CN104611360A - 法尼烯合酶 - Google Patents

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Abstract

一种新的分离自番茄的法尼烯合酶。该法尼烯合酶形成的终末产物显示了令人惊奇的性质，其基因在核苷酸水平上与已知的其它来源的法尼烯合酶的基因序列相同性低。本发明涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽，基因构建物，携带这种多核苷酸、多肽和基因构建物的载体、宿主、特别是植物，以及这种植物产生的种子。

Description

法尼烯合酶
本申请是2009.12.02提交的CN 200980148985.X，题为“法尼烯合酶”的分案申请。
发明内容
一种新的分离自番茄的法尼烯合酶。该法尼烯合酶形成的终末产物显示了令人惊奇的性质，其基因在核苷酸水平上与已知的其它来源的法尼烯合酶基因序列相同性低。本发明涉及分离的多核苷酸，由所述多核苷酸编码的多肽，基因构建物，携带这种多核苷酸、多肽和基因构建物的载体、宿主、特别是植物，以及这种植物产生的种子。
技术领域
本发明涉及法尼烯合酶，具体是α-法尼烯合酶和/或β-法尼烯合酶。也涉及编码这些酶的多核苷酸序列。本发明也涉及掺入有该多核苷酸序列的核酸(或基因)构建物，载体和宿主细胞。还涉及α-法尼烯和/或β-法尼烯的生产及其用途。
背景技术
术语法尼烯指一组六种全部都是倍半萜烯的密切相关的化合物。α-法尼烯与β法尼烯是异构体，彼此有一个双键位置不同。
α-法尼烯是3,7,11-三甲基-1,3,6,10-十二碳四烯，β-法尼烯是7,11-二甲基-3-亚甲基-1,6,10-十二碳三烯。α-法尼烯存在四种立体异构体，差别在于三个内部双键中的两个几何学构型不同(第三个内部双键的立体异构体相同)。β-法尼烯存在中央双键几何学构型不同的两种立体异构体。只是对于α-法尼烯与β-法尼烯各种异构体之间的差异与这些异构体具体功能的关系认识有限。
α-法尼烯组成型存在于许多物种中或可被诱导(Gapper等,收获后生物学和技术(Postharvest Biology and Technology)42:(2006)225-233)。据信α-法尼烯由二磷酸法尼酯(FDP)通过烃类中间物反应过程而合成，并报道受α法尼烯合酶的催化(Rupasinghe,等,J.Am.Soc.Hortic.Sci.123,882-886(1998))。
β-法尼烯广泛存在于各种各样的植物和动物中。已出版了各种关于这种天然产物及其在化学通讯部署中作为重要信使的文献。β-法尼烯存在于许多裸子植物和被子植物，包括母菊(Chamomilla recutita),葡萄(Vitis vinifera),玉米(Zeamays),和胡椒(Piper nigrum)的精油中。(E)-β-法尼烯合酶是埃及棉花叶虫(Spodoptera littoralis)诱生的，该叶虫寄生在玉米壳和叶组织中，但不存在于根组织中(Schnee等,植物生理学(Plant Physiol),2002,130:2049-2060)。β-法尼烯据信是由FDP通过涉及二价金属离子辅助的二磷酸酯离子化，和产生的碳阳离子C-3甲基去质子化反应所合成，参见WO1999/18118中公开的内容。
已描述的α-法尼烯功能是作为昆虫吸引剂，在小鼠和昆虫中起着性别信息素作用。它在原鼻白蚁(Prorhinotermes canalifrons)中起着报警信息素作用(Sobotník等，(2008)化学生态学杂志J.Chem.Ecol.，34(4):478-86)。α-法尼烯及其衍生物的其它用途是强效癌症预防剂，和用于塑料膜合成(US20060137032)。Hernández-ceruelos等(Toxicol.Lett.135:103-110,2005)报道，甘菊精油的主要成分β-法尼烯在诱变处理小鼠骨髓细胞时具有诱变作用)。
据报道β-法尼烯是羽扇豆花粉气味的主要成分，能刺激黄蜂的授粉行为(Dobson等，(1996)Am.J.Bot.83,877-885)。更最重要的是，已报道蚜虫，例如棉蚜虫(Aphis gossypii)可利用β-法尼烯作为报警信息素(Jianwei等,2006,J.Econ.Entomol.99(5):1636-1640；Kislow和Edwards,1972,自然Nature 235:108-109；Pickett和Griffiths,1980,J.Chem.Ecol.6:349-360),绿桃蚜虫(Myzus persicae)(Edwards,L.J.,1973,自然241:126-127)接触β-法尼烯后变得不安，而从其寄生的植物驱散(Wohlers(1981)Z Angew.Entomol.92,329-336)。β-法尼烯在100ng/蚜虫剂量时对蚜虫有急毒性(van Oosten等(1990)Acta Phytopathol.Entomol.Hung.25,331-342)。还感兴趣的是注意到β-法尼烯蒸气对粉虱有毒性(Klijnstra等，(1992)Meded Fac.Landbouwwet.57,485-491)。不幸的是，对庄稼局部施用β-法尼烯控制蚜虫行为的努力极少成功，因为其在空气中易挥发和迅速氧化失活。(Dawson等(1988)Pest.Sci.22,17-30)。
Schnee等(植物生理学(Plant Physiology)，130卷，2049页(2002)描述了一种三萜合酶，能催化形成(E)-β-法尼烯。WO2004/035791公开了海棠家蝇(Malusdomestica)的α－法尼烯合酶。WO99/18118公开了椒样薄荷(Mentha piperita)的(E)-β-法尼烯合酶。
发明内容
在第一个方面，提供了SEQ ID NO:1所示的多核苷酸和其同源物。该核苷酸编码具有法尼烯合酶活性，具体是α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的多肽。
在另一个方面，本发明提供了SEQ ID NO:2所示的多肽和其同源物。该多肽具有法尼烯合酶活性，具体是α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性。
在另一个方面，本发明提供了基因构建物，含有该基因构建物的载体，和含有该基因构建物的宿主细胞，其中所述基因构建物含有本发明的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了含有这种基因构建物的转基因植物或植物细胞，以及这种植物或植物细胞产生的种子。
在另一个方面，提供了制备α-法尼烯和/或β-法尼烯的方法，包括利用本发明的多核苷酸。
在还有一个方面，提供了一种调节植物中α-法尼烯和/或β-法尼烯产生的方法，包括调节本发明多核苷酸编码的多肽的表达水平。
参见下面的详述和实施例，结合附图的描述和实施例中的说明，将会更容易理解本发明的上述方面和其它优点。
定义
在以下描述和实施例中，使用了一些术语。为了提供对本说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，提供了以下定义，包括这些定义给出的范围。除非另外有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。所有出版物、专利申请、专利和其他文献的公开内容都在本文中完整引用以供参考。
“法尼烯合酶”指能将二磷酸法尼酯转变成α-法尼烯和/或-法尼烯的酶。
“法尼烯合酶活性”指本发明的法尼烯合酶催化二磷酸法尼酯形成α-法尼烯、β-法尼烯或两者的酶活性。可用酶活性试验，例如实施例所述的试验测定活性。本发明法尼烯合酶的氨基酸序列变体可具有所需的改变的生物学活性，包括例如，改变的反应动力学，底物利用度，产物分布或其它性质，例如立体化学性质。
“基因构建物”指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其中可插入另一个多核苷酸分子(插入性多核苷酸分子)，例如但不限于cDNA分子。基因构建物可含有允许转录该插入性多核苷酸分子，以及任选的将该转录物翻译成多肽所必需的元件。此插入的性多核苷酸分子可衍生自宿主细胞，或可衍生自不同细胞或生物，和/或可以是重组多核苷酸。一旦位于宿主细胞内，该基因构建物可整合入宿主染色体DNA中。该基因构建物可与载体相连接。
术语“基因”指含有能在细胞内转录成RNA分子(例如mRNA)，与合适的调控区(例如启动子)操作性连接区域(转录区)的DNA序列。因此基因可以包含多个操作性连接的序列，例如启动子、5’前导序列(其包含例如参与翻译起始的序列)、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和3’非翻译序列(包含例如转录终止位点)。
“宿主细胞”指原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。典型的真核宿主细胞有植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
“序列相同性百分数”意味着当两条氨基酸序列或两条核酸序列排列对齐时，占据同一相应位置的氨基酸或核苷酸的百分数。要比较序列长度的核酸通常是至少120个核苷酸，优选200个核苷酸，更优选的300个核苷酸组成的核酸。要比较序列长度的多肽通常是至少40个氨基酸残基，优选65个氨基酸残基，更优选100个氨基酸残基组成的多肽。优选用Clustal W排列比对法测定“序列相同性百分数”。可用CLC Bio,Cambridge,MA,USA的软件程序“CLC Free Workbench 3”进行vClustalW排列比对。该程序可从网站http://www.clcbio.com上免费得到。核苷酸和氨基酸排列比对所用的参数是：缺口开放罚10分，缺口延伸罚1分。缺口末端与所有其它缺口相同对待。
本文所用的“多核苷酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，包括DNA和相应的RNA分子，可以是有义或反义取向，考虑包括cDNA、基因组DNA和重组DNA，以及完全或部分合成的多核苷酸。多核苷酸可由整个基因或其任一部分组成。操作性反义多核苷酸可包含相应多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定义包括所有这种操作性反义片段。
“分离的多核苷酸”是经鉴定已与其先前结合的至少一种污染多核苷酸相分离的核苷酸分子。
本文所用的“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。
“分离的多肽”是已经过鉴定和分离的或回收的基本上不含其天然环境组分的多肽。其包括重组细胞内的原位多肽。然而，一般需通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
术语“遗传标记”或“多态性标记”或“分子标记”指基因组DNA上可用于“标记”染色体特定位置的区域。如果某遗传标记与某基因紧密连锁，或者“在基因内”，它可“标记”含该基因的DNA，从而能用于分子标记试验(见下文)，在标记辅助育种/筛选(MAS)方法中选择或排除该基因的存在。遗传标记的例子有AFLP(扩增的片段长度多态性),微卫星,RFLP(限制性片段长度多态性),STS(序列标记位点),SNP(单个核苷酸多态性),SFP(单个特征多态性；见Borevitz等，2003,基因组研究(Genome Research)13:513-523),SCAR(序列特征性扩增区),CAPS标记(切割的扩增多态性序列)等。标记离基因越远，越可能发生标记与基因之间的重组(交换)，从而丧失连锁(和标记与基因的共同-分离)。测定基因座之间的距离表示为重组频率，以cM给出(厘摩尔根，1cM表示两种标记之间减数分裂重组频率为1％)。基因组的大小在物种之间有很大不同，因此重组事件的分布在整个基因组上不是随机的，实际上1cM代表的物理距离(即两种标记之间的千碱基kb)在物种之间和物种内也有很大不同。应理解当本文中指标记或“连锁标记”时，这也包括该基因本身“内”的标记。
“分子标记试验”(或测试)指(基于DNA)的试验，可(直接或间接)表明在植物或植物一部分中是否的存在本发明的多核苷酸。
发明详述
本发明的一个目的是提供：编码法尼烯合酶的新多核苷酸序列，这些核苷酸编码的酶，体外合成α-法尼烯和/或-β法尼烯，和/或基因修饰植物从而改变其α-法尼烯和/或β-法尼烯活性水平的方法，以及向公众提供可获得酶的有用选择。
已惊奇地发现可通过提供SEQ ID NO:1所示的分离多核苷酸，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选90％，最优选至少95％序列相同性的多核苷酸，而解决上述问题。优选所述多核苷酸编码法尼烯合酶，即能够从合适底物合成α-法尼烯和/或β-法尼烯的酶。因此，在另一个实施方式中，提供本发明的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有法尼烯合酶活性的多肽。
SEQ ID NO:1所示的本发明核苷酸是法尼烯合酶基因的编码序列，其编码如方法中详述的获自番茄植物摇钱树品种(Solanum lycopersicon cultivar MoneyMaker)的法尼烯合酶。如下文进一步详述，本发明的法尼烯合酶与本领域已知的法尼烯合酶相比具有令人惊奇的性质，不仅多核苷酸序列相同性有差异，而且重要的是这种多核苷酸编码的法尼烯合酶的活性有差异。
本领域技术人员所理解，还提供了与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选90％，最优选至少95％序列相同性的多核苷酸。
在本发明的上下文中，采用ClustalW排列比对法测定序列相同性。采用CLCBio公司,Cambridge,MA,USA的软件程序“CLC Free Workbench 3”进行ClustalW排列比对。此程序可从网站http://www.clcbio.com上免费得到。核苷酸和氨基酸排列比对所用的参数是：缺口开放罚10分，缺口延伸罚1分。缺口末端与所有其它缺口相同对待。
采用所述ClustalW排列比对法，计算出SEQ ID NO:1所示多核苷酸与已知的分离自玉米的E-β-法尼烯合酶(Schee等2002)只有36％相同性，与已知的分离自海棠家蝇(Malus domesticus)(WO2004/035791)的α-法尼烯合酶具有46％相同性，与已知的薄荷杂交胡椒(Mentha x piperita)(WO99/18118)的E-β-法尼烯合酶具有48％相同性。
在另一个实施方式中，本发明还提供与SEQ ID NO:1所示多核苷酸相比在SEQID NO:1多核苷酸序列中含有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个插入、缺失或取代的不同的多核苷酸。这些插入、缺失或取代可以是毗邻核苷酸，也可以存在于，例如SEQ ID NO:1多核苷酸的2、3、4、或5个不同位置上。例如，可以缺失第一位核苷酸，第二位的两个核苷酸可以被取代，而在SEQ ID NO:1多核苷酸第三位插入一个或多个核苷酸。
本发明的(分离的)多核苷酸可以是cDNA形式，或其相应的RNA，合成的多核苷酸，也包括同时含有内含子和外显子的多核苷酸。技术人员应理解，本发明的多核苷酸除了编码本发明法尼烯合酶的区域外，还可包含调控序列，优选包括启动子区，例如本发明法尼烯合酶的启动子区。
还提供了本发明多核苷酸的片段，只要本发明多核苷酸的这种片段编码具有法尼烯活性的多肽。可用本领域已知的各种方法测定法尼烯活性，但优选按公开的实施例中所述测定法尼烯活性。
如上所述，已发现本发明的多核苷酸，例如SEQ ID NO:1所示多核苷酸编码具有法尼烯活性的多肽。具体说，已发现本发明的多核苷酸编码能形成α-法尼烯和/或β-法尼烯的多肽。在该实施方式中，采用本发明的多核苷酸来形成α-法尼烯和/或β-法尼烯。
另外，结果显示存在(+)-朱栾倍半萜(valencene)，提示本发明的多肽也可用于形成(+)-朱栾倍半萜。因此，在本文中，当提及制备本发明多肽时，除了α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性外，本发明的多肽也可显示(+)-朱栾倍半萜合酶活性，即形成(+)-朱栾倍半萜。
α-法尼烯可以存在有四种不同形式的立体异构体：(Z,E)-α-法尼烯、(Z,Z)-α-法尼烯、(E,Z)-α-法尼烯和(E,E)-α-法尼烯。β-法尼烯可以存在有两种不同形式的立体异构体：(E)-β-法尼烯和(Z)-β-法尼烯。
在另一个实施方式中，提供了本发明的多核苷酸，其中该多核苷酸编码具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的多肽。
惊奇地发现本发明的多核苷酸能编码本发明的多肽，后者能合成α-法尼烯和/或β-法尼烯二者，如实施例所示。相反，申请人所知的其它法尼烯合酶，例如WO2004/035791and WO99/18118中公开的那些酶，被描述为只能形成α-法尼烯或β-法尼烯。例如，本发明的多核苷酸优选编码本发明的多肽，后者能合成(Z,E)-α-法尼烯、(Z,Z)-α-法尼烯、(E,Z)-α-法尼烯和(E,E)-α-法尼烯。
例如，已发现SEQ ID NO:1所示多核苷酸编码的多肽具有合成α-法尼烯和β-法尼烯二者(具体是(E)-β-法尼烯、(Z,E)-α-法尼烯、(E,E)-α-法尼烯、(E,Z)-α-法尼烯和(Z,Z)-α-法尼烯)的活性。现在，首次发现了本发明的多核苷酸，例如分离自番茄植物(摇钱树品种)的多核苷酸，编码的多肽具有合成α-法尼烯和β-法尼烯不同立体异构体的性能。事实上，先前没有报道过这种番茄植物，如摇钱树品种，可合成α-法尼烯和β-法尼烯二者，因此是令人惊奇的。
现在首次提供了本发明的多核苷酸，可用于形成α-法尼烯、或β-法尼烯或两者。此外，现在首次用这种多核苷酸和编码的多肽进一步阐明了该多核苷酸与其编码多肽之间的关系，及它在体内和体外合成不同法尼烯的活性。例如，可理解，获得具有例如(提高的)β-法尼烯合酶活性，而没有(或降低的)α-法尼烯合酶活性的突变体是可能的。本发明法尼烯合酶的氨基酸序列变体也可具有所需的改变的生物学活性，包括例如，改变的反应动力学，底物利用度，产物分布或其它特征，例如立体化学特征。
此外，利用本发明的多核苷酸和多肽，现在已有可能只用一种多核苷酸或多肽即可在体内和体外合成α-法尼烯和/或β-法尼烯的特定混合物。例如，可将本发明的多核苷酸引入植物或细菌，或在体外系统中用本发明的多肽合成α-法尼烯和/或β-法尼烯。
利用本发明的多核苷酸，能够有效控制不同法尼烯的合成，如下文将要更详述的那样，由于可用其基因转化(例如)易感基因型的植物，从而产生具有不同类型法尼烯合成改变的转基因植物。
在本发明多核苷酸的一个优选实施方式中，提供了编码SEQ ID NO:2所示多肽，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的多肽的分离的多核苷酸。
具体说，已发现在本发明范围内，可有利地利用编码SEQ ID NO:2所示多肽，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的多肽的分离的多核苷酸。
在另一个实施方式中，提供本发明多核苷酸的片段，这种片段编码具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的多肽，优选所述片段编码具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的多肽。
不违背本发明的范围，应理解除了上述多核苷酸外，可对本发明的多核苷酸进行多种修饰，而不使这些修饰实质性损害经修饰的多核苷酸所编码多肽的活性。例如，如上所述，本发明的多核苷酸可含有修饰，如缺失、取代和插入，而不实质性影响所编码多肽的活性。因此，本发明还提供了编码显示α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性(优选两者)的多肽的本发明多核苷酸的片段。这种片段不限于特定大小或特定部分的本发明的多核苷酸，只要具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性(优选两者)即可。技术人员通过采用实施例中提供的方法，或本领域已知的其它合适方法，不难确定本发明多核苷酸的这种片段是否具有所需活性。
在本发明的另一个方面，涉及本发明的多核苷酸编码的多肽。具体说，提供了编码SEQ ID NO:2所示多肽，或如上所述用ClustalW排列比对测定的，与SEQID NO:2氨基酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的多肽的分离的多核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明还提供了与SEQ ID NO:2的多肽相比在SEQ IDNO:2多肽序列中含有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸插入、缺失或取代的不同多肽。这些插入、缺失或取代可以是SEQ ID NO:2多肽中的毗邻氨基酸，也可以存在于SEQ ID NO:2多肽中的不同位置，例如2、3、4、或5个不同位置。例如，SEQ ID NO:2多肽中的第一位氨基酸可以缺失，第二位的一个氨基酸可以被取代，而第三位可插入一个或多个核苷酸。
在一优选实施方式中，本发明的多肽具有法尼烯合酶活性，优选α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性，更优选α-法尼烯合酶活性和β-法尼烯合酶活性。然而，这并不意味着排除缺乏这两种活性的本发明的那些多肽(例如突变体)。
在另一个实施方式中，提供了分离的α-法尼烯和β-法尼烯合酶多肽。本发明的这种多肽对α-法尼烯和β-法尼烯二者的合成均有活性，可按实施例中所述测定。如上所述，现在首次分离得到了这种多肽(从番茄植株(摇钱树品种)),而且可如本文所述有益地利用该多肽。
在另一个实施方式中，提供了本发明多肽的片段，所述片段具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性，优选α-法尼烯合酶活性和β-法尼烯合酶活性。
不违背本发明的范围，应理解除了上述多肽外，可对本发明的多肽进行多种修饰，而不使这些修饰实质性损害该多肽的活性。例如，如上所述，本发明的多肽可含有这类修饰，如氨基酸缺失、取代和插入，而不实质性影响该多肽的活性。因此，本发明还提供了本发明多肽的片段，它们具有α-法尼烯合酶活性和/或(优选和)β-法尼烯合酶活性。这种片段不限于特定大小或特定部分的本发明多肽，只要具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性即可。技术人员通过采用实施例中提供的方法或本领域已知的其它合适方法，不难确定本发明的这种片段是否具有所需活性。
本发明的多肽或其片段除了其法尼烯合酶活性外，还可例如用于产生针对它的抗体，这些抗体可用于检测例如植物中的本发明多肽。
在本发明的另一个方面，可利用本发明的多核苷酸来设计与本发明多核苷酸，优选与SEQ ID NO:1所示多核苷酸，或其一部分的DNA序列的一条链互补的寡核苷酸，可将其用作杂交探针进行标记，来检测筛选基因组DNA或cDNA文库中的同源基因。能在高度严谨杂交条件下与该探针杂交，和编码的基因产物参与了法尼烯合酶活性，优选具有α-法尼烯合酶和/或β-法尼烯合酶活性的同源序列，包括在本发明的范围内。
一般而言，高度严谨条件指以下(DNA)杂交条件：允许至少50个核苷酸，优选约200个或以上的核苷酸与特定的序列在约65℃，含有约1M盐，优选6xSSC或其它含有相当离子强度的溶液中杂交，和用含约0.1M或以下盐，优选0.2xSSC或其它含具有相当离子强度的溶液洗涤的条件(Sambrook,Maniatis,Fritsch,分子克隆，实验手册,CSHL Press,USA,1987))。这些条件能够检测出具有约90％或更高序列相同性的序列。
在本发明的另一个方面，根据本发明的多核苷酸设计了寡核苷酸，可将其用作DNA分析中的杂交探针。这些探针可用作分子标记，以区分含有本发明法尼烯合酶的植物基因型与缺乏这种法尼烯合酶的植物基因型。这种探针可用作选择的附加工具。
例如，它们可用于检测在植物组织或其核酸样品中是否存在编码本发明多肽的本发明的核苷酸序列的方法中，该方法包括：
a.获得植物组织样品或核酸样品，
b.用分子标记试验分析是否存在与本发明多肽相连的一个或多个标记，其中所述标记试验可检测SEQ ID NO:1所示序列，或与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的序列。
在本发明的一个优选方式中，根据本发明的多核苷酸设计寡核苷酸，将其用作扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)的引物，形成了扩增产物可表明在特定植物基因型中存在法尼烯合酶，优选存在本发明的法尼烯合酶。
在一优选实施方式中，所述引物用于选择性限制性片段扩增，以鉴定与本发明法尼烯合酶紧密相连的AFLP标记。的确，一种特别有用的技术是AFLP技术，如Vos,P.等在核酸研究(Nucleic Acids Research),1995,卷23,No.21:
现在，实际上已能从本发明的多核苷酸产生分子标记。提供的核苷酸序列的确能用作分子育种方法和种质筛选和/或特性分析的遗传标记。这种标记能用于帮助筛选含或不含本发明多核苷酸或多肽的植物的标记。
因此，提供了利用SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸，或与其具有至少90％核苷酸相同性的序列，优选作为分离的SEQ ID NO:1多核苷酸，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的多核苷酸的分子标记，或作为权利要求7-10任一项所述多核苷酸，优选具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的多核苷酸的分子标记。
还提供了SEQ ID NO:1所示多核苷酸,或与SEQ ID NO:1核苷酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的多核苷酸的用途，这种用途是用于基因作图显示，与本发明核苷酸序列相连的分子(DNA)标记。
如技术人员所知，遗传(或分子)标记是位于染色体上已知位点与特定基因或性状相关联的基因或DNA序列。可将其描述为由于基因座中可观察到的突变或改变而产生的变体。遗传标记可以是短DNA序列，例如单个碱基对改变(单个核苷酸多态性，SNP)周围的序列，或长序列，比如微卫星。
在本发明中，这种标记可以是SEQ ID NO:1所示多核苷酸，或与SEQ ID NO:1核苷酸序列至少有50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％序列相同性的多核苷酸(的片段)。
给遗传标记作图定位到某基因中或基因附近，对一般的分子生物学技术人员而言不难做到，在Lefebvre,V.&A.M.Chevre.《标记植物疾病和抗虫害基因的工具：综述》.Agronomie 15,1995(1):3-19；Michelmore,R.W.《操纵疾病抗性基因的分子方法》.植物病理学年鉴Annual Review of Phytopathology 33(1995):393-427；Michelmore,R.W.,R.V.Kesseli&E.J.Ryder.《莴苣的基因图谱》.刊于:R.L.Phillips&I.K.Vasil(主编)植物中基于DNA的标记(DNA-based markers in plants),Kluwer Acad.Publishers,Dordrecht,1994,pp.223-239；Winter,P.&G.Kahl.《植物改良的分子标记技术》.微生物学和生物技术世界杂志(World Journal of Microbiology&Biotechnology),1995,11(4):438-448。
本发明还涉及装有本发明寡核苷酸的诊断试剂盒，用于检测所研究的基因型中是否存在本发明的法尼烯合酶基因。这种诊断试剂盒可避免采用繁琐的试验来筛选形成或不形成例如α-法尼烯和/或β-法尼烯的基因型。
本发明还涉及含有本发明的多核苷酸序列，优选编码本发明的法尼烯合酶，例如具有α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的法尼烯合酶的多核苷酸序列的基因构建物。这种基因构建物优选包含在植物细胞中具有功能的调控序列，所述调控序列有：例如启动子，与多核苷酸，例如本发明的SEQ ID NO:1多核苷酸编码序列同源或异源的启动子。
在另一个实施方式中，所述基因构建物含有编码本发明多肽的5’-3’取向的开放读框多核苷酸。在另一个实施方式中，所述基因构建物含有能与编码本发明多肽的多核苷酸优选在严谨条件下杂交的5’-3’取向的多核苷酸。
本发明还涉及含有本发明DNA构建物的DNA载体。合适的载体可以是克隆载体，转化载体，表达载体等，是本领域技术人员熟知的。
另外，携带含有上述基因构建物，例如含有SEQ ID NO:1多核苷酸或其一部分，或其同源物的载体的细胞属于本发明的范围内。而且，携带本发明基因构建物的细胞属于本发明的范围内。
在本发明的一个优选方式中，用标准转化技术将本发明的多核苷酸引入所述植物的基因组中而获得转基因植物。优选所述转基因植物表达有功能的本发明法尼烯合酶，例如具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的法尼烯合酶。
在本发明的另一个实施方式中，可用众所周知的转化技术将本发明的多核苷酸转移到异源系统，例如但不限于瓜，烟草，拟南芥，马铃薯，甜菜，油菜籽，黄瓜，辣椒，茄子，棉花，玉米，南瓜，西瓜和莴苣中。还包括细菌和酵母菌等系统。本发明的多核苷酸引入这类系统中能够生产例如本发明的多肽，以及在体内或体外利用这些多肽产生法尼烯，优选α-法尼烯和β-法尼烯。
在本发明的另一个实施方式中，提供了衍生自本发明转基因植物或植物细胞的种子，和例如含有本发明多核苷酸(例如SEQ ID NO:1)的转基因植物或植物细胞的种子。
在本发明的另一个方面，提供了一种制备α-法尼烯和/或β-法尼烯的方法，包括以下步骤：培养已用本发明多核苷酸基因修饰的细胞，以提供增强的α-法尼烯合酶和/或β-法尼烯合酶活性；和任选的向细胞提供二磷酸法尼酯；以及分离产生的α-法尼烯和/或β-法尼烯。该方法还包括培养衍生自番茄，特别是实施例中所用番茄的细胞。
在另一个实施方式中，提供了一种调节植物产生α-法尼烯和/或β-法尼烯的方法，该方法包括提高或降低具有本发明多肽序列的法尼烯合酶的表达，其中所述提高或降低是通过基因修饰改变编码所述多肽的多核苷酸的表达而实现的。
本文所述的多核苷酸和多肽及其片段，以及优选的编码具有法尼烯合酶活性，优选α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的那些多核苷酸及其片段，有多种用途，在本文中列举了一些，但不限制本发明的范围。例如，本发明的多核苷酸可用于产生(过)表达本发明法尼烯合酶的植物，赋予对蚜虫行为控制的改善，和驱散食草昆虫，例如粉虱。
本发明将在实施例中就本发明多核苷酸的分离作进一步描述。下实施例只是说明本发明目前所考虑的最佳实施方式，并不意味着限制本发明。
实施例
植物材料与毛状体，RNA与mRNA的分离
土壤中培养番茄植株(番茄摇钱树品种)4周，日夜温度为23℃-18℃，明/暗方案为16/8小时。切取同一植株含有分生组织的茎，置于土壤中再培养3周。旋涡震荡液氮冻存的梗茎区段后，将梗茎毛状体收集在50ml管底。
用Qiagen RNeasy植物小试剂盒(Düsseldorf,Germany)按照厂商方案分离得到植物细胞和组织的毛状体RNA。用提供的RLT缓冲液进行裂解。用普洛麦格(Madison,Wisconsin,USA)公司的多重抽提(PolyAtract)mRNA分离系统III按照厂商方案，从总RNA池中分离得到信使RNA。从总RNA分离得到mRNA的效率为0.71％。
mRNA扩增和双链cDNA合成
用Ambion(Austin,Texas,USA)公司的MessageAmp II RNA扩增试剂盒扩增毛状体mRNA。输入100ng mRNA用于扩增。按照厂商方案进行扩增。扩增RNA的产率是171μg，大小分布如预期，其范围约400-3.000碱基。
每批20μl反应物中含10μg RNA，用随机六聚体引物(购自MWG Operon,Ebersberg,Germany)自扩增的RNA合成第一链cDNA.将终浓度62.5nM的随机引物与扩增的RNA合并，70℃培育5分钟，然后储藏在冰上。加入混合有所提供缓冲液的Fermentas Life Sciences(St.Leon-Rot,Germany)公司的RevertAid M-MulV逆转录酶(200单位)。加入终浓度1mM的核苷酸，42℃进行cDNA合成90分钟。然后，直接将试管移到冰上，用Fermentas RNase H和大肠杆菌DNA聚合酶I进行第二链的合成。在每个20μl反应管中加入8μl提供的DNA聚合酶I反应缓冲液和1单位的RNaseH及30单位的DNA聚合酶I。用水将反应体积加至100μl。加入预冷的所有组分，15℃进行第二链合成2小时。
大规模平行焦磷酸测序和数据分析
本领域所述和技术人员已知的方法进行双链cDNA剪切，文库制备，454测序和毗连排列比对。处理涉及条码化的454测序衔接子(adapter)，5个突变株每个携带一个不同的条码(见例如WO2007073165,WO2007037678或WO2007073165,其中不同的条码称为标记或标示物)。焦磷酸测序法本身是本领域已知的，在www.biotagebio.com；www.pyrosequencing.com/section technology中也有所描述。例如在WO 03/004690,WO 03/054142,WO 2004/069849,WO 2004/070005,WO 2004/070007,和WO 2005/003375中(所有都是454生命科学公司拥有,在此引入以供参考)也用了该技术。比对序列进行比较的方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法的描述可参见：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.MoI.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-153；Corpet et al.(1988)Nucl.AcidsRes.16:10881-90；Huang等，(1992)生物科学中的计算机应用8:155-65；以及Pearson等，(1994)分子生物学方法(Meth.MoI.Biol.)24:307-31,在此引入以供参考。Altschul等，(1994)自然遗传学(Nature Genet.}6:119-29(在此引入以供参考)提供了序列排列比对方法和同源性计算的详细考量。
番茄倍半萜烯合酶SlSTS3的鉴定和克隆
454-序列读取(lcl-CL117Contig1)产生的一个毗连群长793bp，该毗连群与鳞叠状石南茄(Fabiana imbricate)倍半萜烯合酶(没有已知功能)mRNA(AY860847)有较高程度的相同性。为了获得该番茄cDNA的全长克隆，对用番茄毛状体mRNA构建的cDNA文库进行了PCR扩增。按照厂商方案采用Stratagene(Cedar Creek,Texas,USA)公司的HybriZAP-2.1XR文库构建试剂盒和HybriZAP-2.1XR cDNA合成试剂盒。原代cDNA文库的大小是2.5x106噬斑形成单位(PFU)/μg噬菌体臂。按照厂商方案扩增该原代文库。用厂商所述的大规模切割方案切割扩增的cDNA文库。用切割后的文库和引物1-6(见下文表1中的引物表)作PCR，扩增cDNA片段的3’和5’部分。
表1引物表
对于该cDNA的5’部分，用引物6R5E和pActF(见引物表see primer list)进行PCR，对该cDNA的3’部分用引物6F4E和T7进行PCR。用切割后的cDNA文库作为模板，采用Finnzymes(Espoo,Finland)公司的0.25单位Phusion热起动聚合酶和提供的缓冲液，每个引物的浓度为0.4mM，dNTP浓度为0.2mM，反应体积为25μl。在PCR混合物中加入MgCl2至终浓度0.3mM。采用Biometra(Germany)公司的T1热循环仪，以及以下程序：
用水稀释反应产物20倍后，用作再次扩增的模板。用引物6R4E和pActF再扩增5’部分，用引物6F3E和T7长再扩增3’部分。PCR条件和首次PCR相同。
从凝胶上切下再扩增反应的PCR产物，用QIAGEN公司的凝胶抽提试剂盒按照厂商方案分离。用ABI Prism BigDye Terminator v1.1循环测序仪对PCR产物测序。
通过装配重叠的序列片段，将获自454-序列的毗连群以及新测序的cDNA片段扩大为完整的编码序列。设计了新引物(引物E6flR2和E6flF,见引物表)用于PCR，扩增切割后的cDNA文库所产生的完整编码序列。用Finnzymes公司的Phusion热起动聚合酶如上所述进行全长扩增。
从凝胶上切下这次PCR反应获得的PCR片段，用QIAGEN的凝胶抽提试剂盒根据厂商方案分离。然后用Invitrogen(Carlsbad,California,USA)公司的TA克隆试剂盒按照厂商方案将该纯化的片段克隆入pCR2.1克隆载体中。质粒转移入One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(随试剂盒提供)中。开始液体培养，按照厂商方案用Fermentas公司的GeneJET质粒小量制备试剂盒分离质粒，测定质粒中插入物的序列。图1显示了该序列和所有引物的位置。
用上述的Phusion Taq聚合酶，引物E6TopoF和E6TopoR扩增该质粒的全长编码序列。如上所述分离凝胶中的PCR片段。用Invitrogen公司的冠军pET200定向TOP0表达试剂盒按厂商方案所述，将该全长cDNA克隆入pET TOP0载体中。表达载体的图谱见图2所示。
然后，将该质粒转移入One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(随试剂盒提供)中。分离质粒并测序。序列与pCR2.1克隆载体测序得到的第一(链)全长cDNA相同。SlSST3的编码序列如SEQ.ID.No:1所示。SEQ.ID.No:2显示了推导的氨基酸序列。
在大肠杆菌中表达SlSST3蛋白
含SlSST3的pET200质粒转化入BL21Star(DE3)One Shot化学感受态大肠杆菌细胞中。37℃过夜培养液体培养物。翌日，用2.5ml过夜培养物接种50ml培养液，并培养至600nm光密度为0.5。将培养物转移到室温，用Roche(Basel,Switzerland)公司的最终浓度1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。采用pET200载体中含有假插入物(R2R3型MYB转录引子(Genebank登录号AY705977)，没有萜烯合酶活性)的培养物作为阴性对照。同时采用这两种培养物的非诱导对照。诱导3小时后，取每个培养物的两个1ml等份，4℃2000g离心15分钟，然后吸弃培养液收集残留细胞。用液氮冷冻细胞沉淀，-80℃保存直到进行酶试验。
测定1ml等份的600nm光密度。4℃2000g离心10分钟，吸弃培养液收集细胞。将一管诱导的和一管未诱导的等份细胞重悬于50μl/OD单位的萜烯合酶缓冲液(如Van Schie等，植物分子生物学Plant Mol Biol 2007Jun；64(3):251-63所述)中。在冰上与1μg溶菌酶培育30分钟并超声破碎细胞后，4℃12000g离心30分钟收集可溶性蛋白组分。将其余诱导和未诱导的细胞沉淀重悬于50μl/OD单位PBST(0.8％NaCl(w/v),0.02％KCl(w/v),0.144％Na2HPO4(w/v),0.02％KH2PO4(w/v)和0.02％(v/v)Tween-20)中。在全部和可溶性蛋白组分中加入1/3体积的4X样品缓冲液(8％SDS(w/v),40％甘油(w/v),20％β-巯基乙醇(v/v)，240mM Tris-HCl pH 6.8和0.08％溴酚蓝(w/v))，将样品置于沸水中5分钟。取15μl蛋白质样品在10％丙烯酰胺凝胶上电泳。用考马斯亮蓝(0.25％CBB(w/v),30％甲醇(v/v)和10％乙酸)染色含有SlSST3和MYB转录因子的质粒的诱导和未诱导细胞的丙烯酰胺凝胶上的总蛋白。图3显示了该染色凝胶的扫描图。
在10％丙烯酰胺凝胶上电泳含SLSST3质粒的诱导和未诱导细胞的总蛋白和可溶性蛋白组分。样品电泳后，将诸蛋白转移印迹到硝基纤维素上。用含5％奶粉的PBST溶液封闭印迹1小时。在含5％奶粉和QIAGEN公司的五聚His抗体(目录号34660,批号130167450)的10mlPBST溶液中培育印迹过夜。用PBST洗涤印迹三次，然后在含5％(w/v)奶粉和Pierce公司,Rockford,IL,USA的辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG抗体的PBST中培育一小时，再用PBST洗涤3次。用增强化学发光仪(Amersham,Buckinghamshire,UK)检测过氧化物酶活性。化学发光的照片见图4所示。
SlSST3蛋白的功能分析
检测剩余培养物细胞沉淀中的倍半萜烯合酶活性。按Van Schie等，植物分子生物学Plant Mol Biol.2007Jun；64(3):251-63(在此引入以供参考)所述进行倍半萜烯合成酶试验。
用Ni-纯化的蛋白质按Van Schie等，植物分子生物学Plant Mol Biol.2007Jun；64(3):251-63(在此引入以供参考)所述，或按Ament等(2004)植物生理学PlantPhysiol.135:2025-2037(在此引入以供参考)所述，在装有DB-5柱的GG-MS TOF上分析反应产物。
图5显示了用FPP测定的Ni-纯化的SlSST3和Myb转录因子蛋白的离子69的GC-MS质谱，其中保留时间402秒跃升至436秒。采用可信的标准品，比较离子谱和保留时间，峰1、2、3和4的产物被鉴定为(E)β-法尼烯(峰1),(Z,E)α-法尼烯(峰2),(E,E)α-法尼烯和(Z,Z)α-法尼烯(都在峰3中)和(E)-橙花叔醇(峰4)。
图7显示了用FPP检测提取自表达番茄法尼烯合酶大肠杆菌细胞的蛋白质的进一步GC-MC色谱图。峰1，β-榄香烯(*)。2.(E)β-法尼烯。3.未知的倍半萜烯(*)。4.(Z,E)α-法尼烯。5.(+)-朱栾倍半萜(*)。6.(E,E)α-法尼烯。7.未知的倍半萜烯(*)。(*).(*)标示的峰是根据质谱鉴定的，所有其它峰是根据质谱和纯标准品保留时间的比较鉴定的。
纯的(E)β-法尼烯由Dr.W.Boland教授友情提供。该倍半萜烯的质谱和质谱峰1见图6a所示。(Z,E)α-法尼烯和(E,E)α-法尼烯的混合物获自Sigma公司。(Z,E)α-法尼烯和峰2的质谱见图6b所示，图6c显示了(E,E)α-法尼烯和峰3的质谱。(E)橙花叔醇获自Sigma公司。该倍半萜烯和峰4的质谱见图6d所示。
这些结果显示了克隆自番茄毛状体cDNA的SlSST3编码法尼烯合成酶，(占优势地)具有β-法尼烯合成酶活性，以及额外的α-法尼烯活性。
番茄法尼烯合酶在各种组织和器官中的相对表达水平
图8中，通过定量RT-PCR测定，显示了(本发明的)法尼烯合酶在番茄中的空间表达，并对组成型RCE1在番茄不同组织表达的cDNA进行了校正。条状图代表两个独立判定的平均值。误差条表示最大值。合成了从：1.根，2.花苞，3.雄蕊，4.花瓣，5.萼片，6.未成熟青果，7.破碎果实8.转向果实，9.红果，10.毛状体，11.茎，12.植物顶，13.幼叶，14.成熟叶片，15.衰老叶片分离的RNA的cDNA。

Claims (12)

1.一种制备基因转化的转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括将SEQID NO:1所示多核苷酸引入植物基因组。
2.如权利要求1所述的方法，所述多核苷酸编码具有α-法尼烯合酶活性和β-法尼烯合酶活性的多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含在基因构建物中。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因构建物包含在载体中。
5.一种制备基因转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将SEQID NO:1所示多核苷酸引入植物细胞的基因组。
6.如权利要求5所述的方法，所述多核苷酸编码具有α-法尼烯合酶活性和β-法尼烯合酶活性的多肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含在基因构建物中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基因构建物包含在载体中。
9.一种制备基因转化的转基因植物的方法，其特征在于，将权利要求5-8任一所述的植物细胞再生成转基因植物。
10.如权利要求1-4或9任一所述的方法，其特征在于，所述植物是番茄，瓜，烟草，拟南芥，马铃薯，甜菜，油菜籽，黄瓜，辣椒，茄子，棉花，玉米，南瓜，西瓜或莴苣植物。
11.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述植物细胞是来自番茄，瓜，烟草，拟南芥，马铃薯，甜菜，油菜籽，黄瓜，辣椒，茄子，棉花，玉米，南瓜，西瓜或莴苣植物的细胞。
12.如权利要求1-4或9所述的方法，其特征在于，所述基因转化的植物过表达SEQ ID NO:2的法尼烯合酶。
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