CN104587920B - 一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法 - Google Patents

一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，通过采用微波脉冲加热方式使生物大分子在微粒表面交联凝聚，形成被所述生物大分子包裹的核壳型微球；并保持生物大分子/微粒混合溶液体系中其他的生物大分子性质不变，有序控制生物大分子包裹的核壳型微球的形成。本发明利用无机纳米材料对微波吸收率的各异性，通过调整微波的占空比，使生物大分子的交联凝聚有序、稳定进行，可灵活控制生物大分子包裹层的厚度，制备方法简单，所制备的核壳型微球非特异性吸附低、生物相容性好且易于偶联标记，可广泛用于免疫标记分析、免疫层析、生物标记与分离纯化等领域。

Description

一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法
技术领域
本发明属于材料领域，更具体地，涉及一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法。
背景技术
近年来，无机纳米材料(例如量子点、超顺磁性纳米粒、荧光上转换纳米晶体等)在生物医学方面的应用是科学界与产业界的研究热点。为了使无机纳米材料应用于生物医学，首先需要解决无机微粒子的水溶性、稳定性、可修饰性及生物相容性等问题。目前最常用的方法是通过聚苯乙烯等合成高分子聚合物包裹无机微粒形成稳定的核壳型微球，然后通过表面化学修饰等方法增加聚合物微球的水溶性与可修饰性。尽管这种高分子聚合物包裹微球具有制备技术成熟、表面基团可控、均一性好等优点，但仍存在非特异性吸附偏高、生物相容性较差、生物降解困难等问题。
利用生物大分子替代合成高分子来包裹无机纳米材料可以很好地解决以上问题。通过非特异性吸附或是加入化学交联剂的方式，可以在微粒子表面形成生物分子包裹层。目前文献报道的用于无机纳米材料包裹的生物大分子材料包括多糖类(壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖等)和蛋白质类(人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白BSA、抗体、酶等)。非特异性吸附法的非共价键作用力较弱，存在稳定性差、生物大分子易脱落等问题；而化学交联法可控性差，对制备工艺要求较高。
生物大分子被加热到热变性临界温度以上时会发生亲疏水区反转、分子间二硫键交联等一系列显著变化，导致热变性凝聚。利用生物大分子的热变性交联凝聚制备的核壳型微球不但能增强无机纳米材料的稳定性与水溶性，还具有非特异性吸附低、生物相容性好、易于偶联标记等突出优点，成为近年来研究的热点。Simioni等采用含有赤铁矿纳米粒子的磁流体，通过水浴加热使BSA变性从而形成BSA包裹的磁珠(Journal of Nanoscienceand Nanotechnology.2006,6:2413-5)。Wang Jinyi等用高温变性法制得超顺磁性的HSA/γ-Fe2O3微球(Analytical Chemistry.2009,81:6210-6217)。但这种直接加热变性的方法可控性较差。生物大分子不仅会在微粒表面发生变性交联，溶液中游离的生物大分子之间、不同磁纳米粒表面的生物分子之间都会在高温下发生相互交联凝聚，最终导致产物粒径不均一、分散性差、表面包裹不完全等问题。
与传统的传导和对流加热方式不同，微波加热依赖于介质对微波的吸收能力并把能量转化为热量。不同的介质材料的微波吸收率不同，通常极性较大的溶剂、催化剂以及半导体材料可以被更有效的加热(Nanotechnology.2012,23:215602)。而纳米材料的表面效应、小尺寸效应和量子尺寸效应等使其具有独特的吸波机理，具有更高的微波吸收率(宇航材料工艺,2002,5:5-9)。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其中通过对其关键交联凝聚步骤、加热手段、温度设定等进行改进，与现有技术相比能够有效解决产物粒径不均一、分散性差的的问题；并且该制备方法操作灵活，可针对不同的生物大分子/微球体系、包裹层的厚度要求等调整参数设置，应用范围广泛。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物大分子与需要包裹的微粒在水溶液中混合，得到生物大分子/微粒混合溶液，使所述生物大分子粘附在所述微粒表面；
(2)通过微波脉冲加热方式加热所述生物大分子/微粒混合溶液，使所述微粒表面周期性形成高于所述生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，并使所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终保持低于所述生物大分子的热变性温度；所述生物大分子在所述微粒表面周期性瞬时局部高温作用下在微粒表面相互交联凝聚，形成核壳型的微球，并且该微球的内部为所述微粒，所述微粒被所述生物大分子所完全包裹；
(3)将所述核壳型微球进行清洗、分离，得到被所述生物大分子包裹的核壳型微球。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中的微波脉冲是周期性的，通过调整微波脉冲的占空比或者微波功率控制所述生物大分子/微粒混合溶液的温度。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中微波加热过程中所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终低于该生物大分子的热变性温度，避免溶液中游离的生物大分子因热变性而相互交联凝聚。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中在微波加热时，微粒表面形成的瞬时局部高温的温度高于该生物大分子的热变性温度，生物分子在微粒表面的局部高温作用下发生热变性而相互交联凝聚，牢固包裹在微粒表面。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中混合溶液中生物大分子与微粒的质量比为1：1～100：1。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中需要包裹的微粒为无机纳米材料。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中需要包裹的微粒是金纳米粒、量子点、超顺磁性铁氧体或荧光上转换纳米晶体，或者是包含有金纳米粒、量子点、超顺磁性铁氧体或荧光上转换纳米晶体的复合微粒。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中的生物大分子为蛋白质或多糖，或者是包含有蛋白质或多糖的血清、腹水、乳汁。
作为本发明的进一步优选，所述蛋白质包括以下物质的一种：免疫球蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、鸡卵白蛋白、酶、胶原蛋白；优选为牛血清白蛋白；所述多糖包括以下物质的一种：壳聚糖、葡聚糖、果糖、琼脂糖。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.生物大分子与需要包裹的微粒在溶液中混匀之后进行脉冲式微波加热，利用微波被无机纳米粒高效吸收并在微粒表面形成局部高温的特点，通过将反应溶液的整体温度控制在生物大分子的热变性温度之下，促使生物大分子只能在微粒表面的局部高温下发生热变性，从而在无机纳米粒表面逐步交联凝聚，最终形成生物大分子包裹的核壳型微球。与水和生物大分子相比，微粒(尤其是无机纳米材料的微粒)具有更高的微波吸收率，因此微粒在微波加热时升温速度要快得多。
通过对微波的占空比进行调整，即，采用脉冲加热方式，可以使微球表面的温度形成升温-降温的连续循环(即，使微粒表面周期性形成高于生物大分子热变性温度的瞬时局部高温)，确保在提供生物大分子热变性所必需的瞬时局部高温的同时，溶液的整体温度始终低于生物大分子的热变性温度。
2.生物大分子的交联凝聚有序、稳定进行。由于采用微波加热、并调整微波的占空比，使得微粒相对于溶液中的其他部分(如水溶剂、生物大分子等)能迅速升温，从而使微粒的表面形成温度高于生物大分子热变性温度的局部高温，而溶液体系整体的温度始终低于所述生物大分子的热变性温度，使生物大分子首先凝聚在微粒表面，避免溶液中游离的生物大分子因热变性而相互交联凝聚；并且在溶液体系中微粒和生物大分子的扩散运动、布朗运动等的作用下，生物大分子以微粒为中心逐层有序凝聚。
3.可灵活控制生物大分子包裹层的厚度。生物大分子包裹层的厚度既可通过调整溶液体系中生物大分子的浓度灵活控制，也可以通过调整微波脉冲的幅值、占空比参数以及加热时间进行。
4.采用生物大分子替代聚苯乙烯等化学合成高分子材料进行包裹，解决了化学合成高分子材料生物相容性较差、非特异性吸附高的缺陷。生物大分子自身含有的羟基、氨基等活性基团增强了微粒的水溶性，也为偶联标记应用提供了反应活性位点。
5.通过控制生物大分子/微粒混合溶液体系的温度，使所述微粒表面周期性形成高于所述生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，并使所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终保持低于所述生物大分子的热变性温度，能够有效确保被生物大分子包裹的核壳型微球的有效合成，反应可控性高、效果好，可以通过改变反应条件(如微波强度、占空比等)及时改变生成物的形貌参数。需要包裹的微粒优选为Fe3O4超顺磁性纳米粒、CdTe量子点或者胶体金微球，粒径优选为10nm～25nm，具有该粒径大小的这些材料的微粒其微波的吸收能力强，在微波辐射下能快速升温，非常适用于本发明中的微波脉冲加热方式使生物大分子/微粒混合溶液的温度达到预定要求(即，使所述微粒表面周期性形成高于所述生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，并使所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终保持低于所述生物大分子的热变性温度)。
而本发明中混合溶液中生物大分子与微粒的质量比优选为1：1～100：1，既能够保证生成物的有序合成，便于控制生成物核壳型微球的形貌，又能最大限度的提高一次反应的生成物产量，对实际生产的指导作用明显。
综上，与现有技术相比，本发明具有制备方法简单、生物分子包裹层厚度可控等特点，所制备的核壳型微球非特异性吸附低、生物相容性好且易于偶联标记，可广泛用于免疫标记分析、免疫层析、生物标记与分离纯化等领域。
附图说明
图1a、1b分别是生物大分子包裹核壳型微球的制备流程图和原理示意图；
图2是微粒表面瞬时温度随微波加热脉冲变化的原理示意图；
图3是本发明使用的一种微波加热装置结构示意图；
图4是BSA包裹前微粒(Fe3O4纳米粒)的透射电镜照片；
图5是微波加热后得到的BSA包裹核壳型磁性微球的透射电镜照片；
图6是FT-IR红外谱图，其中(a)BSA,(b)空白磁球,(c)微波加热后得到的BSA包裹核壳型微球；
图7是不同微波加热时间得到的BSA包裹磁球的热重分析曲线(TGA)。其中(a)是包裹前的空白磁球，(b)是加热25分钟后得到的BSA包裹微球，(c)是加热45分钟后得到的BSA包裹微球，(d)是加热90分钟后得到的BSA包裹微球，(e)是BSA；
图8是是微波加热后得到的核壳型胶体金微球的透射电子显微镜(TEM)照片；
图9是微波加热后得到的胶原蛋白包裹的量子点荧光微球透射电镜照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
如图1所示的生物大分子包裹核壳型微球的制备原理示意图，其原理为：(1)将生物大分子与准备包裹的微粒在溶液中充分混匀；(2)生物大分子在非特异性吸附等作用下粘附到微粒表面，形成不稳定的蛋白冠(proteincorona)；(3)在脉冲式微波加热方式下，微粒表面的生物大分子在局部高温下发生热变性，通过在分子间形成新的二硫键等共价键作用而相互交联；溶液中的游离生物大分子则因溶液整体温度低于大分子的热相变温度而不变性；(4)溶液中的游离生物大分子会在对流、扩散等作用下持续向未包裹完全的微粒表面扩散并吸附，(5)并在微波作用下不断产生分子间交联，使微粒表面的生物大分子层逐渐变厚；(6)反应完毕后，去掉游离的生物大分子，得到生物大分子包裹的核壳型微球产物。
生物大分子包裹微球的具体制备步骤如下：
第一步：将生物大分子与需要包裹的微粒按一定比例在溶液中充分混合，使生物分子通过非特异性吸附等方式粘附在微粒表面。
虽然微波加热对溶液的极性没有要求，但由于生物大分子大多是水溶性的，因此反应溶液优先选择水溶液。对于少数极难溶于水的微粒子，可在水溶液中加入少量有机助溶剂或表面活性剂来增加分散性，或是将微粒子进行水溶化修饰后再用。
在氢键作用、电荷作用、范德华力等弱相互作用力以及金属配位键的共同作用下，溶液中的生物大分子会逐渐被微粒子吸附，在微粒表面形成蛋白冠。但此时生物大分子对微粒子的包覆并不完全，而且两者之间的连接也不够牢固，pH、盐度等外界条件改变甚至剧烈搅拌都有可能导致吸附的生物大分子脱落。
第二步：将第一步所得溶液放入微波加热器中，通过微波脉冲加热方式使微粒表面周期性形成高于生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，同时保持反应溶液的整体温度始终低于生物大分子的热变性温度；生物大分子会在瞬时局部高温作用下在微粒表面发生热变性，通过在分子间形成二硫键等共价键作用而相互交联凝聚，最终形成以无机微粒为核、以生物大分子为壳的核壳型微球。
在整个微波加热过程中，反应溶液的整体温度必须始终低于该生物大分子的热变性温度，否则溶液中游离的生物大分子都会因为热变性而相互交联凝聚，使整个溶液凝胶化，导致制备失败。整体温度一般是指所述生物大分子/微粒混合溶液的温度，一般为微波脉冲加热时设定的温度。而对于微波脉冲加热时微粒表面形成的瞬时局部高温，则应高于该生物大分子的热变性温度，生物分子在微粒表面的局部高温作用下可以发生热变性交联凝聚，从而牢固包裹在微粒表面。
与水和生物大分子相比，无机纳米材料具有更高的微波吸收率，因此在微波加热时，无机纳米材料构成的微粒升温速度比水溶液要快得多，可以在微粒表面形成高于生物大分子热相变温度的局部高温。为了达到溶液整体温度较低、微粒表面局部温度较高的目的，微波加热器采用脉冲式恒温加热方式，微波打开时微粒会被加热快速升温，微波关闭时微粒的温度又会逐步降低。
图2展示了微粒表面瞬时温度和溶液整体温度随微波加热脉冲变化的示意图。一个微波加热脉冲周期tCy＝t1+t2，其中tCy为一个微波加热脉冲周期，t1为微波打开的时间，t2为微波关闭的时间(tCy、t1和t2均可为微波周期的整数倍)；而加热脉冲的占空比DC＝t1/tCy。在脉冲式微波加热方式下，具有更高微波吸收率且数量较少的微粒其表面瞬时温度会随着微波加热器的开与关同步升降温。另外，Tmax是系统达到热平衡后微粒表面能达到的最高瞬时温度，而Tsol则是反应溶液的宏观整体温度，Ttc为生物大分子的热变性临界温度，系统达到热平衡时Tmax>Ttc>Tsol。当系统达到热平衡时，微粒表面的瞬时温度会在最高温度Tmax和最低温度Tmin之间周期性波动。而对于升降温速率慢的大量溶液，其整体温度Tsol则相对稳定。对于热变性临界温度为Ttc的生物大分子，如果通过调整微波功率和加热脉冲占空比等条件使Tmax>Ttc>Tsol，则可以在保证溶液中游离生物大分子的稳定的前提下，利用微粒表面的局部瞬时高温实现生物大分子的热变性凝聚。
根据本发明，可以根据需要选择加热时间、最大微波功率、微波加热脉冲占空比，以及其它反应参数，只要这些参数的选择可以使得微粒表面形成高于生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，同时保持反应溶液的整体温度始终低于生物大分子的热变性温度。需要强调的是，本发明通过调整微波脉冲的占空比，使所述微粒表面周期性形成高于所述生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，并使所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终保持低于所述生物大分子的热变性温度；所述生物大分子/微粒混合溶液中的生物大分子在所述微粒表面周期性瞬时局部高温作用下在微粒表面有序的交联凝聚，形成被所述生物大分子包裹的核壳型微球。
确定合适的加热时间、最大微波功率、微波加热脉冲占空比或其它反应参数的方法是本领域的常规技术，例如可以通过测量最终产物，即核壳型微球的粒径变化，通过有限次的实验确定合适的参数选择。在优选的实施方案中，通过对比实验对加热时间、最大微波功率、微波加热脉冲占空比进行优化。在特定的实施方案中，在对比实验中，对于加热时间、最大微波功率、微波加热脉冲占空比三个变量中的每一个变量，保持其它制备条件和变量不变，改变该变量，通过测量最终产物，即核壳型微球的粒径随该变量的变化，从而确定该变量的最优选择。这种对比实验属于本领域的常规技术。
优选地，使用加热控制电路控制反应溶液的整体温度，加热控制电路将依据当前溶液整体温度Tsol和预设温度值TSet，自动调整微波加热器的工作脉冲占空比DC，保证反应溶液的温度稳定，必要时还可加装冷却装置来辅助降温。更优选地，使用比例-积分-微分(PID)控制器控制反应溶液的整体温度。PID温度控制算法是一种工业应用非常成熟的的温控方法，具有自整定(AT)功能的PID温度控制器不需要用户自己输入控制参数，只需设定目标温度，然后在真实工况下运行数次(称为整定)，控制器就会根据系统的升温降温速率，通过人工智能调节算法自动确定PID的控制参数。在特定的实施方案中，可以使用商品化的PID温度控制器。
在优选的实施方案中，使用PID温度控制器自动调整微波加热器的工作脉冲占空比DC，以控制反应溶液的整体温度。
确定合适的预设温度值TSet的方法是本领域的常规技术，例如，可以通过测量最终产物，即核壳型微球的粒径变化，通过有限次的实验确定合适的参数选择。在优选的实施方案中，通过对比实验对预设温度值TSet进行优化。在特定的实施方案中，在对比实验中，保持其它制备条件不变，改变预设温度值TSet，通过测量最终产物，即核壳型微球的粒径随该预设温度值TSet的变化，从而确定预设温度值TSet的最优选择。这种对比实验属于本领域的常规技术。
在优选的实施方案中，通过热重分析测量形成的核壳型微球的粒径变化。由于生物大分子加热时会分解失重，因此热失重比例越高说明微球包裹的生物大分子层越厚。
除粒径分析、热重分析等手段以外，还可以通过考查形成的核壳型微球在不同pH、不同盐度情况下的稳定性等常规技术来辅助判断生物大分子包裹微球的稳定性，从而确定最优制备条件。
在脉冲式微波加热过程中，溶液中的游离生物大分子会通过分子扩散或是吸附作用等途径持续粘附到微粒表面，并在微波加热作用下相互交联，使微粒表面的生物大分子层逐渐增厚。通过改变生物大分子的投加量、延长微波加热时间、提高预设温度值TSet等制备条件，可以对生物分子层的厚度实现简单调控。
第三步：将步骤二得到的产物冷却至室温后，通过清洗、分离，去掉游离的生物大分子，得到生物大分子包裹的核壳型微球。根据微球尺寸与性质的不同，可以选择离心、过滤、磁分离等方式将微球从溶液中分离、纯化。
下面结合试验例子进行说明：
实施例一：
本实施例用微波加热法制备了牛血清白蛋白BSA包裹的超顺磁性纳米粒。微波的频率为2450MHz。所用磁性微粒是共沉淀法制备的Fe3O4超顺磁性纳米粒(SPIO，粒径7～20nm)，经柠檬酸处理后用PBS缓冲液清洗备用。所用BSA在浓度为0.1％PBS缓冲液条件下加热30分钟的热变性温度为72～74℃(通过动态光散射法测量不同温度下BSA溶液的粒径变化得出)。
具体制备步骤如下：
1、取5g牛血清白蛋白BSA溶解于500mL PBS缓冲液中，所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L。加入0.5g事先用共沉淀法制备好的SPIO微粒，BSA与SPIO的比例为10:1，在滚瓶器上以60rpm转速室温混匀2小时，使BSA尽可能多地粘附到磁性微粒表面。
2、将上述溶液放入微波加热器中加热。溶液整体温度预设为63℃，总加热时间设为45分钟，最大微波功率设为200W，加热方式为脉冲式加热，加热脉冲信号的占空比由PID温度控制器(厦门宇电AI-518型)通过AT自整定功能进行自动调节，占空比的调节范围为0％～100％之间。所用装置的结构示意图见图3。加热过程中搅拌器转速800rpm，未使用冷却水。
3、待反应完毕，将溶液冷却至室温。用磁分离器将磁性微球吸到容器底部，倒掉上清液；然后移走磁分离器，加入适量PBS溶液重悬。重复磁分离清洗三次，得到BSA包裹的超顺磁性纳米粒。
实施例二：
1、取2kg牛血清白蛋白BSA溶解于500L PBS缓冲液(使整个体系更加稳定)中，所述PBS缓冲液的浓度为0.05mol/L。加入2kg事先用共沉淀法制备好的SPIO微粒，BSA与SPIO的比例为1:1，在滚瓶器上以60rpm转速室温混匀12小时，使BSA尽可能多地粘附到磁性微粒表面。
2、将上述溶液放入微波加热器中加热。溶液整体温度预设为63℃，总加热时间设为35分钟，最大微波功率设为1800W，加热方式为脉冲式加热，加热脉冲信号的占空比由PID温度控制器通过AT自整定功能进行自动调节。所用装置的结构示意图见图3。加热过程中搅拌器转速200rpm。
3、待反应完毕，将溶液冷却至室温。用磁分离器将磁性微球吸到容器底部，倒掉上清液；然后移走磁分离器，加入适量PBS溶液重悬。重复磁分离清洗三次，得到BSA包裹的超顺磁性纳米粒。
实施例三：
1、取10kg牛血清白蛋白BSA溶解于500L PBS缓冲液中，所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L。加入100g事先用共沉淀法制备好的SPIO微粒，BSA与SPION的比例为100:1，在滚瓶器上以40rpm转速室温混匀24小时，使BSA尽可能多地粘附到磁性微粒表面。
2、将上述溶液放入微波加热器中加热。溶液整体温度预设为63℃，总加热时间设为60分钟，最大微波功率设为5000W，加热方式为脉冲式加热，加热脉冲信号的占空比由PID温度控制器通过AT自整定功能进行自动调节。加热过程中搅拌器转速100rpm。
3、待反应完毕，将溶液冷却至室温。用磁分离器将磁性微球吸到容器底部，倒掉上清液；然后移走磁分离器，加入适量PBS溶液重悬。重复磁分离清洗三次，得到BSA包裹的超顺磁性纳米粒。
在实施例一至三中所制备的核壳型微球，可以通过透射电镜、傅立叶变换红外(FT-IR)等方法检验BSA是否包覆成功。图4是BSA包裹前的空白SPIO微粒的TEM电镜照片，其平均粒径约为15nm。图5是微波加热后得到的BSA包裹核壳型微球的TEM电镜照片，可清楚看到颜色较浅的BSA包裹在Fe3O4纳米粒的周围，形成了Fe3O4微粒为核、包裹蛋白BSA为壳的核壳型微球，微球粒径在50～100nm之间。图6为FT-IR红外谱图，表明磁球表面已被BSA蛋白包裹。微球表面的BSA所带有的羟基、氨基等活性基团，一方面增加了微粒在水溶液中的稳定性，另一方面也为后续的偶联标记提供了反应位点。
在以上实施例第2步中，预设温度，加热时间，最大微波功率等条件是通过对比实验优选确定的。以加热时间的优选为例：在其它制备条件不变的情况下，按实施例一所述方法将加热时间设为25分钟、45分钟和90分钟，分别制备三批微球，然后进行热重分析测量其热失重率(图7)。由于BSA加热时会分解失重，因此热失重比例越高说明微球包裹的BSA层越厚。从图7可知，加热45分钟制备的微球BSA含量(厚度)明显高于加热25分钟的微球，而与90分钟微球差别不大。综合考虑包裹效果与制备成本，优选45分钟作为总加热时间。同理，在保证反应溶液整体温度低于BSA热变性温度的前提下，可对预设温度、微波功率等条件进行类似的优化。
实施例四：
本实施例用微波加热法制备了生物大分子包裹的胶体金微球。所用微粒是平均粒径约40nm的胶体金纳米粒，所用生物大分子为多克隆抗体(小鼠抗血清原液)，其热变性温度约为65～70℃。具体步骤如下：
1、取100L胶体金溶液(其质量百分浓度为0.01％)，加入150L小鼠抗血清和100L碳酸盐缓冲液(其浓度为0.05mol/L)，在滚瓶器上以30rpm转速4℃混匀过夜，使血清中的免疫球蛋白等生物大分子吸附到胶体金表面。
2、将上述溶液放入微波加热器中加热。用与实施例一所述对比实验相同的方法确定预设温度、加热时间、最大微波功率。溶液整体温度预设为40℃，总加热时间设为60分钟，最大微波功率设为500W，加热方式为脉冲式加热，加热脉冲信号的占空比由PID温度控制器根据溶液温度变化速率自动调节。所用装置的结构示意图见图3。加热过程中搅拌器转速100rpm，使用循环冷却水辅助降温。
3、待溶液温度冷却至室温后，用离心机6000rpm离心分离，倒掉上清液后用超纯水重悬，超声波清洗三次，得到生物大分子包裹的胶体金微球。
微波加热后得到的核壳型胶体金微球的TEM电镜照片见图8，微球中心的深色的是胶体金纳米粒，微球周边的浅色区域为生物大分子。
实施例五：
本实施例用微波加热法制备了胶原蛋白包裹的量子点荧光微球。所用微粒是平均粒径5nm的CdTe量子点，所用生物大分子为鲸鲨I型胶原蛋白，其热变性温度约40～41℃。具体步骤如下：
1、取100g CdTe量子点，加入400g鲸鲨I型胶原蛋白，溶解于50L超纯水中，在滚瓶器上以30rpm转速4℃避光混匀12小时。
2、将上述溶液放入微波加热器中加热。用与实施例一所述对比实验相同的方法确定预设温度、加热时间、最大微波功率。溶液整体温度预设为38℃，总加热时间设为120分钟，最大微波功率设为50W，加热方式为脉冲式加热，加热脉冲信号的占空比由PID温度控制器进行自整定自动调节。所用装置的结构示意图见图3。加热过程中搅拌器转速50rpm，使用0℃冰水混合溶液作为循环冷却水辅助降温。
3、待溶液温度冷却至室温后，用离心机7500rpm离心分离，倒掉上清液后用超纯水重悬，清洗三次，得到胶原蛋白包裹的荧光微球。产物的TEM照片见图9。
以上实施例中，缓冲液(如PBS缓冲液、碳酸盐缓冲液)能够使整个体系更加稳定，也可全部用水替换，对最终的生物大分子包裹微球产物没有宏观上的影响。生物大分子与需要包裹的微粒在溶液中充分混合，使生物分子通过非特异性吸附等方式粘附在微粒表面，为了使微粒(如SPIO纳米粒)更加分散，可预先使用柠檬酸对微粒进行处理，提高微粒的分散性；另外，在该混合溶液体系中，生物大分子的浓度、微粒的浓度均可根据实际需要灵活调整，量多量少均能够制备得到生物大分子包裹微球的产物，一般可优选在该混合溶液体系中，生物大分子的浓度为1mg/mL～100mg/mL，微粒的浓度为0.01mg/mL～50mg/mL。
其中，本发明制备方法中的所用的生物大分子可以是蛋白质(如免疫球蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、鸡卵白蛋白、酶、胶原蛋白等)、多糖(壳聚糖、葡聚糖、果糖、琼脂糖)等具有热变性能力的生物分子，也可以是含有蛋白质、多糖成分的生物体液(如血清、腹水、组织液、奶等)。用于包裹的微粒可以是金纳米粒、量子点、超顺磁性铁氧体(如四氧化三铁Fe3O4、三氧化二铁Fe2O3纳米粒)、荧光上转换纳米晶体(如NaYF4:Yb,Er/Tm)等半导体无机纳米材料，也可以是含有这些无机纳米材料的复合微粒子。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物大分子与需要包裹的微粒在水溶液中混合，得到生物大分子/微粒混合溶液，使所述生物大分子粘附在所述微粒表面；
(2)通过微波脉冲加热方式加热所述生物大分子/微粒混合溶液，使所述微粒表面周期性形成高于所述生物大分子热变性温度的瞬时局部高温，并使所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终保持低于所述生物大分子的热变性温度；所述生物大分子在所述微粒表面周期性瞬时局部高温作用下在微粒表面相互交联凝聚，形成核壳型的微球，并且该微球的内部为所述微粒，所述微粒被所述生物大分子所完全包裹；
所述微波脉冲是周期性的，通过调整微波脉冲的占空比控制所述生物大分子/微粒混合溶液的温度；
微波加热过程中所述生物大分子/微粒混合溶液的整体温度始终低于该生物大分子的热变性温度，避免溶液中游离的生物大分子因热变性而相互交联凝聚；
微波加热时，微粒表面形成的瞬时局部高温的温度高于该生物大分子的热变性温度，生物分子在微粒表面的局部高温作用下发生热变性而相互交联凝聚，牢固包裹在微粒表面；
(3)将所述核壳型微球进行清洗、分离，得到被所述生物大分子包裹的核壳型微球。
2.如权利要求1所述的微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合溶液中生物大分子与微粒的质量比为1：1～100：1。
3.如权利要求1所述的微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，所述步骤(1)中需要包裹的微粒为无机纳米材料。
4.如权利要求1所述的微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，所述步骤(1)中需要包裹的微粒是金纳米粒、量子点、超顺磁性铁氧体或荧光上转换纳米晶体，或者是包含有金纳米粒、量子点、超顺磁性铁氧体或荧光上转换纳米晶体的复合微粒。
5.如权利要求1所述的微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的生物大分子为蛋白质或多糖。
6.如权利要求5所述的微波加热制备生物大分子包裹微球的方法，其特征在于，所述蛋白质至少包括以下物质的一种：免疫球蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、鸡卵白蛋白、酶、胶原蛋白；所述多糖至少包括以下物质的一种：壳聚糖、葡聚糖、果糖、琼脂糖。
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