CN104560997A - 抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用 - Google Patents
抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104560997A CN104560997A CN201410827675.3A CN201410827675A CN104560997A CN 104560997 A CN104560997 A CN 104560997A CN 201410827675 A CN201410827675 A CN 201410827675A CN 104560997 A CN104560997 A CN 104560997A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- single strand
- double
- rna single
- sirna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 281
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 46
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 title abstract description 10
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 title abstract description 10
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 title abstract description 8
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 title abstract description 8
- 101800000620 Disintegrin-like Proteins 0.000 title abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims abstract description 27
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 173
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 49
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 42
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 39
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 37
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 22
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 15
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 15
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 13
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical compound OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 8
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 8
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 claims description 3
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 53
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 5
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 49
- 108091005663 ADAMTS5 Proteins 0.000 description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 description 38
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 34
- CVYPRDPBCXSVBN-WDZFZDKYSA-N (5z)-5-[[5-[(4-chlorophenyl)methylsulfanyl]-1-methyl-3-(trifluoromethyl)pyrazol-4-yl]methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1CSC=1N(C)N=C(C(F)(F)F)C=1\C=C1/SC(=S)NC1=O CVYPRDPBCXSVBN-WDZFZDKYSA-N 0.000 description 30
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 29
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 26
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 24
- 102000051389 ADAMTS5 Human genes 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 101150056050 ADAM17 gene Proteins 0.000 description 22
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 15
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 14
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 14
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 10
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 10
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 102100036601 Aggrecan core protein Human genes 0.000 description 7
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 7
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 7
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 6
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 6
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 5
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 5
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 5
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000029791 ADAM Human genes 0.000 description 3
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 3
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 3
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 3
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 108010003059 aggrecanase Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 102000029750 ADAMTS Human genes 0.000 description 2
- 108091022879 ADAMTS Proteins 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 206010039361 Sacroiliitis Diseases 0.000 description 2
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 101150103009 gene 17 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000281 joint capsule Anatomy 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- -1 methoxyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000006807 siRNA silencing Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 101000835893 Homo sapiens Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000659879 Homo sapiens Thrombospondin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108010047320 Pepsinogen A Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000000491 Tendinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010043255 Tendonitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000007474 aortic aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000024835 cytogamy Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000004415 tendinitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 108010088577 zinc-binding protein Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抑制ADAMTS-5基因和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用。本发明公开一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种。本发明公开的siRNA组合物可以作为关节炎及相关炎症的治疗药物，可通过骨关节腔局部注射siRNA组合物及其制剂抑制炎症因子表达实现对关节炎症的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制ADAMTS-5基因和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种严重危害人类健康，目前尚缺乏有效治疗手段的慢性退行性骨关节病变，迫切需要研究出能有效防治骨关节炎的新方法。骨关节炎临床病理特征之一是软骨破坏和hFLS细胞外基质降解，而软骨的破坏最终都来源于胞外基质的蛋白水解。因此多种蛋白水解酶活性增高引起继发性软骨外基质(extracellular matrix,ECM)的降解异常是软骨退变的直接原因，最终导致覆盖关节骨表面的软骨破坏。白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)都有促进hFLS细胞分解代谢及降解细胞外基质的作用，有研究表明在关节炎患者的关节液中发现高浓度的IL-1和TNF-α,它们被认为是在关节炎发病机制中起关键作用的促炎细胞因子。
含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族(a disintegrin-likeand metalloproteinase with thrombospondin type 1motifs，ADAMTS)，由一组结构相似的分泌性锌结合蛋白酶组成，目前已发现19个成员。它们的蛋白结构具有高度的相似性,蛋白在氨基端信号肽序列后都为前蛋白域结构,蛋白酶原需在胞内经过翻译后的剪切才能成为有活性的蛋白酶。而且它们都包含有至少一个保守的TSP1样重复基序。位于蛋白酶羧基端的TSP样重复基序是与细胞外基质成分结合的重要部分。ADAMTS家族在体内以多种细胞外基质成分为底物，它们在胚胎发育、血管生成、凝血、炎症反应等生理过程中具有重要功能。
ADAMTS-5(含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族-5)是软骨基质蛋白聚蛋白多糖aggrecan的降解酶。关节软骨中含有大量的aggrecan,它对于关节的抗压力和张力等物理属性起着重要的作用。骨关节炎和类风湿性关节炎患者中发现存在着aggrecan的大量降解破坏。在aggrecan的结构域中有两个主要的切割位点,其中一个是MMPs切割位点,位于Asn341和Phe342；而另一个则是聚蛋白多糖酶aggrecanase切割位点,位于Glu373和Ala374。ADAMTS-5定位于人21q21-q22。聚蛋白多糖酶是治疗关节炎的新靶点，它的发现使得关节炎的治疗有望取得新的突破，为能从根本上治疗和预防关节炎提供了基础。脂肪组织也可以产生ADAMTS-5。脂肪细胞的形成和分化中可见ADAMTS-5及其底物aggrecan表达水平的变化,aggrecan在体外及体内均可以刺激脂肪细胞分化和成熟,提示ADAMTS-5在脂肪的形成中起着重要的作用。在恶性胶质瘤中,ADAMTS-5的表达水平明显升高,通过降解aggrecan介导了神经胶质瘤的侵袭与转移。另外，已知蛋白聚糖酶在其中发生细胞外蛋白降解或者破坏的其它疾病中起作用，例如癌症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、与年龄有关的黄斑变性、心肌梗塞、角膜溃疡和其它眼表面疾病、肝炎、主动脉瘤、腱炎、中枢神经系统疾病、异常伤口愈合、血管生成、再狭窄、肝硬变、多发性硬化症、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、糖尿病、炎性肠病、休克、椎间盘变性、中风、骨质减少和牙周病。
ADAM17(解聚素-金属蛋白酶17)是ADAMs家族(解聚素和金属蛋白酶)的一员，ADAMs家族是近年来发现的一类具有多种功能的细胞膜表面糖蛋白家族，它们共同参与细胞与细胞、细胞与基质的黏连、细胞融合、胞外基质的降解及信号传导等多种生理过程，如白细胞的迁移。除此之外，它们还参与了肿瘤形成、增殖及转移等病理过程[Mochizuki S]。ADAM17将膜结合型的TNF-α切断，产生游离型的TNF-α，因此被称作为TNF-α转换酶(TACE)。游离型的TNF-α引起炎症性细胞因子的过量分泌、细胞凋亡、细胞内信号传导的障碍等,导致各种疾病，包括风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、急性感染病、哮喘、特应性皮炎、牛皮癣等。ADAM17除以TNF-α为底物外，巨噬细胞集落刺激因子或趋化因子FKN也受ADAM17的调节。因此，认为抑制ADAM17的化合物有望作为炎症疾病的治疗药。然而，金属蛋白酶家族高度保守，开发选择性的小分子抑制剂已经被证明具有非常大的挑战。先前使用更广谱的金属蛋白酶抑制剂的试验已经被证明具有组织毒性，因此开发高度选择性的ADAM17抑制剂(Moss，2008)是需要解决的问题。
1998年克雷格·梅洛和安德鲁·法尔发现了基因沉默现象，随后Tuschl和他的同事在哺乳动物细胞中发现化学合成的19－25个碱基的小干扰RNA(siRNA)，可特异高效的沉默靶mRNA。从此siRNA被广泛用于基因功能研究，疾病治疗。siRNA可特异的同序列互补的靶mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割成21－23个碱基长度短片段RNA。两条链中同靶mRNA结合的链称为反义链，另一条链称为正义链或信使链。体外化学合成的siRNA进入细胞后同样发挥RNA干扰作用，而且有效降低了长链RNA引起的免疫反应。但针对同一基因不同片段位置可设计出多种siRNA，沉默效果有明显差异。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制ADAMTS-5基因和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用。
本发明提供一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种：
(1)如下A’和B’中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；
(2)如下A和B中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；
A’、SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
B’、SEQ ID No.2所示的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.1所示的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
A、SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
B、SEQ ID No.8所示的RNA单链和与SEQ ID No.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.7所示的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；
所述硫代磷酸修饰为P-S键代替P-OH键；
2)核糖或脱氧核糖的2’-甲氧基修饰；
3)核糖或脱氧核糖的2’-氟修饰；
4)锁核酸修饰；
所述锁核酸修饰为核糖或脱氧核糖的2′-O位和4′-C位通过缩水作用形成环状结构；
5)开环核酸修饰；
所述开环核酸修饰为核糖或脱氧核糖中2’-C和3’-C间的C-C键断裂；
6)吲哚修饰；
所述吲哚修饰为碱基被吲哚替代；
7)碱基的5－甲基胞嘧啶修饰；
8)碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰；
9)单链5’末端胆固醇修饰；
10)单链3’末端半乳糖修饰；
11)单链5’末端多肽修饰；
所述多肽具体为从N端到C端的序列为Arg-Gly-Asp的多肽；
12)单链5’末端磷酸化修饰；
13)单链5’末端荧光标记修饰；
所述荧光标记具体为Cy系列荧光标记；
所述化学修饰的双链siRNA分子组合物的活性成分为所述(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和所述(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种，所述双链siRNA分子可以单独包装也可以混合包装，在所述化学修饰的双链siRNA分子组合物中，所述(1)所示的双链siRNA分子和(2)所示的双链siRNA分子的摩尔比具体为1:1。
上述化学修饰的双链siRNA分子组合物中，所述与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.3所示的单链和SEQ ID No.4所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
所述与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.9所示的单链和SEQ ID No.10所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
所述化学修饰的双链siRNA分子组合物含有如下siRNA分子1和siRNA分子2：
siRNA分子1：该siRNA分子1的正义链和反义链分别具有如下(1)和(2)所示的结构：
(1)5'-K-LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3’；
(2)5'-R-MQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT-3’；
所述K为无修饰或5’末端胆固醇修饰；
所述R为5’末端磷酸化修饰；
所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
或，
所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
所述反义链为同ADAMTS-5(含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族-5)mRNA结合的单链，所述正义链为与所述反义链互补结合的单链；
siRNA分子2：siRNA分子2的正义链和反义链分别具有如下1)和2)所示的结构：
1)5'-K’-L’P’M’UCAUGUAUCUGAA P’M’M’dTdT-3’；
2)5'-R’-Q’Q’L’UUCAGAUACAUGA Q’L’P’dTdT-3’；
所述K’为5’末端胆固醇修饰；
所述R’为无修饰或5’末端磷酸化修饰；
所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
所述L’、M’、P’和Q’分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
或，
所述L’、M’、P’和Q’分别为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸；
所述反义链为同ADAM17(解聚素-金属蛋白酶17)mRNA结合的单链，所述正义链为与所述反义链互补结合的单链。
一种siRNA分子组合物也属于本发明的保护范围，含有如下C所示的siRNA分子中的至少一种分子和如下D所示的siRNA分子中的至少一种分子：
C为如下C1或C2所示：
C1、SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
C2、SEQ ID No.2所示的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.1所示的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
D为如下D1或D2所示：
D1、SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
D2、SEQ ID No.8所示的RNA单链和与SEQ ID No.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.7所示的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
所述siRNA分子组合物应用于制备预防和/或治疗炎症的产品；
所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎；
所述siRNA分子组合物的活性成分为所述C所示的siRNA分子中的至少一种分子和所述D所示的siRNA分子中的至少一种分子，所述siRNA分子可以单独包装也可以混合包装。
含有上述siRNA分子组合物的载体也属于本发明的保护范围；
所述载体为阳离子脂质体、壳聚糖纳米粒、多肽、聚合物材料。
上述siRNA分子组合物中，所述与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.3所示的单链和SEQ ID No.4所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
所述与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.9所示的单链和SEQ ID No.10所示的单链互补而成的双链siRNA分子。
上述siRNA分子组合物中，所述siRNA分子组合物由如下(1)和(2)所示的双链siRNA分子组成：
(1)SEQ ID No.3所示的单链和SEQ ID No.4所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
(2)SEQ ID No.9所示的单链和SEQ ID No.10所示的单链互补而成的双链siRNA分子。
一种能产生上述任一所述的siRNA分子组合物的DNA分子也属于本发明的保护范围。
上述DNA分子中，所述siRNA分子组合物含有如下(1)和(2)所示的双链siRNA分子：
(1)SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
(2)SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子。
上述DNA分子中，所述DNA分子为分别含有SEQ ID No.6中自5’末端起第36-54位核苷酸的DNA分子和SEQ ID No.11中自5’末端起第38-56位核苷酸的DNA分子的DNA分子组合物，具体为含有SEQ ID No.5所示的DNA单链和SEQ ID No.6所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子以及SEQ ID No.11所示的DNA单链和SEQ ID No.12所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子的DNA分子组合物，再具体为SEQ ID No.5所示的DNA单链和SEQ ID No.6所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子替换pGCsi-H1/Neo的BamHI和HindIII酶切位点间序列，pGCsi-H1/Neo其余序列不变得到的重组siRNA表达质粒1和SEQ ID No.11所示的DNA单链和SEQ ID No.12所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子替换pGCsi-H1/Neo的BamHI和HindIII酶切位点间序列，pGCsi-H1/Neo其余序列不变得到的重组siRNA表达质粒2。
一种试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、上述任一所述的siRNA分子组合物和/或上述任一所述的DNA分子；
所述试剂盒还含有记载在可读载体上的使用说明，该使用说明记载内容如下：在发生炎症部位注射上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物或其制剂、上述任一所述的siRNA分子组合物再经过化学修饰得到的siRNA分子组合物或其制剂和/或上述任一所述的DNA分子产生的RNA分子再经过化学修饰得到的双链siRNA分子组合物或其制剂。
上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、上述任一所述的siRNA分子组合物、上述任一所述的DNA分子和/或上述试剂盒在制备预防和/或治疗炎症的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎；
或，
上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、上述任一所述的siRNA分子组合物、上述任一所述的DNA分子和/或上述试剂盒在制备如下W1-W5任一所示的产品中的应用也属于本发明的保护范围：
W1、抑制关节表面纤维化的产品；
W2、抑制软骨侵蚀的产品；
W3、预防和/或治疗滑膜炎的产品；
W4、保护软骨和/或滑膜的产品；
W5、预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品。
本发明提供的siRNA组合物可以作为关节炎及相关炎症的治疗药物，可通过骨关节腔局部注射siRNA组合物或其制剂抑制炎症因子表达实现对关节炎症的治疗。
附图说明
图1为抑制ADAMTS-5基因的有效siRNA筛选。
图2为siRNA-RB-04免疫印迹实验。
图3为siRNA-RB-04下调炎症因子。
图4为siRNA结构对靶基因沉默效果的影响。
图5为硫代磷酸(P-S键)的修饰位置示意图。
图6为化学修饰增强寡聚核酸血清稳定性。
图7为大鼠组织病理切片分析。
图8为大鼠关节液炎症因子含量。
图9为抑制ADAM17基因的有效siRNA筛选。
图10为siRNA-AD-08免疫印迹实验。
图11为siRNA-AD-08下调炎症因子。
图12为siRNA结构对靶基因沉默效果的影响。
图13为化学修饰增强寡聚核酸血清稳定性。
图14为大鼠组织病理切片分析。
图15为大鼠关节液炎症因子含量。
图16为siRNA联合应用下调炎症因子。
图17为大鼠组织病理切片分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
hFLS细胞(人成纤维样滑膜细胞)为Cell Applications产品，产品目录号为408-05a。
293T细胞为ATCC产品，产品目录号为CRL-3216。
MCF-7细胞为ATCC产品，产品目录号为HTB-22。
Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒为AssayPro产品，产品目录号为EI2200-1。
pGCsi-H1/Neo在文献“季国忠，张发明，黄曙等.Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒表达载体的构建和鉴定[J].医学研究生学报，2006，19(11)：973-977”中公开过，公众可从广州市锐博生物科技有限公司获得。
Lipofectamine2000试剂盒为Invitrogen产品。
雄性SD大鼠(220±20g)为广东省医学实验动物中心产品。
下述实施例中的siRNA均为双链siRNA分子，注射大鼠的各注射液的溶剂均为PBS。
实施例1、抑制ADAMTS-5基因mRNA表达的有效寡聚核酸的筛选
一、进行siRNA设计以确定靶向于ADAMTS-5的siRNA，并进行生物信息筛选，确保序列对于ADAMTS-5序列是特异性的且对于来自任何其他基因的序列不是特异性的。靶序列使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相对于GenBank中的序列进行核对，经过初步实验筛选出8个有效siRNA，分别命名为siRNA-RB-01、siRNA-RB-02、siRNA-RB-03、siRNA-RB-04、siRNA-RB-05、siRNA-RB-06、siRNA-RB-07、siRNA-RB-08。以上siRNA为针对ADAMTS-5基因序列不同位置设计的siRNA。
二、细胞转染
实验分为10组，分别为siRNA-RB-01至siRNA-RB-08实验组，No target(NTC)阴性对照组、NC空白对照组。
siRNA-RB-01至siRNA-RB-08实验组的设置方法如下：
将hFLS细胞用0.25％的胰酶进行消化，用DMEM培养基制成浓度为1×104个/ml的细胞悬液，将其接种于12孔培养板中，每孔500ul，当hFLS细胞生长至对数生长期(即生长达80％融合成片)时，按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书，将各个对应的siRNA按照50nM的终浓度转染hFLS细胞。
No target(NTC)阴性对照组：将实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAMTS-5基因)所设计的siRNA，序列如下：
正义链:5’-AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3’；
反义链:5’-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3’。
NC空白对照组：不加siRNA，其余步骤与实验组一致。
三、在转染24h后收集各组hFLS细胞，于1000rpm离心5分钟，去除上清，Trizol法提取各组的RNA。
四、将各组的RNA反转录为cDNA，以各组的cDNA为模板，以F和R为引物，进行实时荧光定量PCR，检测结果如图1所示，以β-actin为内参基因。
引物如下：
F:5’-CTGCTCCCAGAAACAACG-3’；
R:5’-ATTCAGTGCCATCGGTCA-3’。
图1表明，经过前期筛选获得的8个有效siRNA中，siRNA-RB-04对ADAMTS-5的基因的沉默效果最好，抑制了90％的基因表达量。
其中siRNA-RB-04正义链的序列如SEQ ID No.1所示，反义链的序列如SEQ ID No.2所示。
siRNA-RB-04正义链：5’-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3’(SEQ ID No.1)
siRNA-RB-04反义链：5’-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3’(SEQ ID No.2)
五、Western blot检测
取siRNA-RB-04实验组的hFLS细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗涤细胞2遍，倒掉PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，用细胞刮将细胞刮下，置于冰上充分裂解细胞30min，于低温离心机4℃，12000g，离心15min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度，最后将样品蛋白的终浓度均调整为2μg/μl，于-80℃冰箱保存备用。分别取12μg总蛋白量的样品，加入等体积的2X loading buffer上样缓冲液。将二者充分混匀后，在沸水中煮浴10分钟，4℃存放备用。根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的胶(10％的SDS-PAGE分离胶和5％的浓缩胶)，等胶制备好后，将梳子拔去后用电泳缓冲液清洗上样孔，将之前准备好的样品上样，每孔加入蛋白样品，进行电泳。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转2小时，将蛋白转移到PVDF膜上，随后进行显色和曝光分析。
同时以NC空白对照组和No target(NTC)阴性对照组进行上述实验作为对照。
结果如图2所示。
图2中，Control为NC空白对照组，no target为No target(NTC)阴性对照组，siRNA为siRNA-RB-04实验组。
图2表明，siRNA-RB-04显著抑制了ADAMTS-5的蛋白表达，后续选用siRNA-RB-04做进一步分析。
实施例2、寡聚核酸对炎症因子的抑制
一、实验分为如下各组：
hFLS-siRNA-RB-04实验组：原代培养hFLS细胞至6孔板，当细胞密度约50％时，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将siRNA-RB-04按照50nM的终浓度转染hFLS细胞。
293T-siRNA-RB-04实验组：原代培养293T细胞至6孔板，当细胞密度约50％时，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将siRNA-RB-04按照50nM的终浓度转染细胞。
hFLS-No target(NTC)阴性对照组：将hFLS-siRNA-RB-04实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤与hFLS-siRNA-RB-04实验组一致。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAMTS-5基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3’；
反义链:5’-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3’。
293T-No target(NTC)阴性对照组：将293T-siRNA-RB-04实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤与293T-siRNA-RB-04实验组一致。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAMTS-5基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3’；
反义链:5’-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3’。
hFLS-NC空白对照组：hFLS-siRNA-RB-04实验组中不加siRNA，其余步骤与
hFLS-siRNA-RB-04实验组一致。
293T-NC空白对照组：293T-siRNA-RB-04实验组中不加siRNA，其余步骤与293T-siRNA-RB-04实验组一致。
二、转染24小时后,换无血清饥饿培养各组细胞24小时。
三、在各组细胞中加入IL 1-α，使其终浓度为10ng/ml，刺激24小时。
四、提取各组细胞的RNA并反转录为cDNA，以各组的cDNA为模板，分别以TNF-F和TNF-R为引物，以cox2-F和cox2-R为引物，以IL-1β-F和IL-1β-R为引物，进行实时荧光定量PCR，对应的检测TNF、COX-2和IL-1β基因的表达水平，以β-actin为内参基因。
TNF-F:5’-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3’；
TNF-R:5’-TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3’。
cox2-F：5'-CAGGGTTGCTGGTGGTAGGA-3'；
cox2-R：5'-GCATAAAGCGTTTGCGGTAC-3'。
IL-1β-F：5'-ACGAATCTCCGACCACCA-3'；
IL-1β-R：5'-GGACCAGACATCACCAAGC-3'。
结果如图3中A所示。
图3A中的NTC组均表示的是在之后的步骤中加入上述IL 1-α的NTC组。
收集各组细胞的上清液，利用Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒检测各组细胞IL-1β的分泌水平。
其中，上述的NTC组又分别设如下各组：
hFLS-No target(NTC+)阴性对照组：hFLS-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中加入上述IL 1-α。
hFLS-No target(NTC-)阴性对照组：hFLS-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中不加入上述IL 1-α。
293T-No target(NTC+)阴性对照组：293T-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中加入上述IL 1-α。
293T-No target(NTC-)阴性对照组：293T-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中不加入上述IL 1-α。
结果如图3中B所示。
图3A和B表明，分别与NTC或NTC+相比，siRNA-RB-04实验组在293T或hFLS细胞中均能有效抑制TNF、COX-2和IL-1β多种炎症因子的基因表达，并抑制IL-1β的分泌，其中在hFLS细胞中对IL-1β的基因抑制率达到89％。
实施例3、同源寡聚核酸对ADAMTS-5基因抑制效果的验证
为验证同源比率对siRNA-RB-04抑制ADAMTS-5基因效果的影响，进行以下三组实验：
一、第一组实验
第一组的siRNA反义链均为“5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3’”，正义链为“5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3’”的同源序列，如表1所示。
表1反义链组
注:S＝正义链，AS＝反义链。正义链分别选择15nt、11nt、23nt、27nt、错配。
按照实施例1的方法将表1所示的各siRNA转染hFLS细胞，并检测其对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率。
二、第二组实验
第二组的siRNA正义链均为“5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3’”，反义链为“5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3’”的同源序列，如表2所示。
表2正义链组
注:S＝正义链，AS＝反义链。
按照实施例1的方法将表2所示的各siRNA转染小鼠hFLS细胞，并检测其对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率。
三、第三组实验
第三组的siRNA正义链和反义链为以上两组的组合，如表3所示。
表3组合组
注:S＝正义链，AS＝反义链。
按照实施例1的方法将表3所示的各siRNA转染hFLS细胞，并检测其对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率。
以上各组实验按照实施例1的方法设置No target(NTC)阴性对照组和NC空白对照组。
结果如图4所示。
图4表明，三组设计的siRNA均起到了沉默靶基因ADAMTS-5的mRNA表达的作用，SEQ ID No.2所示的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，SEQ ID No.1所示的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，与SEQID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子均能干扰ADAMTS-5基因的表达。其中添加了悬挂碱基的21nt的siRNA-RB-13干扰效果最好，其对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率为91％；仅11nt互补的siRNA-RB-20干扰效果最差，对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率为22％，但也起到了干扰靶基因ADAMTS-5的mRNA表达的作用。
实施例4、质粒靶基因沉默效果影响
一、根据ADAMTS-5全长序列，设计含siRNA-RB-04序列的双链寡核苷酸序列,如表4所示。
表4含siRNA-RB-04序列的双链
注：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的划线部分为碱基互补区域，SEQ ID No.5中自5’末端起第10-28位核苷酸为SEQ ID No.1所示的RNA单链(siRNA-RB-04正义链)对应的DNA序列。SEQ ID No.6中自5’末端起第36-54位核苷酸为SEQ ID No.2所示的RNA单链(siRNA-RB-04反义链)对应的DNA序列。
二、对表4的寡核苷酸退火后形成双链，替换siRNA表达载体pGCsi-H1/Neo载体的BamHI和HindIII酶切位点间序列，其余序列保持不变，得到干扰片段表达载体1(重组siRNA表达质粒1)，将干扰片段表达载体1送测序，结果正确。
三、实验分为如下各组：
实验组：在感染前一天，将生长状态良好的hFLS细胞接种于6孔板中进行转染，按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书，将干扰片段表达载体1按照50nM的终浓度转染，转染后48h收集细胞。按照实施例1中步骤四的方法检测其对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率。
No target(NTC)阴性对照组：将实验组的干扰片段表达载体1替换为无关序列A和AS的退火双链其余步骤不变。
正义链:5’-AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3’；
反义链:5’-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3’。
NC空白对照组：不加干扰片段表达载体1，其余步骤与实验组一致。
结果如表5所示。
表5各组ADAMTS-5基因mRNA的相对表达量
表5表明，用转录siRNA-RB-04序列的DNA转染细胞，同样可以干扰靶基因ADAMTS-5mRNA的表达。
实施例5、化学修饰对ADAMTS-5抑制效果的影响
对siRNA-RB-13进行不同的化学修饰及其组合修饰，以提高siRNA稳定性，提升干扰效果。化学修饰包括核糖的卤素修饰(2’-F修饰)、甲氧基修饰(2’-OMe)、硫代修饰、胆固醇修饰等，修饰种类如表6所示，修饰后的序列如表7所示。
表6修饰种类
表6中，硫代磷酸(P-S键)的修饰位置如图5所示，锁核酸(LNA)修饰为核糖的2′-O位和4′-C位通过缩水作用形成环状结构，多肽为RGD(从N端到C端的序列是Arg-Gly-Asp,为sigma产品)，A代表某核苷酸。
表7化学修饰对siRNA沉默效果的影响
注:S＝正义链，AS＝反义链。
按照实施例1的方法将表7所示的各siRNA转染小鼠hFLS细胞，并检测其对ADAMTS-5基因mRNA表达的抑制效率。其中用胆固醇、多肽、半乳糖修饰的siRNA进行转染时，不加入转染试剂直接进行转染。
结果如表7所示。
表7表明，经各类适当的化学修饰后得到的siRNA-RB-13修饰物均起到了沉默目的基因ADAMTS-5表达的效果。
实施例6、化学修饰对寡聚核酸血清稳定性的影响
对实施例5的若干化学修饰核酸分子进行血清稳定性检测，步骤如下：
将各siRNA分子经无RNA酶水稀释至5μM后加入等体积的新鲜大鼠血清(为上海远慕生物科技有限公司产品),然后在37℃孵育30分钟，取样进行电泳观察不同siRNA的完整性。
结果如图6所示。
图6表明，未修饰的siRNA-RB-13在30分钟后已明显降解，而经过修饰的核酸siRNA-RB-41，siRNA-RB-40，siRNA-RB-35在30分钟内无明显降解。
实施例7、骨关节炎模型大鼠病理切片实验
一、炎症模型大鼠的构建
用牛二型胶原作为诱导剂促进关节炎的形成。将牛二型胶原(Sigma产品)注射到220±20g的雄性SD大鼠关节腔，牛二型胶原浓度为4mg/mL,一次性给予200μL，100μL/腿。
二、设置如下各组：
在注射牛二型胶原3d后，将炎症模型大鼠随机分为2组，每组8只。一组为PBS组，一组为siRNA-RB-40实验组，其中siRNA-RB-40实验组每次每只大鼠注射10nmol/腿的siRNA-RB-40溶液，注射体积100μL，50μL/腿，PBS组每次每只大鼠注射等体积的PBS，每组均每周给药2次，连续给药2周，给药时间一致。
三、每组取4只大鼠，于第4次给药后的第二天处死动物取材：剪开皮肤，取膝关节浸泡于组织保存液中，经固定、脱钙、石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，在显微镜下观察组织病理表现，结果如图7所示。
图7中，模型组为PBS组，给药组为siRNA-RB-40实验组。
图7表明，PBS组患病组织2周后呈现出(1)半月板软骨的降解(A)；(2)关节腔严重的纤维化(C)；(3)软骨层钙化、细胞排列紊乱(E)等炎症病理症状。与PBS组相比，siRNA-RB-40实验组的组织对应的出现(1)半月板钙化程度显著降低、半月板结构保持完整(B)；(2)软骨层形态完整，纤维化程度显著降低(D)；(3)软骨层细胞排列整齐，细胞呈现较高活性(F)等特征。
结果表明，siRNA-RB-40可以抑制患骨关节炎的大鼠的疾病进程，包括关节表面纤维化、软骨侵蚀、滑膜炎等，可作为潜在的改善疾病的关节炎治疗药。
实施例8、大鼠关节液炎症因子含量的检测
一、按照实施例7的方法建立PBS组、siRNA-RB-35实验组、siRNA-RB-40实验组、siRNA-RB-41实验组。其中，siRNA-RB-35实验组、siRNA-RB-41实验组仅将siRNA-RB-40替换为siRNA-RB-35、siRNA-RB-41，其中siRNA-RB-35由壳聚糖纳米粒包裹，其余步骤相同。
二、于第4次给药处理后的第二天处死动物取材，剥离皮肤与组织后取膝关节，在倒入液氮的研钵中，充分研磨至骨组织成粉末，按照Rneasy Mini kit(为广州吉泰新绎生物科技有限公司产品,产品目录号为217004)说明书，抽提RNA并反转录为cDNA。以各cDNA为模板，按照实施例1中步骤四，检测ADAMTS-5基因的相对表达量，按照实施例2中步骤四的方法检测TNF、COX-2和IL-1β基因的相对表达量。
同时以健康雄性SD大鼠为对照进行上述实验。
ADAMTS-5与炎症因子的相对表达量统计结果如图8所示。
图8中，健康组为健康雄性SD大鼠组、模型组为PBS组。
图8表明，与健康雄性SD大鼠组相比，PBS组中炎症相关基因ADAMTS-5、TNF、COX-2、IL-1β表达升高。而siRNA-RB-40，siRNA-RB-35，siRNA-RB-41可显著下调大鼠炎症疾病中的ADAMTS-5、TNF、COX-2、IL-1β的表达，起到了保护软骨与滑膜，改善炎症的效果，表明本发明的siRNA分子是潜在的可预防或治疗炎症的药物。
实施例9、细胞增殖实验
siRNA组：将hFLS细胞用10％胎牛血清的DMEM培养液培养基配制成4×104个/ml的浓度，将其以100ul/孔的量加到96孔板，按照CCK-8试剂盒(为Yeasen公司产品)的说明书，将siRNA-RB-13以终浓度为50nM的量转染各孔细胞，转染24h后换成无血清无双抗的DMEM培养基作同步化，无血清无双抗的DMEM培养基培养24h后换成完全培养基并在部分孔加上IL-1a刺激(以诱导炎症)，另一部分孔不加，IL-1a刺激48h后用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖情况。
NTC组：将上述siRNA组中的siRNA-RB-13替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAMTS-5基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3’；
反义链:5’-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3’。
结果如表8所示。
表8siRNA干扰后的细胞增殖情况
(表8中IL-1a+代表加入IL-1a刺激，IL-1a-代表未加入IL-1a刺激)
结果表明，与NTC组相比，加入siRNA-RB-13的细胞的数量有轻度增殖，表明本发明的siRNA(siRNA-RB-13)无细胞毒性；且可能有修复细胞的作用。
实施例10、抑制ADAM17基因mRNA表达的有效寡聚核酸的筛选
一、进行siRNA设计以确定靶向于ADAM17的siRNA，并进行生物信息筛选，确保序列对于ADAM17序列是特异性的且对于来自任何其他基因的序列不是特异性的。靶序列使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相对于GenBank中的序列进行核对，经过初步实验筛选出8个有效siRNA，分别命名为siRNA-AD-01、siRNA-AD-02、siRNA-AD-03、siRNA-AD-04、siRNA-AD-05、siRNA-AD-06、siRNA-AD-07、siRNA-AD-08。以上siRNA为针对ADAM17基因序列不同位置设计的siRNA。
二、细胞转染
实验分为10组，分别为siRNA-AD-01至siRNA-AD-08实验组，Notarget(NTC)为阴性对照组、NC为空白对照组。
siRNA-AD-01至siRNA-AD-08实验组的设置方法如下：
将hFLS细胞用0.25％的胰酶进行消化，用DMEM培养基制成浓度为1×104个/ml的细胞悬液，将其接种于12孔培养板中，每孔500ul，当hFLS细胞生长至对数生长期(即生长达80％融合成片)时，按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书，将各个对应的siRNA按照50nM的终浓度转染hFLS细胞。
No target(NTC)阴性对照组：将实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAM17基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3’；
反义链:5’-GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3’。
NC空白对照组：不加siRNA，其余步骤与实验组一致。
三、在转染24h后收集各组hFLS细胞，于1000rpm离心5分钟，去除上清，Trizol法提取各组的RNA。
四、将各组的RNA反转录为cDNA，以各组的cDNA为模板，以ADAM17-F1和ADAM17-R1为引物，进行实时荧光定量PCR，检测结果如图9所示，以β-actin为内参基因。
ADAM17-F1:5’-GGACCAGGGAGGGAAATA-3’
ADAM17-R1:3’-TTGCTGTGGACGACGTTG-5’
图9表明，经过前期筛选获得的8个有效siRNA中，siRNA-AD-08对ADAM17的沉默效果最好，抑制了86％的基因表达量。
其中siRNA-AD-08正义链的序列如SEQ ID No.7所示，反义链的序列如SEQ ID No.8所示。
siRNA-AD-08正义链：5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3’(SEQ ID No.7)
siRNA-AD-08反义链：5'-UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3'(SEQ ID No.8)
五、Western blot检测
取siRNA-AD-08实验组的hFLS细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗涤细胞2遍，倒掉PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，用细胞刮将细胞刮下，置于冰上充分裂解细胞30min，于低温离心机4℃，12000g，离心15min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度，最后将样品蛋白的终浓度均调整为2μg/μl，于-80℃冰箱保存备用。分别取12μg总蛋白量的样品，加入等体积的2X loading buffer上样缓冲液。将二者充分混匀后，在沸水中煮浴10分钟，4℃存放备用。根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的胶(10％的SDS-PAGE分离胶和5％的浓缩胶)，等胶制备好后，将梳子拔去后用电泳缓冲液清洗上样孔，将之前准备好的样品上样，每孔加入蛋白样品，进行电泳。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转2小时，将蛋白转移到PVDF膜上。随后进行显色和曝光分析。
同时以NC空白对照组和No target(NTC)阴性对照组进行上述实验作为对照。结果如图10所示。
图10中，Control为NC空白对照组，no target为No target(NTC)阴性对照组，siRNA为siRNA-AD-08实验组。
图10表明，siRNA-AD-08显著抑制了ADAM17的蛋白表达，后续选用siRNA-AD-08做进一步的分析。
实施例11、寡聚核酸对炎症因子的抑制
一、实验分为如下各组：
hFLS-siRNA-AD-08实验组：原代培养hFLS细胞至6孔板，当细胞密度约50％时，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将siRNA-AD-08按照50nM的终浓度转染hFLS细胞。
MCF-7-siRNA-AD-08实验组：原代培养MCF-7细胞至6孔板，当细胞密度约50％时，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将siRNA-AD-08按照50nM的终浓度转染MCF-7细胞。
hFLS-No target(NTC)阴性对照组：将hFLS-siRNA-AD-08实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAM17基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3’；
反义链:5’-GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3’。
MCF-7-No target(NTC)阴性对照组：将MCF-7-siRNA-AD-08实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAM17基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3’；
反义链:5’-GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3’。
hFLS-NC空白对照组：hFLS-siRNA-AD-08实验组中不加siRNA，其余步骤与hFLS-siRNA-AD-08实验组一致。
MCF-7-NC空白对照组：MCF-7-siRNA-AD-08实验组中不加siRNA，其余步骤与MCF-7-siRNA-AD-08实验组一致。
二、转染24小时后,换无血清饥饿培养各组细胞24小时。
三、在各组细胞中加入IL 1-α，使其终浓度为10ng/ml，刺激24小时。
四、提取各组细胞的RNA并反转录为cDNA，以各组的cDNA为模板，分别以TNF-F和TNF-R为引物，以cox2-F和cox2-R为引物，以IL-1β-F和IL-1β-R为引物，进行实时荧光定量PCR，对应的检测TNF、COX-2和IL-1β基因的表达水平，以β-actin为内参基因。
结果如图11中A所示。
图11A中的NTC组均表示的是在之后的步骤中加入上述IL 1-α的NTC组。
收集各组细胞的上清液，利用Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒检测各组细胞IL-1β的分泌水平。
其中，上述的NTC组又分别设如下各组：
hFLS-No target(NTC+)阴性对照组：hFLS-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中加入上述IL 1-α。
hFLS-No target(NTC-)阴性对照组：hFLS-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中不加入上述IL 1-α。
MCF-7-No target(NTC+)阴性对照组：MCF-7-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中加入上述IL 1-α。
MCF-7-No target(NTC-)阴性对照组：MCF-7-No target(NTC)阴性对照组在之后的步骤中不加入上述IL 1-α。
结果如图11中B所示。
图11表明，分别与NTC或NTC+相比，siRNA-AD-08在MCF-7与hFLS细胞中均能有效抑制COX-2和IL-1β炎症因子的基因表达量，并抑制IL-1β的分泌，其中在hFLS细胞中对IL-1β的基因抑制率达到88％。在MCF-7细胞中，转染siRNA-AD-08后TNF的基因表达量高于NTC组，可能是由TNF的细胞功能比较复杂引起的。
实施例12、同源寡聚核酸对ADAM17基因抑制效果的验证
为验证同源比率对siRNA-AD-08抑ADAM17基因效果的影响，进行以下三组实验：
一、第一组实验
第一组的siRNA反义链均为“5'-UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3'”，正义链为“5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3'”的同源序列，如表9所示。
表9反义链组
注:S＝正义链，AS＝反义链。正义链分别选择11nt、15nt、23nt、27nt、错配。
按照实施例10的方法将表9所示的各siRNA转染hFLS细胞，并检测其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率。
二、第二组实验
第二组的siRNA正义链均为“5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3'”，反义链为“3'-CGUAGUACAUAGACUUGUU-5'”的同源序列，如表10所示。
表10正义链组
注:S＝正义链，AS＝反义链。
按照实施例10的方法将表10所示的各siRNA转染小鼠hFLS细胞，检测其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率。
三、第三组实验
第三组的siRNA正义链和反义链为以上两组的组合，如表11所示。
表11组合组
注:S＝正义链，AS＝反义链。
按照实施例10的方法将表11所示的各siRNA转染小鼠hFLS细胞，检测其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率。
以上各组实验按照实施例10的方法设置No target(NTC)阴性对照组和NC空白对照组。
结果如图12所示。
图12表明，三组设计的siRNA均起到了沉默靶基因ADAM17的mRNA表达的作用，SEQ ID No.8所示的RNA单链和与SEQ ID No.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，SEQ ID No.7所示的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，与SEQID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子均能干扰ADAM17基因的表达。其中添加了悬挂碱基的21nt的siRNA-AD-13干扰效果最好，其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率为88％；仅11nt互补的siRNA-AD-20干扰效果最差，其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率为20％，但也起到了干扰靶基因ADAM17表达的作用。
实施例13、质粒靶基因沉默效果影响
一、根据ADAM17全长序列，设计含siRNA-AD-08序列的双链寡核苷酸序列，如表12所示。
表12含siRNA-AD-08序列的双链
注：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的划线部分为碱基互补区域，SEQ ID No.11中自5’末端起第38-56位核苷酸为SEQ ID No.8所示的RNA单链(siRNA-AD-08反义链)对应的DNA序列。SEQ ID No.12中自5’末端起第8-26位核苷酸为SEQ ID No.7所示的RNA单链(siRNA-AD-08正义链)对应的DNA序列。
二、对表12的寡核苷酸退火后形成双链，替换siRNA表达载体pGCsi-H1/Neo载体的BamHI和HindIII酶切位点间序列，其余序列保持不变，得到干扰片段表达载体2(重组siRNA表达质粒2)，将干扰片段表达载体2送测序，结果正确。
三、实验分为如下各组：
实验组：在感染前一天，将生长状态良好的hFLS细胞接种于6孔板中进行转染，按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书，将干扰片段表达载体2按照50nM的终浓度转染，转染后48h收集细胞。按照实施例10中步骤四的方法检测其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率。
No target(NTC)阴性对照组：将实验组的siRNA替换为无关序列:
正义链:5’-AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3’；
反义链:5’-GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3’。
其余步骤不变。
NC空白对照组：不加干扰片段表达载体2，其余步骤与实验组一致。
结果如表13所示。
表13各组ADAM17基因mRNA的相对表达量
表13表明，用转录siRNA-AD-08序列的DNA转染细胞，同样可以干扰靶基因ADAM17mRNA的表达。
实施例14、化学修饰对ADAM17抑制效果的影响
对siRNA-AD-13进行不同的化学修饰及其组合修饰，以提高siRNA稳定性，提升干扰效果。化学修饰包括核糖的卤素修饰(2’-F修饰)、甲氧基修饰(2’-OMe)、硫代修饰、胆固醇修饰等，修饰种类如表6所示，修饰后的序列如表14所示。
表14化学修饰对siRNA沉默效果的影响
注:S＝正义链，AS＝反义链。
按照实施例10的方法将表14所示的各siRNA转染小鼠hFLS细胞，并检测其对ADAM17基因mRNA表达的抑制效率。其中用胆固醇、多肽、半乳糖修饰的siRNA进行转染时，不加入转染试剂直接进行转染。
结果如表14所示。
表14表明，经各类适当的化学修饰后得到的siRNA-AD-13修饰物均起到了沉默目的基因ADAM17表达的效果。
实施例15、化学修饰对寡聚核酸血清稳定性的影响
对实施例14的若干化学修饰核酸分子进行血清稳定性检测，步骤如下：
将各siRNA分子经无RNA酶水稀释至5μM后加入等体积的新鲜大鼠血清(为上海远慕生物科技有限公司产品),然后在37℃孵育30分钟，取样进行电泳观察不同siRNA的完整性。
结果如图13所示。
图13表明，未修饰siRNA-AD-13在30分钟后已明显降解，而修饰核酸siRNA-AD-26，siRNA-AD-39，siRNA-AD-40在30分钟内无明显分解。
实施例16、骨关节炎模型大鼠病理切片实验
一、炎症模型大鼠的构建同实施例7。
二、设置如下各组：
在注射牛二型胶原3d后，将炎症模型大鼠随机分为2组，每组8只。一组为PBS组，一组为siRNA-AD-26实验组，其中siRNA-AD-26实验组每次每只大鼠注射10nmol/腿的siRNA-AD-26溶液，注射体积100μL，50μL/腿，PBS组每次每只大鼠注射等体积的PBS，每组均每周给药2次，连续给药2周,给药时间一致。
三、分别于第2、4次给药处理后的第二天处死动物取材，剪开皮肤，取膝关节浸泡于组织保存液中，经固定、脱钙、石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)和甲苯胺蓝(TB)染色，在显微镜下观察组织病理表现，结果如图14所示。
图14中，siRNA组为siRNA-AD-26实验组。1W和2W分别代表炎症模型大鼠建模一周和两周后。
图14表明，炎症模型大鼠建模一周后，PBS组出现半月板的纤维化和骨化，部分纤维化组织侵入软骨层，软骨细胞排列紊乱，胶原部分流失，关节内结缔组织也出现了明显纤维化和炎性细胞；siRNA-AD-26实验组关节面平滑，软骨层细胞排列有序，仅局部出现轻微的软骨细胞的骨化变性和细胞外胶原流失。建模两周后，PBS组关节面多纤维化组织增生，关节腔内大量纤维化组织，半月板骨化并覆盖多层纤维化增生组织，部分软骨层骨化并出现破碎，软骨层细胞紊乱变性，胶原大量流失；siRNA-AD-26实验组半月板虽然出现局部骨化和纤维增生，但关节和半月板仍保持正常形态，关节面平滑，软骨层细胞正常，各项损失程度都明显较PBS组轻微。
结果表明，siRNA-AD-26可以抑制患骨关节炎的大鼠的疾病进程，可作为潜在的改善疾病的关节炎治疗药。
实施例17、大鼠关节液炎症因子含量的检测
一、按照实施例16的方法建立PBS组、siRNA-AD-26实验组、siRNA-AD-39实验组、siRNA-AD-40实验组。其中，siRNA-AD-40实验组、siRNA-AD-39实验组仅将siRNA-AD-26替换为siRNA-AD-40、siRNA-AD-39，其中siRNA-AD-40由壳聚糖纳米粒包裹，其余步骤相同。
二、于第4次给药处理后的第二天处死动物取材：剥离皮肤与组织后取膝关节，在倒入液氮的研钵中，充分研磨至骨组织成粉末，按照Rneasy Mini kit(为广州吉泰新绎生物科技有限公司产品,产品目录号为217004)说明书，抽提RNA并反转录为cDNA。以各cDNA为模板，按照实施例10中步骤四，检测ADAM17基因的相对表达量，按照实施例11中步骤四的方法检测TNF、COX-2和IL-1β基因的相对表达量。
同时以健康雄性SD大鼠为对照进行上述实验。
ADAM17与炎症因子的相对表达量统计结果如图15所示。
图15中，Normal为健康雄性SD大鼠组、Model为PBS组。
图15表明，与健康雄性SD大鼠组相比，PBS组中炎症相关基因ADAM17、TNF、COX-2、IL-1β表达升高，而siRNA-AD-26、siRNA-AD-39、siRNA-AD-40可显著下调大鼠炎症疾病不同进程中的ADAM17、TNF、COX-2、IL-1β的表达，起到了保护软骨，改善炎症的效果，表明本发明的siRNA分子是潜在的可预防或治疗炎症的药物。
实施例18、细胞增殖实验
siRNA组：将hFLS细胞用10％胎牛血清的DMEM培养液培养基配制成4×104个/ml的浓度，将其以100ul/孔的量加到96孔板，按照CCK-8试剂盒(为Yeasen公司产品)的说明书，将siRNA-AD-13以终浓度为50nM的量转染各孔细胞，转染24h后换成无血清无双抗的DMEM培养基作同步化，无血清无双抗的DMEM培养基培养24h后换成完全培养基并在部分孔加上IL-1a刺激(以诱导炎症)，另一部分孔不加，IL-1a刺激48h及72h后用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖情况。
NTC组：将上述siRNA组中的siRNA-AD-13替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAM17基因)所设计的siRNA：
正义链:5’-AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3’；
反义链:5’-GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3’。
结果如表15所示。
表15siRNA干扰后的细胞增殖情况
(表15中IL-1a+代表加入IL-1a刺激，IL-1a-代表未加入IL-1a刺激)
结果表明，与NTC组相比，加入siRNA-AD-13的细胞的数量有轻度的增殖，表明本发明的siRNA(siRNA-AD-13)无细胞毒性；且可能有修复细胞的作用。
实施例19、寡聚核酸联合使用对炎症因子的抑制
一、设置如下各组：
ADAMTS-5组：原代培养hFLS细胞至6孔板，当细胞密度约50％时，按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书，将siRNA-RB-13按照50nM的终浓度转染hFLS细胞。
ADAM17组：将ADAMTS-5组的siRNA-RB-13替换为siRNA-AD-13，其余步骤相同。
ADAMTS-5+ADAM17组：将ADAMTS-5组的siRNA-RB-13替换为25nM的siRNA-RB-13和25nM的siRNA-AD-13，其余步骤相同。
No target(NTC)阴性对照组：将ADAMTS-5组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因(ADAMTS-5和ADAM17基因)所设计的siRNA：
正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3'；
反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'
NC空白对照组：不加siRNA，其余步骤与ADAMTS-5组一致。
二、转染24小时后,换无血清饥饿培养各组细胞24小时。
三、在各组细胞中加入IL 1-α(10ng/ml)，使其终浓度为10ng/ml，刺激24小时。
四、按照实施例2中步骤四的方法检测TNF、COX-2和IL-1β基因的表达水平以及各组细胞IL-1β的分泌水平。
结果如图16所示。
图16B中，control代表NC空白对照组，no target代表No target(NTC)阴性对照组。
图16表明，与单独注射siRNA相比，siRNA-RB-13与siRNA-AD-13复配后，对炎症因子的干扰效果显著提高，二者具有抑制炎症因子的协同作用。
实施例20、骨关节炎模型大鼠病理切片实验
一、炎症模型大鼠的构建同实施例7。
二、设置如下各组：
在注射牛二型胶原3d后，将炎症模型大鼠随机分为如下2组。
AD5&17组和Control组：共12只小鼠，采用自身对照处理，一侧后肢给予PBS作为Control组，一侧后肢给予siRNA(siRNA-RB-40和siRNA-AD-26各5nmol)作为AD5&17组，注射体积均为50μL，以每周2次的给药频率，连续给药3周，分别于第2、4、6次给药处理的第二天处死动物取材。
三、分别于第2、4、6次给药处理的第二天处死动物取材，剪开皮肤，取膝关节浸泡于组织保存液中，经固定、脱钙、石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)和甲苯胺蓝(TB)染色，在显微镜下观察组织病理表现，结果如图17所示。
图17中，A为HE染色结果，B为TB染色结果。
图17表明，建模一周后，Control组软骨细胞排列出现紊乱，软骨层增厚，半月板骨化，软骨胶原流失；AD5&17组软骨胶原流失不明显，半月板仅部分出现骨化。建模两周后，Control组软骨层局部被纤维化组织侵袭入软骨下骨层，软骨层近关节腔部分与滑膜层都出现纤维化增生，胶原严重流失，关节囊纤维化严重，半月板骨化；AD5&17组仅局部软骨层胶原少量流失，半月板部分软骨细胞变性。建模三周后，Control组关节面严重纤维化，关节腔有组织碎片和纤维化组织，软骨层细胞骨化变性，胶原严重流失，关节囊明显纤维化增生并大量炎性细胞浸润；AD5&17组关节面平滑，软骨细胞基本保持形态与活性。结果显示在观察的各个阶段，AD5&17组的病理变化均较Control组轻。表明针对ADAMTS-5和ADAM17的siRNA联合用药可以抑制患关节炎的大鼠的疾病进程，包括纤维化、软骨侵蚀等，可作为潜在的改善疾病的关节炎治疗药。
实施例21、大鼠关节液炎症因子含量的检测
一、按照实施例7的方法建立ADAMTS5-siRNA施药组、ADAM17-siRNA施药组、ADAMTS5-siRNA&ADAM17-siRNA施药组，其中ADAMTS5-siRNA施药组的siRNA为siRNA-RB-40，ADAM17-siRNA施药组的siRNA为siRNA-AD-26，ADAMTS5-siRNA&ADAM17-siRNA施药组的siRNA为siRNA-RB-40和siRNA-AD-26，各施药组除ADAMTS5-siRNA&ADAM17-siRNA施药组外各组的siRNA剂量均相同，均为10nmol/腿；ADAMTS5-siRNA&ADAM17-siRNA施药组的各siRNA的剂量相同，均为5nmol/腿。每组均每周给药2次，给药时间一致。
健康大鼠组：雄性SD大鼠(220±20g)。
炎症模型大鼠组：实施例7构建的炎症模型大鼠。
二、分别于第2、4、6次给药处理的第二天处死动物取材，每组每个时间点大鼠4只：剥离皮肤与组织后取膝关节，在倒入液氮的研钵中，充分研磨至骨组织成粉末，按照Rneasy Mini kit(为广州吉泰新绎生物科技有限公司产品,产品目录号为217004)说明书，抽提RNA并反转录为cDNA。以各cDNA为模板，按照实施例1中步骤四的方法检测ADAMTS-5的相对表达量，按照实施例2中步骤四的方法检测TNF、COX-2和IL-1β基因的相对表达量，按照实施例10中步骤四的方法检测ADAM17的相对表达量。
结果如表16所示。
表16大鼠中炎症因子的表达量
表16表明，与健康大鼠组相比，炎症模型大鼠组中炎症相关基因ADAMTS-5、ADAM17、TNF、COX-2、IL-1表达升高，与ADAM17-siRNA(针对于ADAM17的siRNA)或ADAMTS5-siRNA(针对于ADAMTS-5的siRNA)的单独给药相比，ADAM17-siRNA与ADAMTS5-siRNA的联合给药可在给药后1-3周显著下调大鼠炎症疾病中的ADAMTS-5、ADAM17、TNF、COX-2、IL-1β的表达，起到了保护软骨与滑膜、改善炎症的效果。联合的siRNA分子可能是一种高疗效的炎症治疗药物。
Claims (10)
1.一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种：
(1)如下A’和B’中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；
(2)如下A和B中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；
A’、SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
B’、SEQ ID No.2所示的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.1所示的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
A、SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
B、SEQ ID No.8所示的RNA单链和与SEQ ID No.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.7所示的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；
2)核糖或脱氧核糖的2’-甲氧基修饰；
3)核糖或脱氧核糖的2’-氟修饰；
4)锁核酸修饰；
5)开环核酸修饰；
6)吲哚修饰；
7)碱基的5－甲基胞嘧啶修饰；
8)碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰；
9)单链5’末端胆固醇修饰；
10)单链3’末端半乳糖修饰；
11)单链5’末端多肽修饰；
12)单链5’末端磷酸化修饰；
13)单链5’末端荧光标记修饰。
2.根据权利要求1所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物，其特征在于：所述与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.3所示的单链和SEQ ID No.4所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
所述与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.9所示的单链和SEQ ID No.10所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
所述化学修饰的双链siRNA分子组合物含有如下siRNA分子1和siRNA分子2：
siRNA分子1：该siRNA分子1的正义链和反义链分别具有如下(1)和(2)所示的结构：
(1)5'-K-LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3’；
(2)5'-R-MQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT-3’；
所述K为无修饰或5’末端胆固醇修饰；
所述R为5’末端磷酸化修饰；
所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
或，
所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
siRNA分子2：siRNA分子2的正义链和反义链分别具有如下1)和2)所示的结构：
1)5'-K’-L’P’M’UCAUGUAUCUGAA P’M’M’dTdT-3’；
2)5'-R’-Q’Q’L’UUCAGAUACAUGA Q’L’P’dTdT-3’；
所述K’为5’末端胆固醇修饰；
所述R’为无修饰或5’末端磷酸化修饰；
所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
所述L’、M’、P’和Q’分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
或，
所述L’、M’、P’和Q’分别为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸。
3.一种siRNA分子组合物，含有如下C所示的siRNA分子中的至少一种分子和如下D所示的siRNA分子中的至少一种分子：
C为如下C1或C2所示：
C1、SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
C2、SEQ ID No.2所示的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.1所示的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
D为如下D1或D2所示：
D1、SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
D2、SEQ ID No.8所示的RNA单链和与SEQ ID No.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，SEQ ID No.7所示的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
或，与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子。
4.根据权利要求3所述的siRNA分子组合物，其特征在于：所述与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.3所示的单链和SEQ IDNo.4所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
所述与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No.9所示的单链和SEQ ID No.10所示的单链互补而成的双链siRNA分子。
5.根据权利要求3所述的siRNA分子组合物，其特征在于：所述siRNA分子组合物由如下(1)和(2)所示的双链siRNA分子组成：
(1)SEQ ID No.3所示的单链和SEQ ID No.4所示的单链互补而成的双链siRNA分子；
(2)SEQ ID No.9所示的单链和SEQ ID No.10所示的单链互补而成的双链siRNA分子。
6.一种能产生权利要求3-5任一所述的siRNA分子组合物的DNA分子。
7.根据权利要求6所述的DNA分子，其特征在于：所述siRNA分子组合物含有如下(1)和(2)所示的双链siRNA分子：
(1)SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
(2)SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为分别含有SEQ ID No.6中自5’末端起第36-54位核苷酸的DNA分子和SEQ ID No.11中自5’末端起第38-56位核苷酸的DNA分子的DNA分子组合物，具体为含有SEQ ID No.5所示的DNA单链和SEQ ID No.6所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子以及SEQ IDNo.11所示的DNA单链和SEQ ID No.12所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子的DNA分子组合物，再具体为SEQ ID No.5所示的DNA单链和SEQ ID No.6所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子替换pGCsi-H1/Neo的BamHI和HindIII酶切位点间序列，pGCsi-H1/Neo其余序列不变得到的重组siRNA表达质粒1和SEQ ID No.11所示的DNA单链和SEQ ID No.12所示的DNA单链互补而成的双链DNA的分子替换pGCsi-H1/Neo的BamHI和HindIII酶切位点间序列，pGCsi-H1/Neo其余序列不变得到的重组siRNA表达质粒2。
9.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、权利要求3-5任一所述的siRNA分子组合物和/或权利要求6-8任一所述的DNA分子。
10.权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、权利要求3-5任一所述的siRNA分子组合物、权利要求6-8任一所述的DNA分子和/或权利要求9所述的试剂盒在制备预防和/或治疗炎症的产品中的应用；
所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎；
或，
权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、权利要求3-5任一所述的siRNA分子组合物、权利要求6-8任一所述的DNA分子和/或权利要求9所述的试剂盒在制备如下W1-W5任一所示的产品中的应用：
W1、抑制关节表面纤维化的产品；
W2、抑制软骨侵蚀的产品；
W3、预防和/或治疗滑膜炎的产品；
W4、保护软骨和/或滑膜的产品；
W5、预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410827675.3A CN104560997B (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410827675.3A CN104560997B (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104560997A true CN104560997A (zh) | 2015-04-29 |
| CN104560997B CN104560997B (zh) | 2018-05-04 |
Family
ID=53078076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410827675.3A Active CN104560997B (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104560997B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016103042A1 (en) * | 2014-12-25 | 2016-06-30 | Guangzhou Ribobio Co., Ltd. | Compositions and methods for inhibiting expression of adamts-5 and adam17 |
| CN108060163A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-05-22 | 北京大学 | 一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101238127A (zh) * | 2005-05-20 | 2008-08-06 | 艾伦托斯制药控股公司 | 嘧啶或三嗪稠合的二环金属蛋白酶抑制剂 |
| CN103285026A (zh) * | 2006-05-19 | 2013-09-11 | 爱尔康研究有限公司 | 肿瘤坏死因子α相关状况的RNAi介导的抑制 |
-
2014
- 2014-12-25 CN CN201410827675.3A patent/CN104560997B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101238127A (zh) * | 2005-05-20 | 2008-08-06 | 艾伦托斯制药控股公司 | 嘧啶或三嗪稠合的二环金属蛋白酶抑制剂 |
| CN103285026A (zh) * | 2006-05-19 | 2013-09-11 | 爱尔康研究有限公司 | 肿瘤坏死因子α相关状况的RNAi介导的抑制 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| P.S. BURRAGE AND C.E. BRINCKERHOFF: "Molecular Targets in Osteoarthritis: Metalloproteinases and Their Inhibitors", 《CURRENT DRUG TARGETS》 * |
| 杜清峰等: "慢病毒介导的aggrecanase-2 shRNA转染对类风湿关节炎患者软骨细胞aggrecan的影响", 《中华骨科杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016103042A1 (en) * | 2014-12-25 | 2016-06-30 | Guangzhou Ribobio Co., Ltd. | Compositions and methods for inhibiting expression of adamts-5 and adam17 |
| US10709729B2 (en) | 2014-12-25 | 2020-07-14 | Guangzhou Institutes Of Biomedicine And Health, Chinese Academy Of Sciences | Compositions and methods for inhibiting expression of ADAMTS-5 and ADAM17 |
| CN108060163A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-05-22 | 北京大学 | 一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104560997B (zh) | 2018-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | CCL8 secreted by tumor-associated macrophages promotes invasion and stemness of glioblastoma cells via ERK1/2 signaling | |
| Fang et al. | MicroRNA‐29b suppresses tumor angiogenesis, invasion, and metastasis by regulating matrix metalloproteinase 2 expression | |
| Neumann et al. | Rheumatoid arthritis progression mediated by activated synovial fibroblasts | |
| EP2374884A2 (en) | Human miRNAs isolated from mesenchymal stem cells | |
| Zhu et al. | Tumor necrosis factor receptor-associated factor (TRAF) 6 inhibition mitigates the pro-inflammatory roles and proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes | |
| CN111789835A (zh) | 一种抗动脉粥样硬化炎症的药物、抗炎作用检测方法 | |
| KR20140103122A (ko) | 신경교종을 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
| Wang et al. | CD301b+ macrophages mediate angiogenesis of calcium phosphate bioceramics by CaN/NFATc1/VEGF axis | |
| Ren et al. | Inflammatory osteoclasts‐derived exosomes promote bone formation by selectively transferring lncRNA LIOCE into osteoblasts to interact with and stabilize Osterix | |
| JP2021108661A (ja) | 軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造又は遺伝子デリバリーシステムにおけるＬｎｃＲＮＡ−３２５９８の応用 | |
| Chen et al. | The mechanisms of β-catenin on keloid fibroblast cells proliferation and apoptosis. | |
| CN116286996A (zh) | 一种靶向cxcl16+巨噬细胞的药物载体及其制备方法和应用 | |
| CN107028970A (zh) | miR‑1288在诊断或治疗骨关节炎疾病中的应用 | |
| CN104560997A (zh) | 抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用 | |
| CN104498498A (zh) | 抑制ADAM17基因的siRNA及其应用 | |
| CN104560999B (zh) | 抑制ADAMTS‑5基因的siRNA及其应用 | |
| CN104561000B (zh) | 抑制cd44基因的寡聚核酸及其应用 | |
| Duan et al. | Mesenchymal stem cell exosomes inhibit nucleus pulposus cell apoptosis via the miR-125b-5p/TRAF6/NF-κB pathway axis: Exosomes attenuate disc degeneration through the miR-125b/TRAF6/NF-κB axis | |
| CN105624325A (zh) | 肺腺癌的诊治标记物 | |
| EP2782930B1 (en) | Methods of regulating angiogenesis and compositions capable of same | |
| CN101955975A (zh) | 组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬化治疗应用 | |
| CN104450710B (zh) | 抑制myd88基因的寡聚核酸及其应用 | |
| Yao et al. | Activin A marks a novel progenitor cell population during fracture healing and reveals a therapeutic strategy | |
| CN113993588A (zh) | 癌治疗剂 | |
| CN101921763B (zh) | 抑制PAR-1基因表达的siRNA及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200914 Address after: 510663 unit 1302, 1303, unit C3 of innovation mansion, No. 182, science Avenue, science Avenue, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Patentee after: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Address before: 510663, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangdong, Guangzhou 190 Patentee before: GUANGZHOU INSTITUTES OF BIOMEDICINE AND HEALTH, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: No.7, tungda street, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Address before: 510663 unit 1302, 1303, unit C3 of innovation mansion, No. 182, science Avenue, science Avenue, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Patentee before: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210428 Address after: No.7, tungda street, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Patentee after: Agna biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No.7, tungda street, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee before: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211125 Address after: 510530 unit 101, building B, No.7, Houda street, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: Agna biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 510530 No.7, tungda street, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee before: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Patentee before: Agna biopharmaceutical Co., Ltd |
|
| TR01 | Transfer of patent right |