CN109118488B - 一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法,该方法通过测定红掌新种质与3个不同耐寒性品种整株在受到冷害时的叶片冷害指数、叶柄冷害指数2个形态指标，以及叶片相对电导率变化率、叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率2个生理指标，并结合主成份和聚类分析方法来进行红掌新种质的鉴定，此方法所采用指标反映了红掌整株的冷害形态变化，以及膜系统和光合系统受到的伤害，避免了单一化合物指标的不稳定性，其调查全面，结论科学，鉴定结果有利于指导红掌耐寒性新品种的选育。

Description

一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，属于植物科学技术领域。

背景技术

红掌(Anthurium andraeanum)是天南星科花烛属宿根花卉，其观赏器官为佛焰苞，色彩绚丽，四季常开，盆切两用，为国际市场上产值第二的热带花卉(Elibox andUmaharan,2014)。红掌产业价值极高，但极易受到冷害，在冬季生产时加温成本较高。因而选育耐寒性高的新品种对红掌来说具有较大的产业价值。

在红掌的耐寒性研究中，田丹青等(低温胁迫对3个红掌品种叶片形态和生理特性的影响，园艺学报，38(6)：1173–1179，2011)通过考察低温胁迫对红掌叶片形态、叶片相对电导率、丙二醛、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的影响鉴定了3个红掌品种的耐寒性；王宏辉等(10个红掌品种的抗寒性与耐热性评价，植物资源与环境学报，24(2)：40–47，2015)通过测定离体叶片相对电导率计算低温半致死温度的方法评价了10个红掌品种的抗寒性；杨克彬等(七个切花红掌品种对低温胁迫的生理响应及耐低温能力评价，植物生理学报，53(9)：1609–1618，2017)研究了低温胁迫对离体佛焰苞与叶片形态以及叶片质膜相对透性、渗透调节物质含量、抗氧化酶活性等指标的影响，并通过低温半致死温度和隶属函数法分析了7个切片红掌品种耐低温的能力。以上研究或是测定指标繁多，或是以某一叶位离体叶片为试材，虽然有助于解析红掌耐寒性机理，但在操作上增加了耐寒性鉴定成本。而且红掌首先发生冷害症状的部位在不同品种中并不一样，单一化合物指标在红掌遭受不可逆伤害时也具有不稳定性，这些均可能导致鉴定结果有所偏差。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法,本发明不仅对红掌新种质从上至下第一片成熟叶进行相对电导率变化率和叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率2个生理指标的测定，还测定了红掌整株的叶片冷害指数和叶柄冷害指数2个形态指标，避免了只考察某一叶位叶片生理指标的片面性。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法,包括如下步骤:

步骤1、制备材料：准备苗龄一致且均未进入开花期的待测红掌新种质以及三个不同耐寒性红掌品种，所述三个不同耐寒性红掌的品种分别为‘阿拉巴马’、‘轰动’、‘粉冠军’，将上述四种红掌栽入花盆中，每种红掌12个植株，采用进口泥炭作为基质,每隔7天施用稀释1000倍“花多多1号”(The Scotts Company)水溶液1次，待恢复生长1个月后,转至步骤2；

步骤2、低温胁迫：选取步骤1中恢复生长1个月后的四种红掌,每种红掌随机选取6株放入人工气候培养箱中，所述人工气候培养箱设置的气候培养参数为：光照强度为15000Lx，每天光照/黑暗时间为12h/12h，胁迫处理温度为6℃，处理时长为3天，待3天低温胁迫处理后，将四种红掌转入25℃光照培养箱进行恢复生长7天；转至步骤3和步骤4；

步骤3、形态指标测定：

所述形态指标测定包括叶片冷害指数(LCI)调查和叶柄冷害指数(PCI)调查；

所述叶片冷害指数(LCI)调查的方法为：针对步骤2中得到的每株植株的每个叶片进行观测，将其冷害症状分为5个等级，按照如下公式计算得到每株叶片的冷害指数：

每株叶片冷害指数＝∑(级数×叶片数)/(最高级数×总叶片数)；

选取同一品种的6个植株的叶片冷害指数的平均值为该品种的叶片冷害指数；

所述叶柄冷害指数(PCI)调查的方法为：针对步骤2中得到的每株植株的每个叶柄进行观测，将其冷害症状分为5个等级，按照如下公式计算得到每株叶柄的冷害指数：

每株叶柄冷害指数＝∑(级数×叶柄数)/(最高级数×总叶柄数)；

选取同一品种的6个植株的叶柄冷害指数的平均值为该品种的叶柄冷害指数；

步骤4、生理指标测定：

所述生理指标测定包括相对电导率变化率(α_REC)测定和叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率(α_Fv/Fm)测定，所选测定部位为红掌植株从上至下第一片成熟叶；

所述相对电导率(REC)测定的方法采用电导法，选取每个品种的6个植株从上至下的第一片成熟叶，测定共计6个叶片的混合样品，并且3次重复测定，计算平均值，之后通过以下公式计算REC变化率(α_REC)

α_REC＝(处理后测定值－处理前测定值)/处理前测定值

上述公式中的处理后测定值为低温胁迫后的6个叶片混合样品3次重复测定的相对电导率(REC)的平均值，处理前测定值为低温胁迫前的6个叶片混合样品3次重复测定的相对电导率(REC)的平均值；

所述叶绿素荧光参数Fv/Fm测定的方法为采用Handy PEA植物效率仪(Hansatech公司),测定四种红掌样品的6个植株从上至下的第一片成熟叶，并计算6个叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm平均值，之后通过以下公式计算Fv/Fm变化率(α_Fv/Fm)

α_Fv/Fm＝(处理后测定值－处理前测定值)/处理前测定值

上述公式中的处理后测定值为低温胁迫后的6个叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm的平均值，处理前测定值为低温胁迫前的6个叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm的平均值；

步骤5、品种耐寒性综合得分计算：

将LCI、PCI、α_REC乘以“-1”，而α_Fv/Fm数值不变，之后将数据输入SPSS软件，并通过分析→降维→因子分析模块对数据进行主成份分析，其输出结果包括各主成分特征值(λ_j)、贡献率(C_j)、累积贡献率以及各指标因子载荷矩阵(a_ij)。根据累积贡献率≥85％确定主成份m个，根据因子载荷矩阵(a_ij)与特征值(λ_j)计算各主成份中各指标负荷量(T_ij)，再依据负荷量(T_ij)与贡献率(C_j)计算各指标综合得分系数(A_i)，以确定各品种主成份综合得分(Y)，具体公式如下：

式中，a_ij为第i个指标在第j个主成份上的初始因子载荷，λ_j为第j个主成份的特征值，T_ij表示第i个指标在第j个主成分上的负荷量，C_j表示第j个主成份的贡献率，ZX_i为第i个指标正向化兼标准化后的数值，m为主成份个数，n为指标个数。

步骤6、聚类分析进行新种质耐寒性鉴定：

以耐寒性综合得分Y为变量，并将此变量输入SPSS软件，并通过分析→分类→层次聚类模块进行层次聚类分析，其中聚类方法选择最长距离法，结果输出形式选择树状图。如果树状图中新种质与‘阿拉巴马’聚为一类，则鉴定为高耐寒种质；如果新种质与‘轰动’聚为一类则鉴定为中耐寒种质；如果新种质与‘粉冠军’聚为一类则鉴定为低耐寒种质。

进一步地，步骤4中待测红掌新种质的叶片选取低温胁迫前和低温胁迫后且恢复生长7天后的叶片,叶片选取的位置来自待测红掌新种质植株从上至下的第一片成熟叶片,判断是否为成熟叶片以叶片完全展开且呈现深绿色为标准。

进一步地，步骤3中所述的叶片冷害症状5个等级分别为0级为无任何症状；1级为部分黄化；2级为部分褐化；3级为部分枯萎；4级为全部枯萎。

进一步地，步骤3中所述的叶柄冷害症状5个等级分别0级为无任何症状；1级为部分褐化；2级为全部褐化；3级为部分枯萎；4级为全部枯萎。

有益效果：1、本发明低温胁迫的为红掌活体植株，其表现更接近实际生产中红掌的冷害情况，鉴定结果更具有可信性。

2、本发明针对的是幼苗期红掌，有助于红掌新种质耐寒性早期鉴定，避免后期过多的成本投入。

3、本发明采用人工气候箱进行低温胁迫，其鉴定方式不受季节限制，可以全年对红掌新种质进行鉴定。

4、本发明除了对红掌从上至下第一片成熟叶进行相对电导率变化率和叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率2个生理指标的测定，还测定了红掌整株的叶片冷害指数和叶柄冷害指数2个形态指标，避免了只考察某一叶位叶片生理指标的片面性。

5、本发明选用指标均为综合指标，分别反映了红掌整株冷害表观症状和膜系统、光合系统受到的伤害，避免了使用单一化合物指标导致的结果偏差。

6、本发明引入了生产中已确定的3个不同耐寒性的品种作为参照物进行红掌新种质耐寒性鉴定，避免了耐寒性评价中过多品种的引入，降低了耐寒性鉴定的成本。

7、本发明使用了主成分分析和聚类分析相结合的综合评价方法，其鉴定结果更为科学、全面。

附图说明

图1为红掌新种质C1与三种不同耐寒性红掌品种聚类分析树状图。

图2为红掌新种质C2与三种不同耐寒性红掌品种聚类分析树状图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

本实施例的红掌新种质‘C1’和品种‘阿拉巴马’、‘轰动’、‘粉冠军’，来自于上海鲜花港企业发展有限公司，具体耐寒性鉴定步骤如下：

(1)制备材料：3个不同耐寒性红掌品种‘阿拉巴马’、‘轰动’、‘粉冠军’和待测红掌新种质‘C1’，苗龄12个月。移栽所用容器为16cm×12cm花盆，所用基质为进口泥炭，每隔7d施用稀释1000倍“花多多1号”水溶液1次，1月后进行低温胁迫实验。

(2)低温胁迫：利用人工气候培养箱进行低温胁迫，光照强度为15000Lx，每天光照/黑暗时间为12h/12h，胁迫处理温度为6℃，处理时长为3天，待3天低温胁迫处理后，将四种红掌转入25℃光照培养箱进行恢复生长7天。

(3)形态与生理指标测定：

恢复生长7天后，对供试材料叶片、叶柄冷害症状进行调查，并统计叶片冷害指数(LCI)和叶柄冷害指数(PCI)。低温处理前及低温处理且恢复生长7天后，选取红掌植株从上至下第一片成熟叶进行相对电导率(REC)和叶绿素荧光参数Fv/Fm测定，并计算α_REC和α_Fv/Fm。结果如表1所示。本实施例中电导率的测定采用电导法(李合生,植物生理生化实验原理和技术,高等教育出版社,中国,北京,pp.164-261，2000)。

(4)品种耐寒性综合得分计算：将LCI、PCI、α_REC乘以“-1”，而α_Fv/Fm数值不变，之后通过SPSS软件进行主成份分析，结果见表2、表3，由表2可知主成分提取1个贡献率已达到96.5％，基本反映了原始数据的大部分信息。表3中根据公式(1)、(2)计算得到各指标负荷量与耐寒性综合得分系数。表4中所示ZX1、ZX2、ZX3、ZX4分别为叶片冷害指数、叶柄冷害指数、相对电导率变化率、叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率正向化兼标准化处理后的数值。根据公式

最终得到了4个红掌种质的耐寒性综合得分(表4)。

表1低温胁迫后的红掌器官冷害指数与生理指标变化率

表2主成分特征值(λ_j)与贡献率(C_j)

表3耐寒性各指标综合得分系数

表4红掌耐寒性综合得分

(5)聚类分析进行新种质耐寒性鉴定：以耐寒性综合得分为变量，用最长距离法进行层次聚类分析。结果见图1，当欧氏距离为2时，‘粉冠军’单独为一类，‘轰动’单独为一类，而新种质‘C1’与‘阿拉巴马’聚为一类，因而新种质‘C1’被鉴定为高耐寒种质。

实施例2

本实施例的红掌新种质‘C2’和品种‘阿拉巴马’、‘轰动’、‘粉冠军’，来自于上海鲜花港企业发展有限公司，具体耐寒性鉴定步骤如下：

(1)材料准备：3个不同耐寒性红掌品种‘阿拉巴马’、‘轰动’、‘粉冠军’和待测红掌新种质‘C2’，苗龄12个月。移栽所用容器为16cm×12cm花盆，所用基质为进口泥炭，每隔7d施用稀释1000倍“花多多1号”水溶液1次，1月后进行低温胁迫实验。

(2)低温胁迫：利用人工气候培养箱进行低温胁迫，光照强度为15000Lx，每天光照/黑暗时间为12h/12h，胁迫处理温度为6℃，处理时长为3天，待3天低温胁迫处理后，将四种红掌转入25℃光照培养箱进行恢复生长7天；

(3)形态与生理指标测定：

恢复生长7天后，对供试材料叶片、叶柄冷害症状进行调查，并统计叶片冷害指数(LCI)和叶柄冷害指数(PCI)。低温处理前及低温处理且恢复生长7天后，选取红掌植株从上至下第一片成熟叶进行相对电导率(REC)和叶绿素荧光参数Fv/Fm测定，并计算α_REC和α_Fv/Fm。结果如表5所示。本实施例中电导率的测定采用电导法(李合生,植物生理生化实验原理和技术,高等教育出版社,中国,北京,pp.164-261，2000)。

(4)品种耐寒性综合得分计算：将LCI、PCI、αREC乘以“-1”，而αFv/Fm数值不变，之后通过SPSS软件进行主成份分析，结果见表6、表7，由表6可知主成分提取1个贡献率已达到95.535％，基本反映了原始数据的大部分信息。表7中根据公式(1)、(2)计算得到各指标负荷量与耐寒性综合得分系数。表8中所示ZX1、ZX2、ZX3、ZX4分别为叶片冷害指数、叶柄冷害指数、相对电导率变化率、叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率正向化兼标准化处理后的数值。根据公式(3)最终得到了4个红掌种质的耐寒性综合得分(表8)。

表5低温胁迫后的红掌器官冷害指数与生理指标变化率

表6主成分特征值(λj)与贡献率(Cj)

表7耐寒性各指标综合得分系数

表8红掌耐寒性综合得分

(5)聚类分析进行新种质耐寒性鉴定：以耐寒性综合得分为变量，用最长距离法进行层次聚类分析。结果见图2，当欧氏距离为2时，‘粉冠军’单独为一类，‘轰动’单独为一类，而新种质‘C2’与‘阿拉巴马’聚为一类，因而新种质‘C2’被鉴定为高耐寒种质。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤:

步骤1、制备材料：准备苗龄一致且均未进入开花期的待测红掌新种质以及三个不同耐寒性红掌品种各12株，所述三个不同耐寒性红掌的品种分别为‘阿拉巴马’、‘轰动’、‘粉冠军’，对四个品种共计48株红掌进行预处理,待恢复生长1个月后，转至步骤2；

步骤2、低温胁迫：选取步骤1中恢复生长1个月后的四种红掌，每种红掌随机选取6株放入人工气候培养箱中，待3天低温胁迫处理后，将四种红掌转入25℃光照培养箱进行恢复生长7天；转至步骤3和步骤4；

步骤3、形态指标测定：

所述形态指标测定包括叶片冷害指数LCI调查和叶柄冷害指数PCI调查；

选取同一品种的6个植株的叶片冷害指数的平均值为该品种的叶片冷害指数；

选取同一品种的6个植株的叶柄冷害指数的平均值为该品种的叶柄冷害指数；

步骤4、生理指标测定：

所述生理指标测定包括相对电导率变化率α_REC测定和叶绿素荧光参数Fv/Fm变化率α_Fv/Fm测定，所选测定叶片为红掌植株从上至下第一片成熟叶；

相对电导率REC测定的方法采用电导法，选取每个品种的6个植株从上至下的第一片成熟叶,测定共计6个叶片的混合样品，并且3次重复测定，计算平均值，之后通过以下公式计算REC变化率α_REC

α_REC＝(处理后测定值－处理前测定值)/处理前测定值

上述公式中的处理后测定值为低温胁迫后的6个叶片混合样品3次重复测定的相对电导率REC的平均值，处理前测定值为低温胁迫前的6个叶片混合样品3次重复测定的相对电导率REC的平均值；

所述叶绿素荧光参数Fv/Fm测定的方法为采用Handy PEA植物效率仪,测定四种红掌样品的6个植株从上至下的第一片成熟叶，并计算6个叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm平均值，之后通过以下公式计算Fv/Fm变化率α_Fv/Fm：

α_Fv/Fm＝(处理后测定值－处理前测定值)/处理前测定值

上述公式中的处理后测定值为低温胁迫后的6个叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm的平均值，处理前测定值为低温胁迫前的6个叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm的平均值；

步骤5、品种耐寒性综合得分计算：

将LCI、PCI、α_REC乘以“-1”，而α_Fv/Fm数值不变，之后将数据输入SPSS软件，并通过分析→降维→因子分析模块对数据进行主成份分析，其输出结果包括各主成分特征值λ_j、贡献率C_j、累积贡献率以及各指标因子载荷矩阵a_ij；

根据累积贡献率≥85％确定主成份m个，根据因子载荷矩阵a_ij与特征值λ_j计算各主成份中各指标负荷量T_ij，再依据负荷量T_ij与贡献率C_j计算各指标综合得分系数A_i，以确定各品种主成份综合得分Y，具体公式如下：

式中，a_ij为第i个指标在第j个主成份上的初始因子载荷，λ_j为第j个主成份的特征值，T_ij表示第i个指标在第j个主成分上的负荷量，C_j表示第j个主成份的贡献率，ZX_i为第i个指标正向化兼标准化后的数值，m为主成份个数，n为指标个数；

步骤6、聚类分析进行新种质耐寒性鉴定：

以耐寒性综合得分Y为变量，并将此变量输入SPSS软件，并通过分析→分类→层次聚类模块进行层次聚类分析，其中聚类方法选择最长距离法，结果输出形式选择树状图；

如果树状图中新种质与‘阿拉巴马’聚为一类，则鉴定为高耐寒种质；如果新种质与‘轰动’聚为一类则鉴定为中耐寒种质；如果新种质与‘粉冠军’聚为一类则鉴定为低耐寒种质。

2.根据权利要求1所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：所述步骤4中待测红掌新种质的叶片选取低温胁迫前和低温胁迫后且恢复生长7天后的叶片,叶片选取的位置来自待测红掌新种质植株从上至下的第一片成熟叶片。

3.根据权利要求1所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中所述的预处理为将上述四种红掌栽入花盆中，每种红掌12个植株，采用进口泥炭作为基质，每隔7天施用稀释1000倍“花多多1号”水溶液1次。

4.根据权利要求1所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：所述人工气候培养箱设置的气候培养参数为：光照强度为15000Lx，每天光照/黑暗时间为12h/12h，胁迫处理温度为6℃，处理时长为3天。

5.根据权利要求1所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：所述步骤3中叶片冷害指数LCI调查的方法为：针对步骤2中得到的每株植株的每个叶片进行观测，将其冷害症状分为5个等级，按照如下公式计算得到每株叶片的冷害指数：

每株叶片冷害指数＝∑(级数×叶片数)/(最高级数×总叶片数)。

6.根据权利要求1所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：所述步骤3中叶柄冷害指数PCI调查的方法为：针对步骤2中得到的每株植株的每个叶柄进行观测，将其冷害症状分为5个等级，按照如下公式计算得到每株叶柄的冷害指数：

每株叶柄冷害指数＝∑(级数×叶柄数)/(最高级数×总叶柄数)。

7.根据权利要求5所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：叶片冷害症状5个等级分别为0级为无任何症状；1级为部分黄化；2级为部分褐化；3级为部分枯萎；4级为全部枯萎。

8.根据权利要求6所述的一种红掌新种质耐寒性的鉴定方法，其特征在于：叶柄冷害症状5个等级分别0级为无任何症状；1级为部分褐化；2级为全部褐化；3级为部分枯萎；4级为全部枯萎。

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