CN104593386A - 甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用，属于生物技术领域。该甲型副伤寒沙门菌ompN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的甲型副伤寒沙门菌ompN基因分布广泛且序列保守，其重组表达产物rOmpN有较强的免疫原性和免疫保护作用，可作为多价甲型副伤寒沙门菌基因工程疫苗候选抗原。

Description

甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用。

背景技术

伤寒和副伤寒是由沙门菌属伤寒杆菌（Salmonella typhi）、甲型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi A）、肖氏沙门菌（Salmonella schottmueller）感染，偶由希氏沙门菌（Salmonella hirschfeldii）感染引起的常见人类急性传染病。每年全球伤寒或副伤寒病例数高达2000万左右，死亡病例超过20万以上。伤寒或副伤寒也是我国常见的法定乙类传染病之一，每年发病率均位于所有乙类传染病前5位，故是我国重点监控并进行计划免疫的传染病之一。

接种疫苗是预防和控制传染病的根本措施，对于控制无症状及恢复期带菌者较多、耐药率较高的伤寒或副伤寒，接种疫苗尤为必要。早年用于预防接种的伤寒、甲型副伤寒和乙型副伤寒三联全菌死疫苗，因其免疫保护率低（约50%）、有效免疫力维持时间较短，尤其是副作用很大，仅中、强不良反应即高达8.6%，我国早已停止使用该疫苗进行预防接种。伤寒杆菌具有化学成分为聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸的荚膜多糖，因其与细菌毒力密切相关且有较强抗原性，故称之为毒力抗原（virulent antigen，Vi-Ag）。上世纪90年代中期，以伤寒杆菌荚膜多糖作为抗原的疫苗在中国、法国、墨西哥研制成功并上市，称之为Vi疫苗。Vi疫苗安全、不良反应小、保护效果好（约75%）且抗体维持时间长，现已代替三联全菌死疫苗用于免疫接种。细菌学上早已明确，伤寒杆菌、肖氏沙门菌和希氏沙门菌有Vi抗原，但甲型副伤寒沙门菌无Vi抗原。因此，Vi疫苗不仅不能防控甲型副伤寒沙门菌感染，其免疫筛选作用有可能导致甲型副伤寒沙门菌流行。研究并明确甲型副伤寒沙门菌表面保护性抗原，研发具有预防甲型副伤寒沙门菌感染的疫苗具有重要的医学意义。

革兰阴性菌具有外膜及外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP），外膜蛋白是革兰阴性菌重要的表面抗原成分，沙门菌也不例外。然而，传统生化方法提取细菌蛋白抗原普遍存在产量及得率低、不同批次差异大等问题，难以用于疫苗生产，采用基因工程技术表达外膜蛋白抗原分子、制备基于重组外膜蛋白抗原的基因工程疫苗可能是研发甲型副伤寒沙门菌疫苗的唯一有效途径。

2004年McClelland 等报道了甲型副伤寒沙门菌全基因序列，其中至少有21个OMP编码基因（GenBank accession No.: CP000026）。我们以往研究证实，甲型副伤寒沙门菌SpaO、OmpA和NmpC有免疫保护作用，但其余OMP免疫原性和免疫保护作用未有研究报道。病毒仅有一种或数种表面蛋白抗原，故采用单一的病毒主要表面蛋白抗原制备的基因工程疫苗即可获得良好的免疫保护效果。细菌是原核细胞型微生物，表面抗原复杂多样，采用单一蛋白抗原往往不易获得令人满意的免疫保效果，这可能是采用单一重组蛋白抗原基因工程疫苗免疫效果不佳的主要原因，采用多种蛋白抗原制备的多价基因工程疫苗有可能获得较为理想的免疫保护效果。因此，除SpaO、OmpA和NmpC外，研究其他甲型副伤寒沙门菌OMP免疫原性和免疫保护效果，以便从中筛选出若干种分布广泛、序列保守、抗原性和免疫保护作用较强的OMP抗原，可为研制多价甲型副伤寒沙门菌基因工程疫苗奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用的技术方案。

 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因, 其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白，其特征在于该表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白在对甲型副伤寒杆菌的免疫保护中的应用。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白在制备治疗甲型副伤寒疫苗中的应用。

所述的含有权利要求1 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达载体。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）ompN基因扩增，得到ompN基因；

2）采用T-A克隆试剂盒将ompN基因克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T ^ompN ；

3）将pMD-19-T ^ompN 与原核表达载体pET42a用Nde I和Xba I双酶切，回收目的DNA条带，将300～500 ng的提纯的DNA条带与100 ng线性化 pET42a混合，在T4 DNA连接酶作用下形成重组表达载体pET42a ^ompN 。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于所述的步骤1）中以甲型副伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物进行PCR扩增。

所述的含有权利要求1 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达工程菌。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达工程菌构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）ompN基因扩增，得到ompN基因；

2）采用T-A克隆试剂盒将ompN基因克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T ^ompN ；

3）将pMD-19-T ^ompN 与原核表达载体pET42a用Nde I和Xba I双酶切，回收目的DNA条带，将300～500 ng的提纯的DNA条带与100 ng线性化 pET42a混合，在T4 DNA连接酶作用下形成重组表达载体pET42a ^ompN ；

4）采用CaCl₂法将pET42a ^ompN 转化入表达宿主菌E. coli BL21DE3形成工程菌株E. coli BL21DE3 ^pET42a-ompN 。

所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达工程菌构建方法，其特征在于所述的步骤1）中以甲型副伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物进行PCR扩增。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.甲型副伤寒沙门菌临床菌株ompN基因PCR扩增及纯化产物测序结果表明，该基因分布于所有临床菌株，其编码的外膜蛋白序列保守，可以作为细菌基因工程疫苗的候选抗原。

2.膜定位显示OmpN定位于甲型副伤寒沙门菌表面。OmpN表达于细菌表面是可以作为细菌基因工程疫苗的候选抗原的必要条件。

3.利用大肠杆菌为表达宿主菌，其结构简单、生长速度快的特点，易于培养和发酵、培养工程工程提取重组表达外膜蛋白rOmpN产量高、有效降低了生产成本，且表达条件习易于标准化适用于规模化生产。

4.动物实验结果提示重组膜蛋白rOmpN具有良好的免疫原性，后期保护试验证实该蛋白质具有良好的免疫保护能力。

附图说明

图1为甲型副伤寒沙门菌ompN基因PCR检测结果；

图中：泳道M：DNA marker；泳道1：空白对照；泳道2～6：分别为甲型副伤寒沙门菌50001参考标准株和4株甲型副伤寒沙门菌临床代表株ompN基因扩增条带。

图2为甲型副伤寒沙门菌rOmpN表达及提取效果；

图中：泳道M：蛋白 marker；泳道1：野生型pET42a空白对照；泳道2和3：分别为表达和提纯的rOmpN。

图3为甲型副伤寒沙门菌OmpN膜结构分析结果。

图4为甲型副伤寒沙门菌OmpN膜定位（×1500）；

图中：A：rOmpN兔抗血清为一抗时OmpN膜定位；B：正常兔血清为一抗的阴性对照。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

1 材料和方法

1.1菌株和血清标本来源

甲型副伤寒沙门菌参考标准株50001购自北京中国药品生物制品检定研究院。126株甲型副伤寒沙门菌临床菌株、56份甲副伤寒病人恢复期血清分别由浙江省宁波市、温岭市和杭州市疾病预防控制中心提供，15份微量肥达试验结果阴性的健康体检者血清由浙江省新华医院提供。

1.2ompN基因扩增及测序

采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen）提取上述甲型副伤寒沙门菌基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度^[13]。根据GenBank中甲型副伤寒沙门菌ATCC9150株ompN基因序列（accession No.：CP000026）及其限制性核酸内切酶位点分析结果，设计PCR引物并由上海Invitrogen公司合成。上游引物（其核苷酸序列如SEQ ID NO ：3）：CGC CAT ATG (Nde I) atg aaa aga aaa gta ttg gca-3’，下游引物（其核苷酸序列如SEQ ID NO ：4）：CGC CTC GAG (Xho I) gaa ctg gta aac cat acc cag-3’。以100 ng甲型副伤寒沙门菌DNA为模板，采用PCR扩增全长ompN基因片段，反应参数：94℃5 min；94℃30 s、52℃30 s、72℃60 s，30个循环；72℃10 min。扩增产物经溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳法检查后，采用T-A克隆试剂盒（TaKaRa）将其克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T ^ompN ，委托上海Invitrogen公司测序。采用BLAST软件比对不同甲型副伤寒沙门菌株ompN基因核苷酸和氨基酸序列相似性。甲型副伤寒沙门菌株ompN基因核苷酸序列如SEQ ID NO ：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO ：2所示。

1.3 ompN基因原核表达系统构建及鉴定

甲型副伤寒沙门菌50001株pMD-19-T ^ompN 与原核表达载体pET42a（Novagen）用Nde I和Xba I（TaKaRa）双酶切，回收目的条带后用紫外分光光度法测定其浓度。300～500 ng的ompN基因片段与100 ng线性化 pET42a混合，在T4 DNA连接酶（TaKaRa）作用下形成重组表达载体pET42a ^ompN 。采用CaCl₂法将pET42a ^ompN 转化入表达宿主菌E. coli BL21DE3（Novagen）形成工程菌株E. coli BL21DE3 ^pET42a-ompN 。该菌株接种于含50 μg/ml卡那霉素（Kan）LB平板（Oxoid）上37°C培养18 h，挑取白色菌落在Kan-LB培养液中37°C振荡培养4～6 h增菌，用细菌质粒提取试剂盒（Axygen）提取 pET42a ^ompN 后再次测序。

1.4rOmpN表达与提纯

E. coli BL21DE3 ^pET42a-ompN 接种于Kan-LB培养液（Oxoid）中，37°C振荡培养 2 h，加入0.5 mmol/L IPTG（Sigma）后30°C振荡培养4～6 h，以诱导rOmpN表达。采用Ni-NTA 亲和层析柱（BioColor）提取表达的rOmpN，BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime Biotech）和SDS-PAGE分别检测其浓度和纯度。

1.5 rOmpN抗血清制备

1 mg rOmpN与弗氏完全佐剂混合后皮内多点免疫家兔4 次，每次间隔一周，末次免疫后两周采集心血并分离血清，采用免疫扩散法测定其效价。

1.6OmpN膜结构分析与定位

根据测序结果用TMHMM Server v. 2.0软件分析ompN基因产物的膜结构。采用1：500稀释的rOmpN兔抗血清为一抗、1：2000稀释的Alexa-Fluor568标记羊抗兔IgG（Invitrogen）为二抗，采用激光共聚焦显微镜法检测甲型副伤寒沙门菌50001株OmpN的膜定位，实验中以正常兔血清为对照。

1.7 微量肥达试验

常规离心收集新鲜培养的甲型副伤寒沙门菌50001株及其126株临床菌株并悬于0.01 mol/L PBS（pH7.4）中，用比浊法配制成1.5×10⁸的细菌悬液。将0.25 ml细菌悬液与0.25 ml 1：5、1：25或1：50稀释的rOmpN兔抗血清混匀，37oC孵育过夜，若50%细菌被凝集判为阳性。实验中采用正常兔血清作为对照。

1.8ELISA  

96孔酶标板中每孔加入0.01 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.3）配制的10 μg/ml rOmpN溶液0.1 ml，4℃包被过夜。次日吸弃各孔液体，用0.5% Tween 20-PBS洗板3次，加入10%小牛血清-PBS 37℃封闭1 h，按上法再次洗板。分别以1：100或1：500稀释的甲型副伤寒恢复期病人血清为一抗、1:3000稀释的HRP标记羊抗人IgG（Invitrogen）为二抗、OPD为底物，显色后用酶标仪（Bio-Rad）检测各孔OD₄₅₀值。实验中以相同稀释度的15份微量肥达试验结果阴性健康体检者血清OD₄₅₀均值+3SD为cut-off值，病人血清标本OD₄₅₀值大于cut-off值者判为阳性。

1.9小鼠免疫保护试验

将体重（19±1 g）清洁级BALB/c小鼠分为5 组，每组10只，分别腹腔注射不同浓度甲型副伤寒杆菌50001株悬液0.5 ml，观察7 d，以获得100%最低致死量（MLD）。将BALB/c小鼠分为3组，每组15只，颈背部皮下分别注射100 或200 μg rOmpN与1 mg氢氧化铝佐剂（Sigma）混合物（试验组）或200 μg牛血清白蛋白（BSA，Sigma）与1 mg氢氧化铝混合物（对照组），间隔一周后按上法再次免疫。末次免疫后两周，每只小鼠腹腔注射2倍100%MLD甲型副伤寒杆菌50001株进行攻击，观察并记录7 d内动物死亡情况。

2结果

2.1ompN基因携带率及其序列分析结果

甲型副伤寒沙门菌50001株及其126株临床菌株DNA中均能扩增出全长ompN基因片段（图1），各菌株ompN基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.6%～99.9%和98.7%～100%。

2.2 rOmpN表达及提纯效果

在0.5 mmol/L IPTG诱导下，E. coli BL21DE3 ^pET42a-ompN 能有效表达rOmpN，Ni-NTA 亲和层析法提取的rOmpN在分离胶中显示为单一的蛋白条带（图2）。

2.3OmpN膜定位

膜结构分析结果显示，OmpN为跨膜蛋白，除N端约25个氨基酸残基序列分别位于甲型副伤寒沙门菌膜内或跨膜外，其余均位于膜外（图3）。激光共聚焦显微镜检测结果显示，OmpN定位于甲型副伤寒沙门菌表面（图4）。

2.4 rOmpN免疫原性及OmpN表达率

rOmpN免疫家兔后能产生高效价血清抗体，该抗血清与rOmpN免疫扩散效价高达1：16。ELISA检测结果显示，1：100或1：500稀释的甲副伤寒病人血清标本rOmpN-IgG阳性率分别为98.2%（55/56）和92.8%（55/56）（表2）。微量肥达试验结果显示，99.2%（125/126）、80.1%（101/126）和68.3%（86/126）甲型副伤寒沙门菌临床菌株分别能与1：10、1：50和1：100稀释的rOmpN兔抗血清发生凝集反应（表1）。

表1  甲型副伤寒病人血清rOmpN-IgG ELISA检测结果

表2  rOmpN兔抗血清微量肥达试验结果

2.5小鼠免疫保护试验结果

    BSA免疫小鼠腹腔感染2倍100% MLD甲型副伤寒杆菌50001株（1×10⁷）后7 d内均死亡。60.0%（9/15）100 μg rOmpN免疫小鼠、73.3%（11/15）200 μg rOmpN免疫小鼠经2倍100% MLD甲型副伤寒杆菌50001株攻击后仍存活（p<0.05）（表3）。

表3  rOmpN对甲型副伤寒杆菌感染小鼠的免疫保护作用

3讨论

新发传染病（emerging disease）和再发传染病（re-emerging disease）是威胁人类健康和生命安全的重大疾病。伤寒和副伤寒又称肠热症，前者为伤寒沙门菌（Salmonella typhi）感染所致，后者分为甲、乙、丙副伤寒，分别为甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌（S.schottmuelleri）和希氏沙门菌（S.hirschfeldii）感染所致。以往我国及东南亚地区主要流行伤寒，欧美地区伤寒和副伤寒病例极为少见。如前所述，甲型副伤寒沙门菌不产生多糖荚膜，故伤寒沙门菌荚膜多糖为抗原的Vi疫苗免疫筛选作用以及甲型副伤寒沙门菌耐药性日益增强，被认为是目前甲副伤寒全球性流行的主要原因。因此，甲副伤寒被认为是一种新发或再发传染病。

伤寒尤其是副伤寒存在无症状带菌者，部分伤寒或副伤寒病人呈慢性感染，但均可通过粪便排菌感染他人，故伤寒或副伤寒是典型的人与人之间传播性传染病，故接种疫苗被认为是预防和控制伤寒或副伤寒流行最为有效的措施。早年伤寒、甲与乙副伤寒三联全菌死疫苗因其脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）毒副作用严重而被不含LPS的Vi疫苗所替代。沙门菌是革兰阴性菌，其外膜蛋白可作为基因工程疫苗抗原。因此，研发以甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白为抗原的多价基因工程疫苗是预防和控制目前甲副伤寒流行的有效途径。

作为细菌基因工程疫苗的蛋白抗原，必须表达于细菌表面、序列保守、分布广泛且有较强的免疫原性。外膜的实验结果显示，甲型副伤寒沙门菌OmpN是位于菌体表面的跨膜蛋白，所有126株甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带ompN基因且有很高的核苷酸和氨基酸序列相似性（98.6%～100%）。甲型副伤寒沙门菌ompN基因重组表达产物rOmpN免疫家兔获得的抗血清，其免疫扩散效价可达1：16；甲副伤寒病人血清标本1：100稀释时，高达98.2%（55/56）的标本可检出rOmpN-IgG。肥达试验的本质是伤寒或副伤寒抗体血清与菌体表面抗原结合的免疫凝集反应。我们的微量肥达试验结果显示，1：10稀释的rOmpN兔抗血清能凝集99.2%（125/126）甲型副伤寒沙门菌临床菌株，提示这些菌株均表达OmpN。因此，甲型副伤寒沙门菌ompN是分布广泛且序列保守的外膜蛋白基因，OmpN是高表达且有较强免疫原性的外膜蛋白抗原。

动物保护试验是确定任一蛋白能否作为基因工程疫苗候选抗原的关键。我们的小鼠免疫保护试验结果显示，100或200 μg rOmpN免疫的小鼠能抵抗甲型副伤寒杆菌50001株致死性攻击而存活，但通常疫苗免疫保护率达到90%以上才能令人满意。目前认为，与抗原构造较为简单的病毒不同，细菌是抗原构造复杂多样的原核细胞型微生物，单一细菌蛋白抗原的抗体作用靶点极为有限，难以获得理想的免疫保护效果，必须同时采用多种细菌表面蛋白同时作为免疫原，才有可能获得良好的免疫保护效果。因此，rOmpN可作为甲型副伤寒杆菌有效抗原之一，与我们以往证实的rSpaO和rH1a抗原联合应用，从而研制出高效多价甲副伤寒基因工程疫苗。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江医学高等专科学校

 

<120>  甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用

 

<130>  11

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1152

<212>  DNA

<213>  甲型副伤寒沙门菌

 

<400>  1

atgaaaagaa aagtattggc acttgtcatc ccggctctgc tggctgctgg cgcggcacac     60

 

gccgctgaaa tttataacaa agacggcaac aaactggacc tttacgggaa agtagacggc    120

 

ctgcactatt tctctgatga ctcttctaaa gatggcgacc agacttatat gcgtttcggc    180

 

tttaaaggcg aaacacagat taatgaccaa ctgaccggtt acggccagtg ggaatataac    240

 

gttcaggcta acactaccga aggcgaaggc gcgaactcct ggactcgtct ggcattcgcc    300

 

ggtctgaaat tcggcgacta cggctcattc gactatggtc gtaactacgg cgtcctgtac    360

 

gacgtagaag gctggaccga tatgctgcct gagttcggcg gcgactccta tacttacgct    420

 

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gctgacgatg taaatatcgg taccaataac cgtaatgatg gcgacgatat tcgttacgat    600

 

aacggtgatg gcttcggtat ttctactacc tatgatattg gcatgggctt cagcgcaggc    660

 

gctgcgtata ccacttccga tcgtactaat gagcaagtca atgcaggcgg taccattgct    720

 

ggcggcgaca aagcggatgc atggacagct ggcttgaaat atgatgccaa caacatctat    780

 

ttagcgacta tgtattctga aacccgtaat atgacgcctt atggtaaaac ggacaaggat    840

 

tatgctggcg gcgtagcaaa caaaacgcaa aacttcgaag ttacagccca atatcaattt    900

 

gacttcggtc tgcgcccggc ggtttctttc ctgatgtcta aaggtaaaga tctgacctat    960

 

aacaacgtta atggtgatga taaagacctg gttaaatatg ctgatgtagg tgctacctac   1020

 

tatttcaaca aaaacttctc cacctatgtt gattataaaa tcaacctgct ggatgatgac   1080

 

gacccgttct ataaagatgc cggtatcagc actgatgata tcgtcgcgct gggtatggtt   1140

 

taccagttct aa                                                       1152

 

 

<210>  2

<211>  383

<212>  PRT

<213>  甲型副伤寒沙门菌

 

<400>  2

 

Met Lys Arg Lys Val Leu Ala Leu Val Ile Pro Ala Leu Leu Ala Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ala Ala His Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu

            20                  25                  30         

 

 

Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asp Ser

        35                  40                  45             

 

 

Ser Lys Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Phe Gly Phe Lys Gly Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Gln Ile Asn Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Val Gln Ala Asn Thr Thr Glu Gly Glu Gly Ala Asn Ser Trp Thr Arg

                85                  90                  95     

 

 

Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Gly Arg Asn Tyr Gly Val Leu Tyr Asp Val Glu Gly Trp Thr Asp Met

        115                 120                 125            

 

 

Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Ala Asp Asn Tyr Met

    130                 135                 140                

 

 

Thr Gly Arg Ala Asn Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asn

                165                 170                 175    

 

 

Glu Ser Gln Ser Ala Asp Asp Val Asn Ile Gly Thr Asn Asn Arg Asn

            180                 185                 190        

 

 

Asp Gly Asp Asp Ile Arg Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Phe Gly Ile Ser

        195                 200                 205            

 

 

Thr Thr Tyr Asp Ile Gly Met Gly Phe Ser Ala Gly Ala Ala Tyr Thr

    210                 215                 220                

 

 

Thr Ser Asp Arg Thr Asn Glu Gln Val Asn Ala Gly Gly Thr Ile Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Gly Asp Lys Ala Asp Ala Trp Thr Ala Gly Leu Lys Tyr Asp Ala

                245                 250                 255    

 

 

Asn Asn Ile Tyr Leu Ala Thr Met Tyr Ser Glu Thr Arg Asn Met Thr

            260                 265                 270        

 

 

Pro Tyr Gly Lys Thr Asp Lys Asp Tyr Ala Gly Gly Val Ala Asn Lys

        275                 280                 285            

 

 

Thr Gln Asn Phe Glu Val Thr Ala Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu

    290                 295                 300                

 

 

Arg Pro Ala Val Ser Phe Leu Met Ser Lys Gly Lys Asp Leu Thr Tyr

305                 310                 315                 320

 

 

Asn Asn Val Asn Gly Asp Asp Lys Asp Leu Val Lys Tyr Ala Asp Val

                325                 330                 335    

 

 

Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Phe Ser Thr Tyr Val Asp Tyr

            340                 345                 350        

 

 

Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asp Asp Pro Phe Tyr Lys Asp Ala Gly

        355                 360                 365            

 

 

Ile Ser Thr Asp Asp Ile Val Ala Leu Gly Met Val Tyr Gln Phe

    370                 375                 380            

 

 

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

cgccatatga tgaaaagaaa agtattggca                                      30

 

 

<210>  4

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

cgcctcgagg aactggtaaa ccatacccag                                      30

 

 

Claims (10)

1.甲型副伤寒沙门菌ompN基因, 其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白，其特征在于该表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求2所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白在对甲型副伤寒杆菌的免疫保护中的应用。

4.如权利要求2所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白在制备治疗甲型副伤寒疫苗中的应用。

5.含有权利要求1 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）ompN基因扩增，得到ompN基因；

2）采用T-A克隆试剂盒将ompN基因克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T ^ompN ；

3）将pMD-19-T ^ompN 与原核表达载体pET42a用Nde I和Xba I双酶切，回收目的DNA条带，将300～500 ng的提纯的DNA条带与100 ng线性化 pET42a混合，在T4 DNA连接酶作用下形成重组表达载体pET42a ^ompN 。

7.如权利要求6所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于所述的步骤1）中以甲型副伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物进行PCR扩增。

8.含有权利要求1 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达工程菌。

9.如权利要求8所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达工程菌构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）ompN基因扩增，得到ompN基因；

2）采用T-A克隆试剂盒将ompN基因克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T ^ompN ；

3）将pMD-19-T ^ompN 与原核表达载体pET42a用Nde I和Xba I双酶切，回收目的DNA条带，将300～500 ng的提纯的DNA条带与100 ng线性化 pET42a混合，在T4 DNA连接酶作用下形成重组表达载体pET42a ^ompN ；

4）采用CaCl₂法将pET42a ^ompN 转化入表达宿主菌E. coli BL21DE3形成工程菌株E. coli BL21DE3 ^pET42a-ompN 。

10.如权利要求9所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达工程菌构建方法，其特征在于所述的步骤1）中以甲型副伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物进行PCR扩增。