CN114210277B - 一种多元环境响应性多糖微球及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多元环境响应性多糖微球及其制备和应用方法，涉及高分子材料和生物医药领域，多元环境响应性多糖微球的结构包括水相和油相，油相包裹水相；水相中包含有生物分子、温敏性多糖和环境响应性的材料；其制备步骤包括：在具有温度敏感性多糖和环境响应性的材料的水溶液混合液中加入生物分子，在搅拌、均质或挤出等制备乳液常见工艺的辅助下与适当的油相溶剂混合，通过乳化后降温固化、离心清洗的过程得到包埋连串反应物的多元环境响应性多糖微球；其在酶促连串反应中的应用。本发明通过简单的光照、电场、磁场的环境刺激，触发环境响应性微球的分步溶解，使内部包埋生物分子精准释放，从而实现在同一体系内酶促连串反应。

Description

一种多元环境响应性多糖微球及其制备和应用方法

技术领域

本发明涉及高分子材料和生物医药领域，尤其涉及一种多元环境响应性多糖微球及其制备和应用方法。

背景技术

酶促连串反应是最为基础的复杂生化反应之一。酶作为一种生物催化剂，催化反应的发生，前步反应的产物同时可以进一步被酶催化而生成其他产物。酶促连串反应在生物医药领域应用广泛，例如核酸检测与扩增、基因的编辑、药物的设计与合成、致病机理的研究等方面都涉及到多步酶促连串反应。但由于多步酶促反应之间容易互相受到干扰，前步反应结束前可能会和后步的反应物之间发生副反应，且无法控制每步反应所需酶的严格正交性，从而使连串反应不能顺利进行。因此需要在反应之间增添额外的分离提纯步骤，这大大降低了反应效率，增加了反应成本。

环境响应材料可以分为化学环境响应和物理环境响应两大类。物理环境响应材料在受到外界例如光照、电场、磁场、应力场、超声等刺激时能快速产生响应。环境的刺激引起其在结构、物理性能和化学性质上的改变，该响应过程的发生常常伴随着能量的转换。环境刺激的多元性以及材料的灵敏性使其在生物医药领域已经得到了广泛的研究和应用。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够实现同一体系内通过“一步法”实现生物医药领域相关的多元酶促连串反应的方法，以降低了反应的成本和操作难度。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何实现同一体系内通过“一步法”实现生物医药领域相关的多元酶促连串反应。

为实现上述目的，本发明提供了一种多元环境响应性多糖微球，其结构包括水相和油相，油相包裹水相；水相中包含有生物分子、温敏性多糖和环境响应材料。

进一步地，多元环境响应性糖微球尺寸在1～300μm范围内。

进一步地，生物分子水溶性良好；部分生物分子可以包埋在温敏性多糖内部，温敏性多糖包括具有不同熔点的天然多糖或改性多糖中的一种或多种；天然多糖包括纤维素醚、羧化纤维素、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、黄原胶、琼脂糖、果胶、卡拉胶、淀粉、肝素、硫酸软骨素天然多糖，改性多糖为天然多糖经过修饰所得；温敏性多糖的熔点在37℃～500℃范围内；环境响应材料包括光响应性材料、电响应性材料、磁响应性材料中的一种或多种。

本发明还提供了一种多元环境响应性多糖微球的制备方法，包括以下步骤：

(a)制备温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液；

(b)在步骤(a)得到的温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液中加入参与酶促反应的生物分子，加热至温敏性多糖的熔点以上，温敏性多糖和环境响应材料之和与水的质量比为1:100～1:5，生物分子与水的质量比为1:1000～1:1，得到水相W；

(c)将有机相加热至温敏性多糖的熔点以上，得到油相O；

(d)将步骤(a)得到的水相W加入步骤(b)得到油相O中，水相W与油相O之间的体积比为1:100～1:5，通过乳化法形成油包水乳液；

(e)将步骤(d)得到的油包水乳液置于低温下进一步固化、离心洗涤，得到具有环境响应性的包埋生物分子的多糖微球。

进一步地，步骤(a)中，温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液中环境响应材料化学键连接法、超分子作用力吸引法以及物理共混法与温敏性多糖结合；温敏性多糖包括具有不同熔点的天然多糖或改性多糖中的一种或多种；天然多糖包括纤维素醚、羧化纤维素、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、黄原胶、琼脂糖、果胶、卡拉胶、淀粉、肝素、硫酸软骨素天然多糖，改性多糖为天然多糖经过修饰所得；温敏性多糖的熔点在37℃～500℃范围内；环境响应材料包括光响应材料、电响应材料以及磁响应材料中的一种或多种。

进一步地，在制备多糖微球的步骤(a)中，多糖包括具有不同熔点的天然多糖和改性多糖，包括纤维素醚、羧化纤维素、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、黄原胶、琼脂糖、果胶、卡拉胶、淀粉、肝素、硫酸软骨素等天然多糖及其经过修饰后的改性多糖中的一种或多种，不同温敏性多糖的熔点在37℃～500℃范围内。

进一步地，步骤(a)中，获得温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液的方法依据环境响应材料的结构和性质不同可以分为：化学键连接法、超分子作用力吸引法以及物理共混法。

进一步地，步骤(a)中，通过化学键连接法获得温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液，具体步骤为：将分子量较小的环境响应性小分子通过化学键连接在温敏性多糖的分子链上，得到具有环境响应的多糖接枝共聚物。再进一步将环境敏感分子-温敏性多糖接枝共聚物溶解于相应水溶液中。其中，接枝共聚反应基团选自羧基、氨基、羟基、醛基等温敏多糖大量含有的可用于化学修饰的官能团中的一种或多种。

进一步地，步骤(a)中，通过超分子作用力吸引法获得温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液，具体步骤为：将能够与温敏多糖发生超分子作用的环境响应分子和相应温敏多糖共混，进而得到二者的水溶液或混合液。其中，用于将温敏多糖和环境响应分子物理连接的超分子作用力选自静电力、氢键、范德华力、亲水作用力、疏水作用力、主客体配位作用、π-π堆积作用、配位作用等分子间作用力中的一种或多种。

进一步地，步骤(a)中，通过物理共混法获得温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液，适用于微纳米级环境响应材料，粒径大于多糖微球内部凝胶的孔径大小，尺寸优选自10nm及以上，并通过与温敏多糖共混来获得混合液。

进一步地，步骤(a)中，环境响应材料包括光响应性的材料，选自黑色素、花青素、卟啉、酞菁、BODIPY等光响应小分子；聚苯胺、聚吡咯、聚多巴胺等具有半导体特性的高分子材料；金、银、铂等贵金属纳米颗粒；碳纳米管、石墨烯、氧化石墨烯、碳点等碳基纳米材料；MoS₂纳米片、CuS、Cu₂-xS、Cu₂-xSe等金属硫族化物材料；黑磷、纳米片、氮化硼和石墨氮化碳、MXenes等其他无机二维材料中的一种或多种。

进一步地，步骤(a)中，环境响应材料包括电响应性的材料选自镍铬合金、铁铬铝合金等金属电热材料；钛酸钡、碳化硅、铬酸镧、二硅化钼、氧化锆、石墨、导电高分子等非金属电热材料；金属、非金属复合电热材料中的一种或多种。

进一步地，步骤(a)中，环境响应材料包括磁响应性的材料选自包括磁热效应强的过渡金属铁、镍、钴及其合金和稀土金属合金，过渡金属-准金属合金等铁磁材料；铝、氧、钛和氧化铁(FeO)等顺磁材料中的一种或多种。

进一步地，在制备多糖微球的步骤(b)中加入的生物分子可以是近乎所有种类的水溶性良好的生物分子。生物分子为水溶性良好的生物分子，包括核酸酶、参与糖类合成和分解的生物酶、参与酶促反应的多肽和蛋白质、细胞间传递信息的小蛋白质或小分子多肽、内分泌细胞合成的用于细胞间交流的激素类化学物质、核酸分子或糖类生物分子中的一种或多种。

进一步地，生物分子选自包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶、RNA聚合酶、DNA内切酶、RNA内切酶等核酸酶；包括糖苷酶、酯酶、己糖激酶等参与糖类合成和分解的生物酶；包括转氨酶、蛋白激酶、转肽酶、转位酶等多肽和蛋白酶；包括参与酶促反应的多肽和蛋白质；包括细胞间传递信息的细胞因子、生长因子等小蛋白质或小分子多肽；包括内分泌细胞合成的用于细胞间交流的激素类化学物质；包括DNA、RNA等核酸分子；也包括透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠等糖类生物分子中的一种或多种。

进一步地，步骤(c)中，有机相为与水不互溶或仅微溶于水的有机溶剂，有机溶剂包括烷烃类中的一种或几种。

进一步地，在制备多糖微球的步骤(c)中，有机相为与水不互溶或仅微溶于水的有机溶剂，选自异辛醇、丁烷、辛烷、液体石蜡、石油醚、大豆油、橄榄油、棉籽油等烷烃类中的一种或几种。如需获得粒径较小且粒径分布均匀的微球，可在有机相中加入表面活性剂。表面活性剂选自脱水山梨糖醇倍半油酸酯Arlace 139、甘油醚聚合物PO-500、脱水山梨糖醇三油酸酯Span85、脱水山梨糖醇单油酸酯Span80、山梨糖醇酐单硬脂酸酯Span60、山梨醇酐单棕榈酸酯Span40等乳化剂中的一种或几种，表面活性剂与油相的体积比在1:1000～1：1范围内。

进一步地，步骤(d)中，乳化法为手摇法、机械搅拌法、膜乳化法、均质机乳化

法或微流控乳化法，并通过控制剪切力的的大小获得不同粒径的油包水乳液；步骤(e)中固化的冷却温度在-220℃～35℃范围内，离心洗涤指用无水乙醇和去离子水反复离心清洗。

进一步地，在制备多糖微球的步骤(d)中，获得油包水乳液的乳化的方法选自手摇法、机械搅拌法、膜乳化法、均质机乳化法、微流控乳化法中的一种。通过控制剪切力的的大小获得不同粒径的油包水乳液。

进一步地，在制备多糖微球的步骤(e)中冷却固化温度在-220℃～35℃范围内。固化后，用无水乙醇和去离子水反复离心清洗，获得目标多糖微球。不同剪切力下获得的微球尺寸在1～300μm范围内。

本发明还提供了一种多元环境响应性多糖微球在酶促连串反应中的应用。

进一步地，酶促连串反应包括应用于生物医药领域的核酸分子的扩增、核酸分子的检测、核酸分子的剪切、核酸分子的修饰、核酸分子的筛选、核酸分子的相对或绝对定量表征、糖类分子的代谢、多肽或蛋白质的合成、多肽或蛋白质的分解、多肽、体内药物或调节物质的递送；或蛋白质的修饰过程；酶促连串反应体系内包含一种或两种及以上具有不同环境响应性的多糖微球。酶促连串反应过程包括通过光照、电场、磁场的环境刺激，触发包埋多种分子的具有不同环境响应性微球的分步溶解。

进一步地，通过简单的环境改变，触发多糖微球的溶解，使内部包埋生物分子精准释放，从而实现在同一体系内进行“一管多元”酶促连串反应的目的。

进一步地，多糖微球合成过程简便，成本低，且内部具有包埋核酸、多糖、多肽、蛋白质等不同水溶性生物分子的能力。通过光照、磁场、电场的简单控制，利用环境响应材料的光热、电热、磁热转换功能来引发多糖微球的局部升温，进而溶解并释放内部包埋的生物分子，以此为手段在同一体系内对多步酶促连串反应之间进行隔离。

进一步地，一种多元环境响应性多糖微球在酶促连串反应中的应用方法包括以下步骤：

(1)制备具有环境响应性的多糖微球；

(2)在多糖微球制备的过程中在其内部包埋酶促连串反应所需的一种或多种生物分子；

(3)将整个酶促连串反应所需的全部反应物加入到同一个体系内，其中，会被前步反应所干扰的生物分子被包封在一种或多种多糖微球内。

(4)在酶促反应过程中通过环境触发，在特定时间将多糖微球内部的生物分子释放出来，使多步酶促连串反应在同一体系内顺利进行，不同连串反应之间互不干扰。

进一步地，所制备的包埋生物分子的环境响应性多糖微球可以稳定长期存储，储存最长时间在1-5年内。

进一步地，酶促连串反应包括应用于生物医药领域的核酸分子的扩增；核酸分子的检测；核酸分子的剪切；核酸分子的修饰；核酸分子的筛选；核酸分子的相对或绝对定量表征；糖类分子的代谢；多肽或蛋白质的合成；多肽或蛋白质的分解；多肽或蛋白质的修饰等过程。

进一步地，酶促连串反应体系内可以包含一种或两种及以上具有不同环境响应性的多糖微球，反应过程中可以通过光照、外加电场、外加磁场的环境刺激，触发包埋多种分子的具有不同环境响应性微球的分步溶解。

在本发明的较佳实施例1中，详细说明制备包埋核酸聚合酶的光响应的多糖微球的过程；

在本发明的另一较佳实施例2中，详细说明制备包埋核酸内切酶的磁场响应的多糖微球的过程；

在本发明的另一较佳实施例3中，详细说明制备包埋核酸分子的电场响应的多糖微球的过程；

在本发明的另一较佳实施例4中，详细说明制备包埋逆转录酶的电场响应的多糖微球的过程；

在本发明的另一较佳实施例5中，详细说明制备包埋胰岛素的近红外光响应的多糖微球的过程；

在本发明的另一较佳实施例6中，详细说明利用光响应琼脂糖微球在同一体系内进行体外核酸扩增的过程；

在本发明的另一较佳实施例7中，利用双元环境响应多糖微球在同一体系内进行基因表达水平的定量表征；

在本发明的另一较佳实施例8中，使用多元光、电、磁响应多糖微球进行“一管式”核酸筛选和扩增；

在本发明的另一较佳实施例9中，使用近红外光响应多糖微球进行体内的激素递送。

本发明有益的技术效果如下：

本发明制备了包埋生物分子的多元环境响应性多糖微球，并应用于在同一体系内通过“一步法”实现生物医药领域相关的多元酶促连串反应。这些多糖微球合成过程简便，成本低，且内部具有包埋核酸、多糖、多肽、蛋白质等不同生物分子的能力。通过光照、磁场、电场的简单控制，利用环境响应材料的光热、电热、磁热转换功能来引发多糖微球的局部升温，进而溶解并释放内部包埋的生物分子，以此为手段在同一体系内对多步酶促连串反应之间进行隔离。此多糖微球的优势在于：(1)可以实现高效包埋近乎所有水溶性良好的生物分子，且为包埋分子提供物理屏障，保护其生物功能和活性不受到其他分子的破坏，因此包埋的生物分子可以长期稳定存储在微球内部；(2)实现了相互非正交的酶在同一反应体系内进行“一管多元”式酶促反应，避免了连串反应之间的干扰和交叉污染，省去了分离提纯等繁琐的操作流程；(3)通过包埋多元环境响应分子实现了反应体系中多糖微球的局部加热，不干扰体系中的其他物质；(4)利用多糖微球的多元环境响应特点可以利用光照、磁场、电场等近程或远程的外部环境刺激，对酶促连串反应的开始和结束进行精准地人为控制。此发明在生化合成、核酸的体外扩增、疾病的检测与诊断、基因的修饰和筛选、药物的设计与修饰、致病机理的研究、体内药物或调节物质的递送等生物医药领域具有非常大的应用价值。

本发明的实施方法，能够简便、高效地在同一体系内进行酶促连串反应；

本发明提供的环境响应多糖微球具有以下特点和优势：可以实现高效包埋近乎所有水溶性的生物分子以及多种环境响应性材料，且保护包埋分子的功能和活性不受外部环境的干扰；在酶促连串反应中实现多步反应之间的隔离，使非正交反应在同一体系内通过一步法实现；可以通过多元环境刺激实现精准控制每步反应的开始和结束，将人为控制的方式从近程拓展到远程，将多糖微球的应用从体外拓展到体内；实现了精准的局部环境响应，避免对体系中其他物质产生影响。本发明的制备过程简单绿色，包埋效率高，对反应过程影响小，不需要繁琐地筛选正交酶，避免了酶促连串反应之间的互相干扰和复杂的分离提纯步骤，有广泛的环境响应方式，大大降低了成本和操作难度，扩展了应用范围。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例7中应用于光、电双元环境响应体外核酸逆转录和扩增的基本原理简要示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1：制备包埋核酸聚合酶的光响应的多糖微球

(1)将接枝黑色素分子的改性琼脂糖(Tm＝100℃)，高温稳定DNA聚合酶溶解于缓冲液中，100℃加热，制备水相W。

(2)将异辛醇加热到100℃，得到油相O。

(3)将水相W迅速转移至油相O内，剧烈手摇30秒，获得油包水乳液。

(4)将乳液迅速转移至冰水浴中，低温固化1小时。

(5)将乳液在1500rpm的速度下离心5分钟，依次用无水乙醇、无水乙醇和纯水清洗，除去微球表面的多余油相。

实施例2：制备包埋核酸内切酶的磁场响应的多糖微球

(1)将改性透明质酸(Tm＝60℃)、四氧化三铁颗粒、核酸内切酶溶解于缓冲液中，60℃加热，制备水相W。

(2)将石油醚和液体石蜡按1:1的体积比混合，加热到60℃，得到油相O。

(3)利用微流控设备将水相注入到油相里，获得油包水乳液。

(4)将乳液迅速转移至液氮中，低温固化20秒后等待乳液恢复室温。

(5)将乳液在1000rpm的速度下离心3分钟，依次用无水乙醇、无水乙醇和纯水清洗，除去微球表面的多余油相。

实施例3：制备包埋核酸分子的电场响应的多糖微球

(1)将改性带正电氨基海藻酸(Tm＝50℃)、带负电碳化硅颗粒和导向DNA分子溶解于缓冲液中，50℃加热，制备水相W。

(2)将大豆油加热至50℃，得到油相O。

(3)将水相W迅速转移至油相O内，在1000rpm的速度下搅拌3分钟，获得油包水乳液。

(4)将乳液迅速转移至冰水浴中，低温固化3小时。

(5)将乳液在1000rpm的速度下离心5分钟，依次用无水乙醇、无水乙醇和纯水清洗，除去微球表面的多余油相。

实施例4：制备包埋逆转录酶的电场响应的多糖微球

(1)将改性羧化纤维素(Tm＝40℃)、氧化锆颗粒和逆转录酶分散于缓冲液中，50℃加热，获得水相W。

(2)异辛醇中加入5vt％Span80，充分分散，加热到50℃，得到油相O。

(3)将水相W和油相O利用孔径10μm的快速膜乳化器进行乳化，获得油包水乳液。

(4)将乳液迅速转移至冰水浴中，低温固化1小时。

(5)将乳液在1500rpm的速度下离心5分钟，依次用无水乙醇、无水乙醇和纯水清洗，除去微球表面的多余油相。

实施例5：制备包埋胰岛素的近红外光响应的多糖微球

(1)将叶绿素衍生物PPa通过酯化反应接枝在改性淀粉分子上，并和胰岛素分子一起溶解于缓冲液中，在40℃下加热，获得水相W。

(2)将大豆油加热到40℃，得到油相O。

(3)利用均质机将水相和油相混合，获得油包水乳液。

(4)将乳液迅速转移至冰水浴中，低温固化1小时。

(5)将乳液在1500rpm的速度下离心5分钟，依次用无水乙醇、无水乙醇和纯水清洗，除去微球表面的多余油相。

实施例6：利用光响应琼脂糖微球在同一体系内进行体外核酸扩增

在反应体系内加入正向和反向引物、dNTP、实施例1中得到的包埋DNA聚合酶的改性琼脂糖微球和无酶缓冲液。加入需要扩增的模板DNA后将整个体系暴露在700nm的光照下，琼脂糖微球局部加热，使多糖微球融化，内部包埋的DNA聚合酶被释放出来，同时体系温度也随光照时间的延长而不断升高，模板DNA变性并暴露于DNA聚合酶下，停止光照后体系温度下降，进行模板DNA的扩增。

实施例7：利用双元环境响应多糖微球在同一体系内进行基因表达水平的定量表征

光、电双元环境响应体外核酸逆转录和扩增的基本原理如图1所示，反应过程中分别通过外加电场和光照的环境刺激，触发包埋多种分子的具有不同环境响应性微球的分步溶解，在同一体系内通过“一步法”实现多元酶促连串反应。在反应体系内加入实施例1中得到的包埋DNA聚合酶的改性琼脂糖微球、实施例4中得到的包埋逆转录酶的改性羧化纤维素微球(Tm＝40℃)以及核苷酸、引物等其他逆转录和核酸扩增所需原料。在加入模板mRNA后，将体系暴露在电场下，包埋逆转录酶的多糖微球受到电场刺激而局部温度升高，使逆转录酶释放并工作，将模板mRNA逆转录成cDNA。再将体系持续暴露于700nm光照下，包埋DNA聚合酶的光响应多糖微球溶解，cDNA变性的同时DNA聚合酶被释放进体系内，从而实现体外核酸的扩增，再利用荧光定量PCR技术进行特定基因的相对定量表征，获得不同基因的相对表达水平。

实施例8：使用多元光、电、磁响应多糖微球进行“一管式”核酸筛选和扩增

在反应体系内加入实施例1中得到的包埋DNA聚合酶的改性琼脂糖微球、实施例2中得到的包埋核酸内切酶的改性透明质酸微球、实施例3中得到的包埋导向DNA的改性海藻酸微球以及核苷酸等原料。在反应体系内加入目标基因，先将体系暴露于电场下，使电响应海藻酸微球溶解，导向DNA释放于目标基因所在的缓冲液内，再将体系暴露于磁场下，使磁响应改性透明质酸微球溶解，核酸内切酶被释放至缓冲溶液内。在导向DNA的靶向作用下对特定的基因片段进行切割，再将体系暴露于700nm光照下，光响应改性琼脂糖微球中的DNA聚合酶被释放，将剪切后的DNA片段再进一步地扩增。

实施例9：使用近红外光响应多糖微球进行体内的激素递送

将实施例5中获得的包埋胰岛素的改性淀粉光响应微球经皮下静脉注射入糖尿病小鼠的体内，用808nm近红外光照射小鼠，近红外光响应的改性淀粉微球被局部加热后溶解，释放所包埋的胰岛素，一小时后检测到小鼠血糖含量明显下降。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种多元环境响应性多糖微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（a）制备温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液；

（b）在步骤（a）得到的温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液中加入参与酶促反应的生物分子，加热至所述温敏性多糖的熔点以上，所述温敏性多糖和所述环境响应材料之和与所述水的质量比为1:100～1:5，所述生物分子与所述水的质量比为1:1000～1:1，得到水相W；

（c）将有机相加热至所述温敏性多糖的熔点以上，得到油相O；

（d）将步骤（b）得到的水相W加入步骤（c）得到油相O中，所述水相W与所述油相O之间的体积比为1:100～1:5，通过乳化法形成油包水乳液；

（e）将步骤（d）得到的油包水乳液置于低温下进一步固化、离心洗涤，得到具有环境响应性的包埋生物分子的所述多糖微球；

所述步骤（a）中，所述温敏性多糖和环境响应材料的水溶液混合液中所述环境响应材料化学键连接法、超分子作用力吸引法以及物理共混法与所述温敏性多糖结合；所述温敏性多糖包括具有不同熔点的天然多糖或改性多糖中的一种或多种；所述天然多糖包括羧化纤维素、琼脂糖、透明质酸、海藻酸、淀粉，所述改性多糖为所述天然多糖经过修饰所得；所述温敏性多糖的熔点在37˚C～100˚C范围内;所述环境响应材料包括光响应材料、电响应材料以及磁响应材料中的一种或多种；

所述步骤（b）中，所述生物分子为水溶性良好的生物分子，包括核酸酶、参与糖类合成和分解的生物酶、参与酶促反应的多肽和蛋白质。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，在所述有机相中加入表面活性剂；所述表面活性剂为乳化剂中的一种或几种，所述乳化剂包括脱水山梨糖醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐单棕榈酸酯，所述表面活性剂与所述有机相的体积比在1:1000～1：1范围内。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，所述乳化法

为手摇法、机械搅拌法、膜乳化法、均质机乳化法或微流控乳化法，并通过控制剪切力的大小获得不同粒径的所述油包水乳液；所述步骤（e）中所述固化的冷却温度在-220˚C～35˚C范围内，所述离心洗涤指用无水乙醇和去离子水反复离心清洗。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的一种多元环境响应性多糖微球，其特征在于，所述多糖微球的结构包括水相和油相，所述油相包裹所述水相；所述水相中有生物分子、温敏性多糖和环境响应材料；所述生物分子水溶性良好；部分所述生物分子包埋在所述温敏性多糖内部，所述温敏性多糖为具有不同熔点的天然多糖或改性多糖中的一种或多种；所述天然多糖包括羧化纤维素、琼脂糖、透明质酸、海藻酸、淀粉，所述改性多糖为所述天然多糖经过修饰所得；所述温敏性多糖的熔点在37˚C～100˚C范围内;所述环境响应材料包括光响应材料、电响应材料以及磁响应材料中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的多元环境响应性多糖微球在酶促连串反应中的应用。

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