含2mmolASA、5mmolEDTA-Na2在冰浴下匀浆，12000r/min下离心10min，取上清液于-20℃冰箱中保存备用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶和浓缩胶浓度分别为7％和4％，pH值分别为8.8和6.8；电极缓冲液用Tris-甘氨酸系统，pH值8.3，上样量为30μL；电泳开始时，稳压100v，样品过浓缩胶后调制成200v,电泳时间约5h；电泳完成后放入染色液联苯胺溶液中染色，直至可见清晰的蓝色条带，流水冲洗后，照相保存；迁移率Rf值为原点到条带的迁移距离/原点到指示剂的距离；迁移率Rf值的范围在0.143-0.471之间。

所述的鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，还包括有以下步骤：

(3)采用材料的成熟花药，取花药在载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴碘-碘化钾溶液盖上盖玻片，在显微镜下观察，凡是被染成蓝色的为有活力的花粉；计算观察2-3个片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性；

(4)在全生育期对亲本及F1杂种调查记录叶片的颜色、叶片刺毛的多少、叶片蜡粉的有无、叶缘缺刻、叶脉颜色、心叶色、叶柄刺毛的多少、叶片的厚度、幼苗匍匐状况、花器和角果的大小一系列农艺性状，并予以拍照记录。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花、角果的POD同工酶酶谱分析表明(图1)，山西冬芥、vision和山西冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；山西冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.143的酶带。

2、传统的田间形态学鉴定品种真实性和种子纯度的方法准确度难以保证，而利用过氧化物同工酶鉴定品种真实性和种子纯度能准确的从条带上看出杂种后代与亲本的差异。

3、利用SRAP和SSR标记构建了甘蓝型油菜品种指纹图谱鉴定品种真实性和种子纯度虽然准确度高但是工作量大，而且费时。利用过氧化物同工酶鉴定品种真实性和种子纯度耗时较少而且结果较为明显。

附图说明：

图1(a)为图POD同工酶酶谱图；

图中：A.山西冬芥；B.vision；F.山西冬芥×vision；

图1(b)为图POD同工酶酶谱模式图；

图中：A.山西冬芥；B.vision；F.山西冬芥×vision

图2芥菜型与甘蓝型油菜亲本及种间杂种幼苗形态；

图3芥菜型与甘蓝型油菜亲本及杂种叶片刺；

图4芥菜型与甘蓝型油菜亲本及杂种花器形态；

图5芥菜型与甘蓝型油菜亲本及杂种花瓣形态；

图6芥菜型与甘蓝型油菜亲本及杂种角果大小；

图7芥菜型与甘蓝型油菜亲本及杂种植株形态；

图中：A.山西冬芥；B.vision；C.山西冬芥×vision；

图8花粉活力变化情况；

图9各品种花粉的染色变化情况。

图中：A.山西冬芥；B.vision；C.山西冬芥×vision。

图10(a)为图POD同工酶酶谱图；

图中：A.山西冬芥；B.vision；C.山西冬芥×vision；

图10(b)为图POD同工酶酶谱模式图；

图中：A.山西冬芥；B.vision；C.山西冬芥×vision

图11(a)为图POD同工酶酶谱图；

图中：A.山西冬芥；G.vision；H.山西冬芥×vision；

图11(b)为图POD同工酶酶谱模式图；

图中：A.山西冬芥；G.vision；H.山西冬芥×vision

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。

本发明采用的材料为甘蓝型冬油菜:vision、芥菜型冬油菜:山西冬芥、芥-甘杂交种:山西冬芥×vision。

实施例1：一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，包括有以下步骤：

(1)采样：每年4月-6月份在田间摘取油菜的花蕾、花、角果，在3-5分钟内放入冰盒，带回实验室，保存于4℃冰箱待用；

(2)分别称取0.2-0.3g花蕾、花、角果后，分别用pH7.8的磷酸缓冲液，含2mmolASA、5mmolEDTA-Na2在冰浴下匀浆，12000r/min下离心10min，取上清液于-20℃冰箱中保存备用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶和浓缩胶浓度分别为7％和4％，pH值分别为8.8和6.8；电极缓冲液用Tris-甘氨酸系统，pH值8.3，上样量为30μL；电泳开始时，稳压100v，样品过浓缩胶后调制成200v,电泳时间约5h；电泳完成后放入染色液联苯胺溶液中染色，直至可见清晰的蓝色条带，流水冲洗后，照相保存；迁移率Rf值为原点到条带的迁移距离/原点到指示剂的距离。

通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花、角果的POD同工酶酶谱分析表明(图1)，山西冬芥、vision和山西冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；山西冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.143的酶带。

实施例2：一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，包括有以下步骤：

(1)采样：每年4月-6月份在田间摘取油菜的花蕾、花、角果，在3-5分钟内放入冰盒，带回实验室，保存于4℃冰箱待用；

(2)分别称取0.2-0.3g花蕾、花、角果后，分别用pH7.8的磷酸缓冲液，含2mmolASA、5mmolEDTA-Na2在冰浴下匀浆，12000r/min下离心10min，取上清液于-20℃冰箱中保存备用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶和浓缩胶浓度分别为7％和4％，pH值分别为8.8和6.8；电极缓冲液用Tris-甘氨酸系统，pH值8.3，上样量为30μL；电泳开始时，稳压100v，样品过浓缩胶后调制成200v,电泳时间约5h；电泳完成后放入染色液联苯胺溶液中染色，直至可见清晰的蓝色条带，流水冲洗后，照相保存；迁移率Rf值为原点到条带的迁移距离/原点到指示剂的距离；

(3)采用材料的成熟花药，取花药在载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴碘-碘化钾溶液盖上盖玻片，在显微镜下观察，凡是被染成蓝色的为有活力的花粉；计算观察2-3个片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性；

(4)在全生育期对亲本及F1杂种调查记录叶片的颜色、叶片刺毛的多少、叶片蜡粉的有无、叶缘缺刻、叶脉颜色、心叶色、叶柄刺毛的多少、叶片的厚度、幼苗匍匐状况、花器和角果的大小一系列农艺性状，并予以拍照记录。

通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花、角果的POD同工酶酶谱分析表明(图10)，山西冬芥、vision和山西冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；山西冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.140的酶带。

图10(a)和(b)说明通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花和角果的POD同工酶酶谱分析表明，冬芥、vision和冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.140的酶带。

实施例3：一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，包括有以下步骤：

步骤(1)、(2)、(3)、(4)与上述相同。

通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花、角果的POD同工酶酶谱分析表明(图1)，山西冬芥、vision和山西冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；山西冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.145的酶带。

图11(a)和(b)说明通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花和角果的POD同工酶酶谱分析表明，冬芥、vision和冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.145的酶带。

实验验证例1：本发明是提供一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，在利用过氧化物同工酶鉴定杂种的基础上，对芥菜型冬油菜山西冬芥、甘蓝型冬油菜以及二者杂交后代山西冬芥×vision的形态特征、越冬率、叶片生理生化特性、花粉活力、花序、花和角果的生理生化特性和POD同工酶进行了分析。可靠有效的鉴定杂种后代的真伪。下面结合附图对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

1.植物性形态特征记载；

2.在全生育期对亲本及F1杂种叶片的颜色、叶片刺毛的多少、叶片蜡粉的有无、生长点的深浅叶缘缺刻、叶脉颜色、心叶色、叶柄刺毛的多少、叶片的厚度、幼苗生长习性、花器和角果的大小等一系列农艺性状，并予以拍照记录。

由于芥菜型冬油菜和甘蓝型冬油菜在形态上存在差异，所以根据它们不同的形态表现可以来初步鉴定它们的种间杂种。由表1可以看出：芥菜型冬油菜(山西冬芥)形态学表现为：叶片为绿色、刺毛多、无蜡粉(见图3)、叶缘缺刻多、心叶色为紫色、叶柄刺毛多、叶片薄、幼苗匍匐生长(见图2)、花和花瓣小、角果小(见图6)、株型小、分枝少、结交密(见图7)。甘蓝型冬油菜(vision)形态学表现为：叶片深绿带紫、无刺毛、蜡粉多(见图3)、叶缘缺刻少、心叶色为紫红色、叶柄无刺毛、叶片厚、幼苗半直立(见图2)、花和花瓣大(见图5和图6)、角果大(见图6)、株型大、分枝多、结交疏(见图7).芥菜型冬油菜与甘蓝型冬油菜杂交后代(山西冬芥×vision)表现为：叶片为绿色、有少量刺毛和蜡粉(见图3)、叶缘缺刻和叶片厚度介于中间型、心叶色为紫色、叶柄有少量刺毛、幼苗匍匐生长、花和花瓣大小介于两个亲本之间(见图5和图6)，角果很小(见图6)、株型大小、分枝、结交都介于两个亲本之间(见图7)。

表1 形态特征变化

3.芥-甘杂种农艺性状表现

从表2可以看出，芥菜型冬油菜和甘蓝型冬油菜种间杂种与亲本相比，有效分枝有明显的杂种优势，株高为111.88cm介于两个亲本之间，而别的性状都比亲本低，尤其是单株有效结角数、角果长度、平均每角果粒数和单株产量明显比两个亲本中最小的还要小。

表2 主要农艺性状变化

芥-甘远缘杂交花粉活力

碘-碘化钾染色测定法

(1)原理多数植物正常的成熟花粉里呈球形，积累较多的淀粉，碘-碘化钾溶液可将起染成蓝色，发育不良的花粉粒常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉含量很少，碘-碘化钾溶液染色呈黄褐色，因此，可通过碘-碘化钾溶液染色来鉴定花粉活力。

(2)器材与用具荧光显微镜载玻片盖玻片镊子棕色试剂瓶烧杯量筒天平

(3)试剂碘-碘化钾溶液：取2g碘化钾溶于5-10ml蒸馏水中，加入1g碘待完全溶解后，再加300ml蒸馏水，储于棕色试剂瓶中备用。

(4)方法采用材料的成熟花药，取花药在载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴碘-碘化钾溶液盖上盖玻片，在显微镜下观察，凡是被染成蓝色的为有活力的花粉。

(5)计算观察2-3个片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。

图1(a)和(b)说明通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花和角果的POD同工酶酶谱分析表明，冬芥、vision和冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.143的酶带。

图2、图3、图4、图5、图6、图7说明由于芥菜型冬油菜和甘蓝型冬油菜在形态上从在差异，所以根据它们不同的形态表现可以来初步鉴定它们的种间杂种。由表1可以看出：芥菜型冬油菜(山西冬芥)形态学表现为：叶片为绿色、刺毛多、无蜡粉、叶缘缺刻多、心叶色为紫色、叶柄刺毛多、叶片薄、幼苗匍匐生长、花和花瓣小、角果小、株型小、分枝少、结交密。甘蓝型冬油菜(vision)形态学表现为：叶片深绿带紫、无刺毛、蜡粉多、叶缘缺刻少、心叶色为紫红色、叶柄无刺毛、叶片厚、幼苗半直立、花和花瓣大、角果大、株型大、分枝多、结交疏.芥菜型冬油菜与甘蓝型冬油菜杂交后代(山西冬芥×vision)表现为：叶片为绿色、有少量刺毛和蜡粉、叶缘缺刻和叶片厚度介于中间型、心叶色为紫色、叶柄有少量刺毛、幼苗匍匐生长、花和花瓣大小介于两个亲本之间，角果很小、株型大小、分枝、结交都介于两个亲本之间。

图中：A.山西冬芥；B.vision；C.山西冬芥×vision；

图8说明两个亲本和杂交后代的花粉活力的大小为山西冬芥＞vision＞山西冬芥×vision并且都有显著差异(P＜0.05)。有图可以看出两个亲本的花粉染色较深，母本山西冬芥的花粉有93％的呈球形，父本vision的花粉有78％呈球形，而杂交种山西冬芥×vision的花粉呈畸形的较多，呈球形的仅占65％。很显然杂交种的花粉活力明显的下降。

图9说明两个亲本的花粉染色较深，母本山西冬芥的花粉有93％的呈球形，父本vision的花粉有78％呈球形，而杂交种山西冬芥×vision的花粉呈畸形的较多，呈球形的仅占65％。很显然杂交种的花粉活力明显的下降。

图中：A.山西冬芥；B.vision；C.山西冬芥×vision。

有图可以看出，两个亲本和杂交后代的花粉活力的大小为山西冬芥＞vision＞山西冬芥×vision并且都有显著差异(P＜0.05)。有图可以看出两个亲本的花粉染色较深，母本山西冬芥的花粉有93％的呈球形，父本vision的花粉有78％呈球形，而杂交种山西冬芥×vision的花粉呈畸形的较多，呈球形的仅占65％。很显然杂交种的花粉活力明显的下降。

通过对芥-甘杂交后代及它们的亲本的花蕾、花、角果的POD同工酶酶谱分析表明(图1)，山西冬芥、vision和山西冬芥×vision在花蕾、开放的花和角果中POD同工酶带型虽一致，但对应的酶带染色深浅明显不同，酶带染色深者活性相对较强，其表现为：角果＞花＞花蕾，其中角果中酶活性最强，这与生理生化指标所测得的结果一致；山西冬芥×vision的POD同工酶谱带完全不同于亲本，兼有父母本谱带，并多了一条Rf值为0.143的酶带。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，其特征在于包括有以下步骤：

(1)采样：每年4月-6月份在田间摘取油菜的花蕾、花、角果，在3-5分钟内放入冰盒，带回实验室，保存于4℃冰箱待用；

(2)分别称取0.2-0.3g花蕾、花、角果后，分别用pH7.8的磷酸缓冲液，含2mmolASA、5mmolEDTA-Na2在冰浴下匀浆，12000r/min下离心10min，取上清液于-20℃冰箱中保存备用；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶和浓缩胶浓度分别为7％和4％，pH值分别为8.8和6.8；电极缓冲液用Tris-甘氨酸系统，pH值8.3，上样量为30μL；电泳开始时，稳压100v，样品过浓缩胶后调制成200v,电泳时间约5h；电泳完成后放入染色液联苯胺溶液中染色，直至可见清晰的蓝色条带，流水冲洗后，照相保存；迁移率Rf值为原点到条带的迁移距离/原点到指示剂的距离；迁移率Rf值的范围在0.140-0.471之间。

2.如权利要求1所述的鉴定甘蓝型冬油菜和芥菜型冬油菜杂交种的方法，其特征在于还包括有以下步骤：

(3)采用材料的成熟花药，取花药在载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴碘-碘化钾溶液盖上盖玻片，在显微镜下观察，凡是被染成蓝色的为有活力的花粉；计算观察2-3个片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性；

(4)在全生育期对亲本及F1杂种调查记录叶片的颜色、叶片刺毛的多少、叶片蜡粉的有无、叶缘缺刻、叶脉颜色、心叶色、叶柄刺毛的多少、叶片的厚度、幼苗匍匐状况、花器和角果的大小农艺性状，并予以拍照记录。