CN104583417A - 选择方法及仪器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种方法和仪器，其能够从位于共同的培养空间中的多种异质的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞中选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞。在细胞集落或单一细胞处于共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或单一细胞实施处理，以使具有所需特征的那些细胞的细胞成分的功能获得改变。然后在共同的培养空间中，评估单独的细胞集落或单独的单一细胞的功能改变的标志物。

Description

选择方法及仪器
本申请要求于2012年7月2日提交的欧洲专利申请No.12174574.9的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
存在许多这样的情况，其中需要在具有所需特征的异质群体、细胞集落或单一细胞中进行选择(换句话而言就是挑选)。
一个实例为选择细胞集落或单一细胞，从而形成细胞系以用于基于细胞的报告检验。基于细胞的报告检验可以例如用于筛选用于新药的候选化合物。在此类检验的实例中，表达特定蛋白质的合适的细胞系培养物暴露于候选化合物中，并评估该细胞的指示候选化合物与蛋白质之间的所需相互作用(直接或间接)的标志物。可以通过转染容易培养的细胞以使该细胞表达所关注的转基因或重组多肽或蛋白的功能拷贝，从而生成用于基于细胞的报告检验的细胞系。然而，转染过程导致形成细胞的异质混合物，并且关键的是选择其中转染过程已经产生所需特征的那些细胞。
目前，在转染后，将细胞进行有限稀释，并平板接种于多孔板中，这样从统计学上看，任何孔都不可能包含多于1个细胞。许多孔都不具有细胞。将在孵育过程中形成的克隆细胞集落进行亚培养，以产生多种不同的克隆培养物，每种都具有两个重复。对于每种克隆培养物而言，检测所述重复中一个的所需特征(通常都破坏性的)。这使得克隆培养物(即，未检测的重复)缩减到表现出所需特征的那些。由于这种方法不可避免地需要培养未呈现出所需特征的克隆，所以该方法是低效的。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供了选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的方法，其包括：在共同的培养空间中提供多种培养的细胞集落或培养的单一细胞，其中所述的多种在所需特征方面是异质的；在所述的细胞集落或所述单一细胞处于所述的共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或所述单一细胞进行处理，其中所述的处理引发至少一种所述的细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能发生改变，所述的功能改变指示被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需的特征；在所述的共同的培养空间中，评估各个所述细胞集落或所述单一细胞的功能改变的标志物；选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或所述单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定所预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及提供所选择的至少一种细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。
优选的是，当对经培养的细胞集落实施所述的方法时，所述的集落是克隆的细胞集落，但是所述的方法还可以用于非克隆的细胞集落。
所需的特征可以是特定多肽或蛋白质的功能拷贝的存在情况，优选为转基因或重组的多肽或蛋白质的功能拷贝的存在情况。例如，所述的多肽或蛋白质可以与信号转导途径的一部分相互作用或者形成信号转导途径的一部分。更具体而言，所需的特征可以是选自由以下蛋白组成的组中的蛋白质(优选为转基因或重组蛋白质)的功能拷贝的存在情况：G蛋白偶联受体、离子通道、激酶、磷酸酶、转录因子、细胞骨架蛋白、细胞周期蛋白、蛋白水解蛋白和连接酶。可供选择地，所需的特征可以为功能信号转导途径的存在情况。
在一个优选的实施方案中，所需的特征是细胞受体的功能拷贝的存在情况，所述的处理包括加入与细胞受体相互作用的化学品，并且所述的相互作用直接或间接地引发功能的改变。
所述的方法包括在共同培养空间中提供多种经培养的细胞集落或多种经培养的单一细胞。所述的共同培养空间为单一连续的培养空间。其可以包括不同的相互关联的区域，但是不包括不相连的培养空间，例如多孔板的分开的孔。因此，共同的培养空间可以为例如在单一的常规的皮氏培养皿中的培养空间、单一培养瓶中的培养空间或在多孔培养板的单一孔中的培养空间。细胞集落或单一细胞一起培养于共同的培养空间中，但是通常它们在空间上彼此分开。共同的培养空间通常包含连续体积的生长培养基，其支持所有经培养的细胞集落或所有单一细胞。生长培养基可以为例如液体生长培养基或半固体生长培养基。优选的是，培养基为液体生长培养基，并且细胞集落或单一细胞是附着的。通常，培养基的精确组成并不重要，只要该培养基具有支持细胞所必需的所有成分即可。
优选的是，细胞集落的细胞在培养时发生分裂。但是，这不是必须的，如本文所用，术语“培养”包括细胞保持存活但不分裂的情况。
优选的是，对经培养的细胞集落而非单一的细胞实施所述的方法。细胞集落通常通过以下过程来提供：制备单一细胞的悬浮物，其中所述的细胞就所需的特征而言是异质的；以及将细胞接种于共同的培养空间中，使得细胞基本上在空间上是彼此分开的。然后培养细胞，从而形成空间上分开的细胞培养物，其大部分是克隆的。所述方法优选使用细胞集落，这是因为在选择合适的集落时可以考虑集落的生长速率。
在同一共同的培养空间中，可以为细胞集落与单一细胞的混合物，并对该混合物实施所述的方法。
在不同的细胞集落之间或在不同的单一细胞之间所展现的异质性可以为存在或缺乏所需特征的形式，或者为不同水平或量级的所需特征的形式，在后一种情况中，可以包括特征不明显存在的情况。
所述的方法包括当细胞集落或单一细胞处于共同的培养空间中时，对细胞集落或单一细胞进行处理。在优选的实施方案中，以这样的方式对共同的培养空间进行处理：使所有的细胞集落或所有的单一细胞在相对短的时间(例如10、20或30秒)内经历处理(但是可能以不同的强度或浓度)。在这种情况下，如果观察到指示物衰退，优选在比其后观察到指示物明显衰退的时间更短的时间内对所有的细胞集落或所有的单一细胞进行处理。在其他优选的实施方案中，在不同的时间对各细胞集落或各单一细胞进行处理。例如，如果所述的处理为施加电流或电压，那么其可以通过在不同的时间对各集落或单一细胞施加电流或电压来实现。例如另一个实例，其中所述的处理为施加化学品，可以使该化学品以非活性的形式包含在生长培养基中。随后可以通过施加合适的局部刺激(例如，窄束的光)，使所述的化学品在各细胞集落或单一细胞附近以局部的方式转变成活性形式。
所述的处理可以包括例如向共同的培养空间中加入一种或多种化学品，使得该化学品在共同的培养空间中与细胞集落或单一细胞接触。所加入的化学品在性质上可以是生物化学品，例如生物化学小分子、肽、蛋白质或非肽大分子；或者可选地，所述的化学品可以在性质上是非生物化学品。替代化学处理或者除了化学处理以外，所述处理可以包括非化学干预，这种干预的一个实例是将温度调整至细胞集落或单一细胞暴露于共同的培养空间中的温度。另一种非化学处理是施加电流或电压。处理可以包括2个阶段或更多个阶段，例如在第一阶段中加入第一化学品，在随后的第二阶段中加入第二化学品。
在处理包括暴露于化学品并且细胞集落或单一细胞在液体生长培养基中培养的情况下，可以通过向培养基中加入一定体积的包含化学品的液体(比液体培养基的体积多)而使所有的细胞集落或单一细胞在相对短的时间内暴露于化学品。例如，所加入的液体的体积可以为液体培养基的体积的20％至50％之间，或者如果细胞未发生分离的话，甚至可以加入更多的液体。在其中培养基为半固体培养基的情况下，可以通过将化学品溶液的雾喷在半固体培养基的表面上而使细胞集落或单一细胞在相对短的时间内暴露于化学品。可供选择地，在其中培养基为半固体培养基的情况下，处理化学品可以以非活性的形式包含在培养基中，并通过将合适的活化刺激施加到整个培养基来同时进行活化。
细胞集落或单一细胞所暴露的化学品的浓度不必是均匀的。
除了所述的处理，可以对细胞集落或单一细胞进行其他的干扰。这种干扰的一个实例是在需要其他的干扰以使得能够检测由所述的处理所引发的功能改变的标志物时进行。例如可以首先使经培养的细胞集落或经培养的单一细胞与报告化学品一起孵育，该报告化学品进入集落的细胞或单一细胞中。该干扰后，对共同的培养空间进行处理，并引发具有所需的特征的细胞集落或单一细胞的细胞成分的功能改变。胞内化的报告化学品使得功能改变的标志物(或信号)能够被检测到。一个更具体的实例是，当集落或单一细胞首先与荧光或发光报告化学品一起孵育时，这些荧光或发光报告化学品进入集落的细胞或单一细胞中，从而使得能够测量细胞溶质的钙浓度。然后，对集落或单一细胞进行能够引发细胞成分的功能改变的处理，其导致细胞溶质的钙浓度发生改变。
理想的是，所述的处理和任何其他的干扰都不应该不可逆地改变具有所需特征的细胞集落或单一细胞。优选的是，所述的处理对具有所需特征的细胞集落或单一细胞基本上或完全是无毒的。
所述的处理引发了细胞成分功能的改变。细胞成分功能的改变指示其中功能发生改变的细胞集落或单一细胞具有所需特征。事实上，所需的特征可以是(但不必必须是)存在有功能发生改变的成分。功能的改变可以是例如功能量级的改变、无活性至有活性或者有活性至无活性的改变、或者由一种功能向不同功能的改变。例如，功能改变可以是活性与无活性状态之间的催化功能的改变，或者是催化功能的量级的改变。功能改变的另一个实例是膜通道构型的改变，例如开放和关闭构型之间的改变。功能的改变不必必须涉及细胞成分本身的结构或构型的任何改变。例如功能的改变可以为并非由细胞成分本身的改变所引起，而是由细胞成分由一个亚细胞位置移动至另一个亚细胞位置所引起的无活性至有活性或者有活性至无活性的改变。
所述的成分可以为能够发生指示存在所需特征的功能改变的任何细胞成分。例如，所述的成分可以为酶、细胞受体、膜通道或转录因子。举例说明，所需的特征可以为存在特定的膜受体(例如G蛋白偶联受体(GPCR))，所述的处理可以为加入可以与受体相互作用的化学品(例如配体)，所述的成分可以为由受体控制的信号转导途径(例如磷脂酰肌醇信号途径)的成分(例如磷脂酶C)，所述的功能改变可以为通过化学品与受体相互作用而引发的成分的催化活性的改变。磷脂酶C的活化导致细胞溶质的钙浓度增加，因此在此示例说明中，细胞溶质的钙浓度的改变可以作为细胞功能改变以及(间接地)存在所需特征的标志物。
在可供选择的示例说明中，所需的特征可以为存在特定的转录因子的功能拷贝。细胞成分可以为相同的转录因子。处理可以为加入转录因子的配体。功能改变可以为在转录因子由细胞质迁移至细胞核的过程中所发生的转录因子活性的改变。在此示例说明中，功能改变以及(间接地)存在功能转录因子的标志物可以为转录因子的位置的可检测的改变。
所述的方法包括在共同的培养空间中，评估各细胞集落或单一细胞的功能改变的标志物。所述的评估可以只是涉及确定在所评估的各细胞集落或细胞中是否可以检测到标志物。可选地，评估可以包括估计标志物在所评估的各细胞集落或单一细胞中的量级。在估计标志物的量级(与只是存在或缺乏相对比)的情况中，细胞集落或单一细胞仍可以表现出不可检测的标志物。
可以不必评估所有的细胞集落或单一细胞的标志物。例如，选择细胞集落或单一细胞可以基于2种或更多种不同的所需特征的存在情况。可以的是，由于细胞集落或单一细胞不具有第一所需特征，所以可以排除该细胞集落或单一细胞，在这种情况中，可以不需要评估该集落或细胞的指示存在第二所需特征的标志物。
所述的标志物优选为细胞内标志物。
所述的标志物可以为指示功能的改变并且可以检测到的任何标志物。一种优选的标志物为细胞溶质的钙浓度的改变。另一种优选的标志物为膜电位的改变，其可以通过膜电位染料来检测。第三种优选的标志物为特定酶活性的改变。标志物和细胞成分功能的改变可以为同一件一样的事物。例如，标志物和功能的改变可以为相同细胞酶的活性的相同改变。
在细胞集落或单一细胞处于共同的培养空间时对标志物进行评估。未将共同的培养空间细分成不相连的培养空间(例如环状克隆)。优选的是，当进行评估时，细胞集落或单一细胞仍处于培养基中。
优选的是，使用成像系统来评估标志物。更优选的是，成像系统检测荧光或发光情况，其指示单独的细胞集落或单独的单一细胞中的指示物的存在或量级。在这种情况中，成像系统可以针对单独的细胞集落或单独的单一细胞测量荧光或发光的强度。
在标志物包括细胞溶质的钙浓度的改变，并且使用基于荧光或发光的检测细胞溶质的钙浓度的系统来检测标志物的情况中，优选的是，成像系统至少在实施处理之前的第一时间点以及在细胞溶质的钙浓度发生改变后的第二时间点提供所评估的各单独细胞集落或单一细胞的荧光或发光的强度水平。在多于2个时间点或基本上连续地实时测量强度可能是理想的。
如上所述，优选的标志物为细胞溶质的钙浓度的改变。可以通过例如使用钙配体来评估细胞溶质的钙浓度的改变，其中所述的钙配体在于与钙结合时其荧光性质发生改变。用于检测细胞溶质钙浓度的改变的基于荧光的检测系统的一个实例为FLIPRTM Calcium 5AssayKitTM，可得自Molecular Devices of Sunnyvale,California,USA。此外，还可以通过发光系统(例如使用Aequeorin的那些)来检测细胞溶质的钙水平的改变。
当使用FLIPRTM Calcium 5TM试剂时，其可以与丙磺舒(Probenecid)一起使用。丙磺舒降低了Calcium 5TM试剂从细胞中消逝并增强了细胞内的荧光。
作为使用荧光或发光成像以评估细胞集落或单一细胞的标志物的替代，可以使用拉曼光谱法。拉曼光谱法特别良好地适用于检测特定化学品在显微系统中的存在情况，并且可以用于检测活细胞内的特定化学品。
所述的方法包括选择至少一种但不是全部细胞集落或单一细胞，从而预测所选择的那些具有所需的特征。所述的选择考虑了评估标志物以确定是否各细胞集落或单一细胞可能具有与标志物相关的所需特征。在一些实施方案中，所述的选择考虑了细胞集落或单一细胞所展现的标志物的相对量级；并且这通常意味着选择展现出相对高水平的标志物或水平满足预定标准(例如落入预定的范围内)的集落或细胞。然而，所述的选择可以考虑其他的因素，因此可以不必选择具有所需特征的细胞集落或单一细胞。例如，如果具有所需特征的细胞集落或细胞不具有另一种所需的特征，则可以不选择这种细胞集落或细胞。优选的是，通过处理器来进行选择。事实上，优选的是通过自动操作仪器以自动化的方式来实施所述的方法。
所述的方法还包括提供至少一种所选择的细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。
优选的是，所述的空间位置为参照共同的培养空间或培养容器而指定的位置。在这种方式中，可以移动培养容器，并且通过确定培养容器的位置的改变，可以确定细胞集落或单一细胞的新位置。由于这种方式允许在培养容器被移动后拾取细胞集落或单一细胞，所以这种方式是有用的。
指示空间位置可以采取多种形式。指示所选集落或单一细胞的空间位置的基本方式为，简单地在提供共同的培养空间的培养容器上相邻于该位置进行标记或指示该位置。例如，如果共同的培养空间为皮氏培养皿的培养空间，则可以在培养皿的底面相邻于细胞集落或单一细胞的位置进行标记。标记可以为围绕集落或细胞的圈，或者为跟踪集落边界的圈。进行这样的标记使得可以人工拾取集落或单一细胞。例如，标记可以用于放置环或圆柱体以靠着培养皿的底进行密封并围绕集落或细胞。然后可以在环内使用胰蛋白酶溶液来剥离细胞集落或单一细胞。
如本文所用，术语“拾取”是指以这样的方式从培养空间中取得细胞集落或单一细胞，使得在同一拾取动作中没有取得其他的细胞集落或单一细胞。当拾取细胞集落时，不必取得组成集落的所有细胞。
然而，更优选的是，所选择的细胞集落或单一细胞的空间位置通过生成识别该位置的坐标来指示。坐标可以为与共同的培养空间有关的XY坐标或XYZ坐标。如果以自动化的方式来进行拾取，则这种方式是特别有用的。
优选的是，所述的方法还包括拾取至少一种所选择的细胞集落或单一细胞。
所述的方法可以包括确定单独的细胞集落或单一细胞的各自的边界。例如在细胞集落附着在水平表面上的情况下，所确定的边界可以为集落所覆盖的水平表面区域的周长。确定细胞集落的边界是有用的，因为这样可以估计集落的大小或集落中细胞的数量。这也是有用的，因为这使得可以针对集落的大小或集落中细胞的数量而归一化估测的集落标志物的量级。这还对确定细胞集落或单一细胞的边界从而有利于拾取集落或细胞是有用的。
根据本发明的第二个方面，提供了一种计算机程序，包括用于指导自动操作仪器实施根据本发明第一个方面所述的方法的指令。所述的计算机程序可以提供在计算机可读媒介上。
根据本发明的第三个方面，提供了一种自动操作仪器，包括处理器和储存媒介，所述的储存媒介具有储存于其上的根据本发明第二个方面所述的计算机程序，所述的处理器与所述的储存媒介连接以用于在所述处理器上运行所述计算机程序。
根据本发明的第四个方面，提供了一种用于选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的自动操作仪器，其包括：成像站，其中可以设置有培养容器；成像系统，适用于生成覆盖视野的至少一个图像，所述的视野包括容纳在置于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞；处理装置，被编程为分析至少一个图像，从而评估所述视野中所包括的各细胞集落或单一细胞的指示细胞成分的功能改变的标志物，所述功能改变指示所需特征的存在情况；所述的处理装置被编程为选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及所述的处理装置被编程为提取对至少一种所选择的细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。
优选的是，所述自动操作仪器包括用于将流体分配至位于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的自动操作分配器，该自动操作分配器由所述的处理装置控制。在这种情况中，所述的自动操作仪器的处理装置优选被编程为按照以下顺序实施各步骤：
操纵所述成像系统，以取得位于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的包含多种细胞集落或单一细胞的视野的第一图像；
操纵所述的自动操作分配器，以将包含一种或多种处理化学品的流体处理剂分配至所述培养容器的共同培养空间中；
操纵所述的成像系统，以取得位于所述成像站的所述培养容器的共同培养空间中的包含多种细胞集落或单一细胞的视野的第二图像。
当所述的处理装置被编程为实施这些步骤时，所述处理装置对标志物所进行的分析包括比较所述的第一图像和第二图像以确定两个图像之间对应于各个所述细胞集落或单一细胞的改变。
本发明的第四个方面的自动操作仪器优选包括用于检测视野中细胞集落或单一细胞所发出的荧光或发光的检测器。该检测器优选地包括sCMOS图像传感器。优选的是，所述的检测器包括感应面积为至少100mm2的图像传感器。
本发明的第四个方面的自动操作仪器优选包括用于拾取单独的细胞集落或单独的单一细胞的自动操作细胞拾取器。该自动操作细胞拾取器优选地受到处理装置的控制。在这种情况下，所述的处理装置程被编程为操纵所述的自动操作细胞拾取器来拾取所述处理装置所选择的并且已经提取其空间位置的指示的细胞集落或单一细胞。
优选的是，本发明的第四个方面的自动操作仪器包括其中在共同的培养空间中具有多种经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的培养容器，其中所述的多种在所需特征方面是异质的，所述共同的培养空间包含至少一种处理化学品，其用于引发至少一种所述细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能改变，所述的功能改变指示其中被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需特征。
根据本发明的第五个方面，提供了一种选择具有所需特征的培养的细胞集落或经培养的单一细胞的方法，其包括：在共同的培养空间中提供多种经培养的细胞集落或经培养的单一细胞，其中所述的多种在所需特征方面是异质的；在所述的细胞集落或所述单一细胞处于所述的共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或所述单一细胞进行处理，其中所述的处理引发至少一种所述的细胞集落或所述单一细胞的细胞溶质钙浓度的改变，所述的细胞溶质钙浓度的改变指示被引发细胞溶质钙浓度改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需的特征；在细胞集落或单一细胞处于共同的培养空间中时，检测至少一种所述细胞集落或单一细胞中的细胞溶质钙浓度的改变；以及提供至少一种其中被检测出细胞溶质钙浓度改变的细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。优选的是，使用从细胞内的位置所发出的荧光或发光来检测细胞溶质钙浓度的改变。
对于本发明的所有方面而言，本发明的第五个方面的经培养的细胞集落优选为克隆的细胞集落。
在内容所允许的情况下，在上文的本发明的第一个方面中所给出的优选的特征和说明还适用于本发明的第五个方面。
本发明优选实施方案的详细描述
下文参照示意性附图，以举例的方式更详细地描述本发明的实施方案，其中：
图1为自动操作仪器的透视图；
图2示出图1的自动操作仪器的成像系统；
图3A和3B为使用图2的成像系统所获得的细胞集落的白光图像；
图4为图1的自动操作仪器的细胞拾取头的透视图；
图5示出在使用FLIPRTM Calcium 5TM试剂处理和未处理的2个不同的时间点，表达AT1的CHO K1细胞集落的白光图像；
图6为示出FLIPRTM Calcium 5TM试剂对表达AT1的CHO K1细胞的细胞生长的影响的图；
图7A和7B示出在处理前和处理后的细胞集落的荧光图像；
图8为示出荧光强度随时间变化的图；以及
图9示出处理前和处理后的细胞的荧光图像。
图1示出其外壳被除去从而显露出内部构件的自动操作仪器10。自动操作仪器10的各构件的操作由计算机12(其在图2中示出)控制，如下文所述。
自动操作仪器10具有主平台14，在该主平台上对包含经培养的细胞的培养板进行操作。如图2最清晰可见，主平台14提供有光圈16。透明的玻璃板18位于光圈16之上。透明玻璃板18的上表面形成了成像站20，其中可以放置培养板从而可以使培养在培养板中的细胞可视化，如下文所述。
此外，成像站20还包括定位向导件(未示出)，其将标准构造的培养板保持在精确的位置。
如图1所示，自动操作仪器10包括成像系统22，其位于主平台14的下方，更具体而言，位于光圈16的下方。成像系统22安装(下文将更详细地描述)在光学平台24上，其也相对主平台14而牢固地安装。
现在参见图2，成像系统22包括第一光源26、第二光源28以及照相机30，以用于获得位于成像站20中的培养板中的细胞的图像。非常概括而言，第一光源26与照相机30一起使用以采用暗视野构造而获得细胞的白光图像。这可以用于确定细胞集落和细胞的位置、确定细胞集落的边界、以及通过拍摄连续图像而用于确定集落生长的速率。此外，概括而言，第二光源28与照相机30一起使用以获得由细胞发出的荧光或发光的图像。现在将更详细地描述成像系统22及其用途。
第一光源26包括多个白光发光二极管(LED)32。白光LED 32被安装在具有中心光圈36的安装环34上。LED 32的光轴位于普通虚共有假象锥(未示出)的表面上，从而使得LED 32所发出的各光束汇集于假象锥顶端的汇聚点38处。在图2中，斜箭头40示出从2个LED 32到汇聚点38的光路。
为了说明的目的，图2示出了置于成像站20上的六孔培养板42。然而，应当理解还可以使用不同类型的培养容器。六孔培养板42的每个孔通过数字44来识别，并且直接位于成像系统22的上方。孔44具有水平培养表面46，其上生长有许多粘附的细胞集落48。在孔44中提供有液体生长培养基(未示出)，其覆盖细胞集落48。
由LED 32发出的光束的汇聚点38稍高于培养表面46和细胞集落48。
提供给LED 32的电源由计算机12控制，控制线50示意性示出。因此，LED 32的照明由计算机12控制。
此外，成像系统22还包括半镀银的镜子52，该镜子与水平成45°角并位于安装环34的中心光圈36的下方。按照已知的方式，大部分的光垂直向下移动，如向下箭头54所示，在不具有任何方向改变的条件下直接通过半镀银的镜子52。另一方面，大部分的光以水平箭头56所示的方向水平移向半镀银镜子52的倾斜上表面，被半镀银镜子52垂直向上反射，并且入射角与反射角均成45°。
此外，成像系统22还包括自动对光变焦透镜58。发现特别适用的一种市售可得的变焦透镜为Leica McaroFluo Z6APOA变焦透镜，但是还可以使用其他的透镜。变焦透镜58接受通过半镀银镜子52后以向下箭头54的方向垂直向下通过的光。变焦透镜58集中光以被照相机30接受。变焦透镜58的焦距可以改变，这由计算机12控制，如控制线60示意性示出的那样。变焦透镜58的光轴与汇聚点38对齐。
照相机30接受变焦透镜58集中的光。照相机通过光产生图像并将图像通过控制线62传输至计算机12。
照相机30能够由较低强度的光产生图像，例如置于成像站20上的培养板上的细胞中所发出的荧光或发光。优选的是，照相机30还能够在由所述低强度光源产生图像的同时覆盖培养板42(其置于成像站30上)的培养表面46的较大的视野。优选的是，照相机30产生的图像覆盖了许多附着在培养表面46上的分开的细胞集落48(或单一细胞)。
发现特别适合的一种市售可得的照相机为Hamamatsu ORCAFlash 4.0。这种照相机使用了提供较高的感光度的sCMOS图像传感器。此外，用于Hamamatsu照相机中的sCMOS图像传感器的感应面积的尺寸较大(13.312mm x 13.312mm)，这允许照相机30获得覆盖较大视野的图像。Hamamatsu照相机的其他优点在于其具有相对大量的像素(2048x 2048)。在必要时，相对大量的像素可以具有较高的分辨率。可选地，当感光度比分辨率更重要时，可以传入由大量相邻的像素得到的信号以增加感光度。
此外，还评价了以下照相机并发现它们是合适的：Apogee ALTAU260；Andor Neo-sCMOS；和Andor Neo-sCMOS oem。这些照相机的图像传感器的感应面积的尺寸分别为：10.2mm x 10.2mm；16.6mmx 14mm；和16.6mm x 14mm。通过这些研究得结论，感应面积为100mm2或更大的照相机是优选的。
此外，还可以使用具有除sCMOS图像传感器以外的图像传感器的照相机。例如可以使用具有传统的CMOS或CCD图像传感器的照相机，但是所得的结果可能不会特别好。
成像系统22包括第一滤波器64。该滤波器的最大带通为516nm。第一滤波器64可以由合适的动力(未示出)在计算机12的控制下被移出变焦透镜58与照相机30之间的光路。第一滤波器64用于下文所述的目的。
如图2所示，第二光源28置于与半镀银镜子52相同的水平位置，并沿着水平箭头56的方向使光通向半镀银镜子52的倾斜上表面。第二光源28的照明由计算机12通过控制线68控制。
发现适用于第二光源28的一种市售可得的光源为Sola 6-LCRSA白光源，但是可以使用其他市售可得的光源。
最大带通为495nm的第二滤波器70置于第二光源28与半镀银镜子52之间。
现在将描述成像系统22的操作。
如上文所述，第一光源26(LED 32)与照相机30联合使用以得到在培养板42(位于成像站20上)的培养表面46上生长的细胞和/或细胞集落48的白光图像。由LED 32得到的白光向上通过主平台14的光圈16、通过玻璃板18、通过培养板42的底壁，指向汇聚点38。由细胞集落48和/或单一细胞向下散射的光向下返回通过培养板42、通过玻璃板18、通过光圈16、通过中心光圈36，指向半镀银镜子52，在此，大部分的散射光直线通过半镀银镜子52，到达自动对光变焦透镜58。变焦透镜58集中光，从而允许照相机30产生培养表面46上的细胞集落48和/或单一细胞的图像。
在使用第一光源26和照相机30按照所述的这种方式获得图像时，第一滤波器64从光路上移除，其不起作用。
将照相机30生成的图像传输至计算机12中用于分析。
图3A和3B为按照这种方式获得的细胞集落48的白光图像。图3A为原始图像，图3B示出在使用已知的电子方差滤波器来增加细胞集落48与背景之间的对比之后的相同的图像。
第二光源28可以与照相机30组合使用以获得培养板42上的细胞集落48或单一细胞的荧光图像。根据具体的荧光体系来选择第一滤波器64和第二滤波器70。在该具体的实例中，选择第一滤波器64和第二滤波器70以与上文讨论的FLIPRTM Calcium 5TM荧光试剂一起使用。该试剂用于指示细胞溶质钙浓度。该试剂渗透至细胞中并与细胞溶质钙结合。当使用该试剂时，钙与该试剂的结合会增加试剂的荧光反应，因此增加的细胞溶质钙水平会导致细胞内荧光的增强。如上文所讨论，第二滤波器70的最大带通为495nm，这为Calcium 5TM试剂的最大激发。第一滤波器64的最大带通516nm相当于Calcium5TM试剂的最大荧光发射。显然，当使用其他荧光体系时，可以用具有不同最大带通的适合所研究的荧光体系的其他滤波器替换上文所述的第一滤波器64和第二滤波器70。第一滤波器64和第二滤波器70可以由滤波器轮承载，从而用于在计算机12的控制下更换滤波器。
在操作中，由第二光源28得到的白光被第二滤波器70过滤，使得最大波长为495nm的光被半镀银镜子52向上反射。反射光通过中心光圈36、光圈16、玻璃板18以及培养板42的底部，到达培养板42中的细胞集落48或细胞。此光激发了细胞集落48的细胞内(或单一细胞内)的Calcium 5TM试剂。细胞内Calcium 5TM试剂的发射光向下返回通过培养板42的底部、透明玻璃板18、光圈16、中心光圈36，到达半镀银镜子52。大部分的此发射光直线通过半镀银镜子52，进入变焦透镜58，该变焦透镜58将光集中到照相机30上。在这种情况中，第一滤波器64位于光路中，并在发射光通过变焦透镜58与照相机30之间时过滤发射光。由照相机30获得的荧光图像被传输至计算机12以用于分析。
当使用了第一光源26的成像系统22用于获得细胞集落或单一细胞的白光图像时，或者当使用了第二光源28的成像系统用于获得荧光图像时，可以通过计算机12来操纵自动对光变焦透镜58，从而放大至特定的细胞集落48或特定的单一细胞。这在例如需要确定发射荧光的细胞内的位置时是有用的。
可以通过光学运送器72(参见图1)将成像系统22安装在光学平台24上，其中所述的光学运送器72允许整个成像系统22以任何水平方向移动。光学运送器72与计算机12连接，使得成像系统22的移动受计算机12的控制。成像系统22以这种方式的移动使得成像系统22能够获得培养板42(位于成像站20上)的其他区域(视野)的图像。
光学运送器72的位置通过处理器而与x、y、z坐标系统关联，该坐标系统是自动操作仪器10的多个自动操作部件所共用的。
如上文所述，培养板42通过已知精确位置处的定位向导(未示出)而保持在成像站20上。该位置的x、y、z坐标(使用了共用的x、y、z坐标系统)储存在计算机12中。因此，当通过成像系统22使细胞集落48或单一细胞成像时，计算机12可以使用图像中集落或细胞的位置，当拍摄图像时，计算机12可以使用光学运送器72的位置，以及可以使用成像站20上的培养板42的已知几何形状和培养板42的已知位置，从而计算培养板42上细胞集落或单一细胞的位置。由于这种方式允许培养板42被移动至另一个已知的位置，所以其是有用的，并且只要培养板42在新位置处的取向是已知的，则可以使用共用的x、y、z坐标系统来确定细胞集落或单一细胞的精确位置。如果例如如下文所述，需要在成像站20不同的位置处从培养板42拾取细胞，上述方式可以是有用的。
再参见图1，自动操作仪器10还具有位于主平台14上方的细胞拾取头74。细胞拾取头74与EP1686380中所述的用于ClonePixTM2自动操作仪器(得自Molecular Devices,New Milton,英国)的已知的细胞拾取头相似。
如EP1686380中所述，细胞拾取头74通过头定位运送器76而在主平台14上是可移动的，所述的头定位运送器76由x、y和z线性位置调节器构成，该线性位置调节器串联连接并悬挂在构台78上。头定位运送器76由计算机12控制以在主平台14上方移动细胞拾取头。处理器12使细胞拾取头74的位置与共用的x、y、z坐标系统关联。
细胞拾取头74为常规设计并示于图4中。如图4所示，细胞拾取头74具有8个中空拾取针80,81,82,83,84,85,86,87。各中空拾取针80,81,82,83,84,85,86,87的内部开放空间与相应的控制口88,89,90,91,92,93,94,95是流体联通的。各控制口88至95通过各控制管(未示出)与各控制泵(未示出)连接。
在常规的方式中，8个拾取针80-87的每一个都可以独立地操作，从而通过操作与各拾取针相关的使拾取针吸取细胞集落或单一细胞的控制泵而从培养板42上拾取细胞集落或单一细胞。细胞集落或细胞可以附着或悬浮于半固体培养基中。
然而，8个中空拾取针80-87的每一个还具有二级功能，即，将液体分配至培养板中。8个中空拾取针80-87的每一个都通过其各自的控制管和各自的控制泵而与各自的贮液器相连。得自这些贮液器的每一个中的液体都可以被泵入相应的拾取针中以用于分配。每个拾取针80-87都可以独立于其他拾取针来分配液体。
中空拾取针80-87拾取细胞集落和单一细胞的操作以及拾取针80-87分配液体的操作都受计算机12的控制。
自动操作仪器10还包括许多本领域已知的且与本发明并非特别相关的其他的自动操作特征。例如，自动操作仪器10包括用于堆叠和保存培养板以及用于在所需的温度下孵育所保存的培养板的装置。自动操作仪器10还包括用于清洗中空拾取针80、81、82、83、84、85、86、87的洗涤站。此外，自动操作仪器10包括用于将细胞重新接种于新的平板上以及用于更换培养板上的培养基的装置。此外，还提供了用于围绕自动操作仪器的小室来移动培养板的运输装置。
提供以下实例来说明上文所述的自动操作仪器10可以如何用于选择以及可任选地拾取具有所需特征的经培养的克隆细胞集落或经培养的单一细胞。
实施例1
以下实施例利用了荧光Calcium 5TM试剂，从而允许使用荧光成像来评估细胞溶质的钙水平。本实施例的目的是简单地证明Calcium5TM试剂对以下实施例中使用的细胞不具有明显的毒性。
本实施例利用了经培养的表达1型血管紧张素II(AT1)受体的中国仓鼠卵巢细胞KI(CHO-KI)。AT1受体为G蛋白偶联受体(GPCR)。其与配体血管紧张素II结合。活化的AT1受体与Gq/11结合，转而活化磷脂酶C，再转而增加细胞溶质的钙浓度。
将液体培养基中的表达AT1的CHO-KI细胞的悬浮物平板接种于标准六孔培养板的6个孔中。孵育培养板直至细胞形成小的分散的集落。接着，将Calcium 5TM试剂在相同的液体培养基中的溶液加入6个孔中的3个孔中。将体积相当的液体培养基加入到其他的3个孔中。在其中加入Calcium 5TM试剂的那些孔中，Calcium 5TM试剂的浓度为制造商建议的浓度。然后，将细胞与该试剂在37℃下孵育1小时。孵育后，将细胞再孵育1小时，这次是在室温下。该第二次孵育的目的是模拟细胞在自动操作仪器10中被成像并拾取时的环境条件。在第二次孵育后，由所有6个孔中除去液体培养基，并替换为新鲜的液体培养基。最终，将培养板返回至37℃，并让细胞生长7天。
在7天的孵育过程中，使用CloneSelectTMImager(得自MolecularDevices(New Milton)Ltd)周期性地监测6个孔中的细胞的生长。同样，可以使用上文所述的自动操作仪器10的成像系统22监测细胞的生长。在后一种情况下，第一光源26和照相机30用于产生细胞的白光图像，并通过计算机12来分析这些图像，从而测定培养表面46被细胞覆盖的百分率。
孵育第0天和第7天时取得的图像示于图5中。在图5中，上方2个图像代表分别在第0天和第7天时在未使用Calcium 5TM试剂处理的孔中，细胞的覆盖情况。下方2个图像代表分别在第0天和第7天时在使用Calcium 5TM试剂处理的孔中，细胞的覆盖情况。如所示，在未经处理的孔中和经处理的孔中，细胞生长情况相似。
图6以图表的方式示出了实验结果，其中在y轴上显示未处理的细胞和经过Calcium 5TM试剂处理的细胞的平均生长速率。未观察到显著性差异。
这表明使用Calcium 5TM试剂处理细胞未导致明显的生长抑制。
实施例2
本实施例证明，自动操作仪器10的成像系统22足够敏感地通过Calcium 5TM试剂来检测细胞内所发出的荧光，从而允许检测细胞溶质钙浓度的增加。
本实施例利用了表达AT1受体的CHO-K1细胞以及不表达该受体的CHO-K1细胞。
平板接种表达AT1的CHO-K1细胞和不表达AT1的CHO-K1细胞，并使这些细胞在分开的培养板(其使用了合适的市售可得的液体培养基)中生长。孵育所述培养板直至观察到细胞形成小的分散的附着集落，并对各培养板实施以下步骤从而对表达AT1的细胞和不表达AT1的细胞进行一致的处理。
首先，如上述实施例1中所述，在37℃下使合适的培养板与Calcium 5TM试剂孵育1小时，从而向细胞集落加载Calcium 5TM试剂。Calcium 5TM试剂进入到经培养的细胞中。
在成像站20中对所处理的培养板实施以下步骤。
在加载Calcium 5TM试剂后，使用第一光源26和照相机30使细胞集落成像从而产生白光图像，该图像被传输至计算机12以用于分析。在分析过程中，计算机12确定成像的集落在培养板中的位置以及集落的边界。
在白光成像后，使用第二光源28和照相机30使培养板上的细胞集落成像。这些图像被传输至计算机12并储存。此阶段取得的图像显示细胞集落中的细胞内定位的Calcium 5TM试剂所发出的荧光的基线水平。
然后，计算机12操纵头定位运送器76，从而使第5个中空拾取针84定位于培养板(其事先被移去盖子)的上方。中空拾取针84通过相应的控制管和相应的控制泵连接至贮液器，该贮液器包含血管紧张素II在培养基中的溶液。然后，计算机12操纵控制泵以使中空拾取针84将血管紧张素II溶液分配到培养板中。所分配的溶液的体积大约为分配前培养板中培养基的体积的四分之一。分配相对大体积的溶液(例如培养板中培养基体积的1/4)使得血管紧张素II在大约相同的时间达到培养板中的所有的细胞集落。血管紧张素II的浓度在培养板的不同区域发生变化是可以接受的。
在分配血管紧张素II溶液之后，立即操作成像系统22以获得培养板的连续的荧光图像，其中所述培养板显示出所成像的细胞集落48中的细胞内Calcium 5TM试剂所发出的荧光。这涉及使用第二光源28和第二滤波器70来照明集落，以及使用照相机30和第一滤波器64来检测发出的光，并且按照上文所述操作成像系统22。
培养板中血管紧张素II的最终平均浓度为10.5mM。
在本实验中获得的荧光图像的细节示于图7A和7B中。图7A的2个图像显示未表达AT1受体的CHO-K1细胞的结果。图7A的2个图像的每一个都覆盖了相同的细胞集落。图7B的2个图像显示表达AT1的CHO-K1细胞的结果。首先参见图7B，左手边的图像为加入血管紧张素II之前拍摄的覆盖一个细胞集落的基线荧光图像。在该图像中明显具有相对少量的细胞内荧光。图7B右手边的图像为覆盖了左手边图像所覆盖的相同克隆的细胞集落并在加入血管紧张素II后大约16秒时拍摄的荧光图像。右手边图像显示出大量的光点。每个光点代表细胞集落中的独立的细胞中的Calcium 5TM试剂所发出的荧光。荧光水平明显高于左手边的基线图像。因此，血管紧张素II在表达AT1的CHO-K1细胞中引发了细胞溶质钙浓度的增加，并且这可以使用Calcium 5TM试剂和自动操作仪器10的成像系统22容易地检测到。
现在参见图7A，左手边的图像为加入血管紧张素II之前的基线图像，右手边图像为加入血管紧张素II之后大约16秒时拍摄的图像。事实上，这些图像与所预测的是一致的。在缺乏AT1受体的情况下，加入血管紧张素II不会导致细胞溶质钙浓度的升高。
图8示出通过对由成像系统22得到的图像进行分析，计算机12对表达AT1的细胞的四个随机选择的细胞集落测定的荧光强度水平。在图8中，图表上的每个点都代表对成像系统22所获得的单一荧光图像的单个细胞集落所测定的荧光强度水平。t＝0时的荧光水平为基线图像中的荧光水平。在加入血管紧张素II后，每8秒取得图像，并且图表显示由连续图像中的每一个所获得的、4个集落中的每一个的相对荧光强度。如图8可见，在加入血管紧张素II后大约16秒时，细胞内荧光达到最高峰，然后在随后140秒内较稳定地降低。
实施例3
在实施例2中，通过将荧光图像与白光图像做比较，显而易见的是所有或基本上所有表达AT1的细胞集落在添加血管紧张素II后都显示出细胞内的荧光增强。由于在实施例2中使用的表达AT1的CHO-K1细胞来自稳定表达AT1的细胞系，所以上述情况是可预测的。
然而，应该理解的是可以对细胞集落(或单一细胞)的异质混合物实施相同的方法，并且该方法可以用于从混合物中选择具有所需特征的细胞集落(或单一细胞)。
以下是如何实施上述方法的实例。
使用被设计为可以表达AT1的基因构建体来转染不表达AT1受体的细胞系。如所公知的那样，转染过程是低效的。转染后，许多细胞根本不表达AT1，并且对于表达AT1的那些细胞而言，表达程度变化较大。
平板接种并孵育经转染细胞的悬浮物，从而形成分散的细胞集落。在平板接种前，将细胞悬浮物充分稀释，以确保即使不是全部也是大部分在平板上生长的集落衍生自单一细胞，从而是克隆的。对包含克隆细胞集落的培养板实施实施例2中所用的相同的方法。
在该过程中，将在加入血管紧张素II溶液后由各克隆集落得到的相对荧光强度与加入血管紧张素II前由同一克隆集落获得的相对荧光强度(即，基线水平)相比较。细胞内荧光的增强表明细胞溶质钙浓度增加，进而其为表达功能性AT1受体的标志物。
由计算机12选择被证明在加入血管紧张素II后细胞内荧光增强的那些克隆细胞集落，并且计算机12利用白光成像确定这些集落在培养板上的位置。
了解了表现出细胞内荧光增强的细胞集落的位置，可以使用细胞拾取头74在计算机12的控制下拾取那些集落，并可以对各拾取的集落中的细胞进行亚培养并进行进一步的分析，以确定所述的克隆是否表现出所需的AT1受体的表达。
未证明细胞内荧光增强的集落不被拾取，并且不进行进一步的检测。这节省了在分析不合适的克隆中可能花费的大量时间和资源。
实施例4
本实施例利用了由表达AT1的CHO-K1细胞的单一集落所衍生的细胞，其中所述的集落是在实施例2的程序之后由细胞拾取头74拾取的。使得自所拾取的集落的细胞悬浮，并平板接种于具有培养基的新培养板中。然后对新接种的细胞重复实施例2的过程。在实施例4过程中取得的图像示于图9中。在图9中，上方的图像为在加入血管紧张素II之前获得的荧光基线图像。下方的图像为在加入血管紧张素II之后大约20秒时获得的荧光图像。如所示，下方图像中的荧光水平明显高于上方图像的荧光水平。
本实施例证明可以将细胞暴露于Calcium 5TM试剂，使用血管紧张素II刺激它们，并拾取它们，并且这些细胞仍对血管紧张素II有反应，而且还证明在再次接种后细胞内荧光增强。
实施例5
使用上文所述类型的任意成像系统，都要在对源自各集落或细胞的荧光的感光度与视野之间进行权衡。视野可以随着对各集落或细胞的感光度的降低而增大(例如缩小)，相反，感光度可以随着视野的减小而增大(例如放大)。如果为了获得所需的感光度，视野不必覆盖培养板的整个培养表面，光学运送器72可以移动成像系统22，使得可以通过在光学运送器72的不同位置处取得一系列图像而使得整个培养表面46成像。
在上述使用自动操作仪器10进行的实验中，使用以3x3矩阵排列的9个独立的叠加图像使标准六孔培养板的单个孔44成像。发现可以在13秒的总时间内生成9个叠加图像，其中所述总时间包括每个图像的曝光时间为200ms、将图像下载至计算机12所用的时间、以及光学运送器72移至所需位置所用的时间。

Claims (16)

1.一种选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的方法，包括：
在共同的培养空间中提供多种经培养的细胞集落或经培养的单一细胞，其中所述的多种在所需特征方面是异质的；
在所述的细胞集落或所述单一细胞处于所述的共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或所述单一细胞进行处理，其中所述的处理引发至少一种所述的细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能发生改变，所述的功能改变指示被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需的特征；
在所述的共同的培养空间中，评估各个所述细胞集落或所述单一细胞的功能改变的标志物；
选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或所述单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定所预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及
提供所选择的至少一种细胞集落或至少一种单一细胞的空间位置的指示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的标志物为细胞内的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的标志物为细胞溶质钙浓度的改变。
4.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述的评估包括测定荧光或发光。
5.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其还包括从所述的共同的培养空间中拾取所述或一种所选择的细胞集落或单一细胞；以及培养所拾取的细胞集落或单一细胞。
6.一种计算机程序，包括用于指导自动操作仪器实施根据前述任意一项权利要求所述的方法的指令。
7.一种计算机可读媒介，其具有储存于其上的根据权利要求6所述的计算机程序。
8.一种自动操作仪器，包括处理器和储存媒介，所述的储存媒介具有储存于其上的根据权利要求6所述的计算机程序，所述的处理器与所述的储存媒介连接以用于在所述处理器上运行所述计算机程序。
9.一种用于选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的自动操作仪器，包括：
成像站，其中可以设置有培养容器；
成像系统，适用于生成覆盖视野的至少一个图像，所述的视野包括容纳在置于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞；
处理装置，被编程为分析至少一个图像，从而评估所述视野中所包括的各细胞集落或单一细胞的指示细胞成分的功能改变的标志物，所述功能改变指示所需特征的存在情况；
所述的处理装置被编程为选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定所预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及
所述的处理装置被编程为提取对至少一种所选择的细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。
10.根据权利要求9所述的自动操作仪器，其包括用于将流体分配至位于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的自动操作分配器，该自动操作分配器由所述的处理装置控制。
11.根据权利要求10所述的自动操作仪器，其中所述的处理装置被编程为按照以下顺序实施各步骤：
i)操纵所述成像系统，以取得包含位于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞的视野的第一图像；
ii)操纵所述的自动操作分配器，以将包含一种或多种处理化学品的流体处理剂分配至所述培养容器的共同培养空间中；
iii)操纵所述的成像系统，以取得包含位于所述成像站的所述培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞的视野的第二图像；
并且其中所述处理装置被编程以实施的所述分析包括，比较所述的第一图像和第二图像以确定它们之间对应于各个所述细胞集落或单一细胞的改变。
12.根据权利要求9至11中任意一项所述的自动操作仪器，其中所述的成像系统包括用于检测视野中的由细胞集落或单一细胞所发出的荧光或发光的检测器。
13.根据权利要求12所述的自动操作仪器，其中所述的检测器包括sCMOS图像传感器。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的自动操作仪器，其中所述的检测器包括感应面积为至少100mm2的图像传感器。
15.根据权利要求9至14中任意一项所述的自动操作仪器，其包括用于拾取单独的细胞集落或单独的单一细胞的自动操作细胞拾取器，所述的自动操作细胞拾取器由所述的处理装置控制，所述的处理装置被编程为操纵所述的自动操作细胞拾取器来拾取所述处理装置选择的并且已经提取其空间位置的指示的细胞集落或单一细胞。
16.根据权利要求9至15中任意一项所述的自动操作仪器，还包括其中在共同的培养空间中具有多种经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的培养容器，其中所述的多种在所需特征方面是异质的，所述共同的培养空间包含至少一种处理化学品，其用于引发至少一种所述细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能改变，所述的功能改变指示其中被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需特征。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018011422A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Danmarks Tekniske Universitet Plating cells and corresponding picking colonies
CA3120281A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Amgen Inc. Systems and methods for facilitating clone selection
ES2784462A1 (es) 2020-02-28 2020-09-25 Sener Aeroespacial Sau Sistema de control del desarrollo de un cultivo en un medio solido en una incubadora robotizada
EP4366873A1 (en) * 2021-07-08 2024-05-15 Ourotech, Inc. Treatment efficacy prediction systems and methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003067904A2 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 University Of North Carolina At Chapel Hill High-throughput cell identification and isolation method and apparatus
EP2151689A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-10 Genetix Limited Cell detection

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998045704A2 (en) * 1997-04-07 1998-10-15 Bioimage A/S A method for extracting quantitative information relating to an influence on a cellular response
US20070196815A1 (en) * 2000-08-02 2007-08-23 Jason Lappe Positive Selection Procedure for Optically Directed Selection of Cells
US7442512B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
US7776584B2 (en) * 2003-08-01 2010-08-17 Genetix Limited Animal cell colony picking apparatus and method
US7310147B2 (en) * 2005-01-27 2007-12-18 Genetix Limited Robotic apparatus for picking of cells and other applications with integrated spectroscopic capability
US7718131B2 (en) * 2005-07-06 2010-05-18 Genetix Limited Methods and apparatus for imaging and processing of samples in biological sample containers
JP4482693B2 (ja) * 2005-08-29 2010-06-16 国立大学法人 岡山大学 抗体産生細胞の特異的選択方法
US7535556B2 (en) * 2007-05-31 2009-05-19 Genetix Limited Methods and apparatus for optical analysis of samples in biological sample containers
US20110281743A1 (en) * 2008-12-10 2011-11-17 Nancy Allbritton Systems and methods for isolating cells in cell colonies in culture

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003067904A2 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 University Of North Carolina At Chapel Hill High-throughput cell identification and isolation method and apparatus
EP2151689A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-10 Genetix Limited Cell detection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TEKKUMKARA T J等: "Stable expression of a functional rat angiotensin II (AT1A) receptor in CHO-K1 cells:Rapid desensitization by angiotensin II", 《MOLECULAR AND CELLULAR BIOCHEMISTRY》 *

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