CN104557897B - 法舒地尔‑硫辛酸二联体的合成及其应用 - Google Patents

法舒地尔‑硫辛酸二联体的合成及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及合成法舒地尔‑硫辛酸二联体。具体结构如式(I)所示。本发明还提供上述二联体的合成路线。所述二联体可一定程度上提高法舒地尔血脑屏障透过率和神经保护作用，使其具有多靶点抗神经退行性疾病的作用。

Description

法舒地尔-硫辛酸二联体的合成及其应用
发明领域
本发明属于化合物的医药领域，涉及法舒地尔-硫辛酸二联体的制备方法以及应用范围，主要是应用于神经退行性疾病。
发明背景
神经退行性疾病包括阿尔茨海默病，帕金森氏症，亨廷顿舞蹈病等。这些疾病的病因目前还没有完全阐明，但是有确切的证据表明氧化应激、线粒体损伤、泛素-蛋白酶体功能障碍、兴奋性毒性以及炎症反应都参与神经退行性疾病的发病。基因组学和蛋白质组学的研究表明，这一系列的反应相互反应，共同促进神经退行性疾病的发生发展。随着系统生物学的不断发展人们发现，复杂疾病(如PD、AD等)并不是由单一信号通路所介导，而是由整个疾病网络所调控。基于疾病的网络药理学(Network pharmacology)理论，调控疾病网络某一节点的单靶点药物不能满足治疗复杂疾病的需求。“一药一靶点”(one-drug-one-targeted)的传统治疗模式，不是治疗复杂疾病的有效策略。针对诱发疾病的多个靶点、多个节点蛋白同时干预，开发“一药多靶”(one-drug-multiple-targeted)的药物，有望成为治疗神经退行性疾病更优的策略。
法舒地尔，又称HA-1077，是日本旭化成株式会社和名古屋大学药理学研究室合作开发的一种新型异喹啉磺胺衍生物。是临床上唯一可用的ROCK抑制剂。Rho/ROCK通路参与到神经元的许多功能活动中。有报道指出Rho/ROCK通路与中枢神经系统疾病的病理过程密切相关，因此Rho/ROCK通路成为了治疗中枢神经系统疾病的重要靶点。法舒地尔能够抑制血管上皮细胞内的肿瘤坏死因子-α诱导的组织因子的表达；激活中枢神经系统的内生神经干细胞，提高粒细胞集落刺激因子和星形胶质细胞刺激因子的水平；抑制细胞内钙的释放；扩张脑部血管；保护神经细胞；提高神经功能；且能促进轴突再生。对许多中枢神经系统疾病如蛛网膜下腔出血、帕金森氏症、阿尔茨海默病等都有潜在的治疗作用。但是法舒地尔在临床上的使用还是受到了一定的限制，主要原因是它扩张血管的作用太过强大，易导致低血压和颅内出血以及消化道出血等症状，并且中枢神经系统疾病要求药物易于透过血脑屏障，而法舒地尔的脂溶性低，血脑屏障透过率较低，影响它治疗作用的发挥。
硫辛酸(lipoic acid，LA)被誉为“万能抗氧剂”，是已知天然抗氧剂中效果最强的一种，。它是丙酮酸脱氢酶的辅助因子，也是代谢性抗氧剂，在生物体内可以转化为还原型的二氢硫辛酸(DHLA)，它的抗氧化能力包括：清除自由基和活性氧；螯合金属离子；与其他体内的抗氧剂作用。硫辛酸具有分子量低和两亲性的特点，使得它容易透过血脑屏障，从而在中枢神经系统发挥抗氧化作用，因此，它被认为是治疗神经退行性疾病的有效途径。但是硫辛酸的作用靶点较为单一，仅具有抗氧化作用，难以单独用于发病机制如此复杂的中枢神经系统疾病。近期，根据硫辛酸的这些特点科研工作者将硫辛酸与布洛芬、左旋多巴等联用，提高其血脑屏障透过率以及起到多靶点抗神经退行性疾病的作用。
公开号为CN 102188433A的中国专利文献提到法舒地尔与贝前列腺素制成复方制剂用于治疗肺动脉高压；公开号为CN 102204917A的中国专利文献提到法舒地尔与西地那非联用治疗肺高压；公开号为CN 103040738A的中国专利文献将法舒地尔与磷酸二氢钠、右旋糖酐40、蛋氨酸以及注射用水制成水溶液以减少法舒地尔的副作用。但是专利和科技文献都未见将法舒地尔与硫辛酸偶联形成二聚体，达到多靶点作用以及提高血脑屏障透过率降低不良反应的报道。
本发明旨在将具有ROCK抑制作用的法舒地尔和强抗氧化作用的硫辛酸偶联得到二聚体L-F 001，达到多靶点、改善法舒地尔的血脑屏障透过性，使得法舒地尔在脑内浓集和降低法舒地尔的不良反应的作用；此外，从患者角度出发，把法舒地尔和硫辛酸两种联合为一种，能适当增加患者的依从性，避免漏服，给患者带来福音。
发明概述
基于以上研究，结合作用于神经退行性疾病的不同靶点的药物要比单一靶点的治疗效果更好的特点，我们将具有ROCK抑制作用的法舒地尔和强抗氧化作用的硫辛酸相偶联，得到法舒地尔-硫辛酸的二联体L-F 001：
本发明的化合物其特征在于存在两个主要的单元：抗氧化部分和ROCK激酶抑制部分，他们通过酰胺键相连接，使得化合物L-F 001同时具有法舒地尔的ROCK抑制作用和硫辛酸的强抗氧化作用，并改善法舒地尔的血脑屏障透过性，使得法舒地尔在脑内浓集。
本发明涉及式(I)的化合物或其互变异构体，药用盐，前药或溶剂化物。
除非另外指明，本发明的化合物还意欲包括区别仅在于存在一个或多个同位素富集的原子的化合物。例如，具有本结构的除了用氘或氚替换氢，或者用13C或14C-富集的碳原子替换碳原子，或15N-富集的氮以为的化合物属于本发明的范围内。
属于“药用盐，衍生物，溶剂化物，前药”是指任何药用盐，酯，溶剂化物，或经施用于接受者后能够提供(直接或间接)本文所述化合物的其他化合物。然而，应当理解非药用盐也属于本发明的范围内，因为那些可能用于植被药用盐，盐，前药和衍生物的植被可以通过本领域已知的方法进行。例如，本发明提供的化合物的药用盐可以通过常规方法由母体化合物合成，该母体化合物含有碱或酸部分。通常，该盐例如通过将游离酸或碱形式的这些化合物与化学计算量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中制备。通常，非水性介质如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇或乙腈是优选的。酸加成盐的实例包括无机酸加成盐例如，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硫酸盐，硝酸盐，和有机酸加成盐，如例如乙酸盐，马来酸盐，富马酸盐，柠檬酸盐，草酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，苹果酸盐，扁桃酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐如例如钠，钾，钙，铵，镁，铝和锂盐；和有机碱如例如乙二胺，乙醇胺，N，N-二烷基乙醇胺，三乙醇胺，葡糖胺和碱性氨基酸盐。
优选的前药是相对于母体物质，当将这些化合物使用于患者时提高本发明化合物的生物利用度(例如通过使得口服给药的化合物更容易被吸收到血液中)或增强母体化合物向生物区室(例如脑或淋巴系统)的传递的那些。
式(I)化合物前药的任何化合物属于本发明的范围内，术语“前药”以其最广泛的意义使用并且包括在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。这些衍生物对于本领域技术人员是显而易见的，并且根据分子中存在的官能团，包括不限于本发明化合物的下列衍生物：酯；氨基酸酯；磷酸；金属盐硫酸；氨基甲酸酯和酰胺。
本发明的化合物可以是作为有利化合物或作为溶剂化物的晶体形式，意欲将两种形式都包括在本发明的范围内。溶剂化的方法是本领域公知的。适当的溶剂化物是药用溶剂化物。在一个具体实施方案中，溶剂化物是水合物。
反应路线列举了制备本发明的化合物的方法。
将硫辛酸(100mg)和法舒地尔盐酸盐(158mg)加入到干燥的25mL圆底烧瓶中，加入重蒸的二氯甲烷溶液(5mL)，三乙胺(0.18mL)和EDCI(140mg)。反应液在氩气保护下室温搅拌过夜后，加入乙酸乙酯(30mL)稀释，用饱和的氯化铵水溶液(3mL)终止反应。分离后，水相用乙酸乙酯(5mL×3)萃取。合并的有机相用饱和的食盐水(3mL×1)洗涤。在Na2SO4干燥后旋蒸除去溶剂，残留物经硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷1/30-1/10)得到黄色粘稠油状物。
如果需要，可以通过常规方法如结晶法或色谱法纯化反应产物。当用于制备本发明化合物的上述方法产生立体异构体的混合物时，这些异构体可以通过常规技术如制备色谱法分离。如果存在手性中心，化合物可能以外消旋形式制备，或者可以通过对映特异性合成或通过拆分来制备单个的对映异构体。
一种优选的药用形式是结晶形式，包括药物组合物中的这种形式。如果是盐和溶剂化物，另外的离子或溶剂部分也应当是非毒性。本发明的化合物可以存在不同的多晶型物，意欲本发明包括所有这些形式。
由上述发明式(I)表示的典型化合物，其盐，它们的溶剂化物或前药显示更强的血脑屏障透过率，相当的ROCK抑制作用、抑制应力纤维形成作用、提高内源性抗氧化蛋白谷胱甘肽的水平、神经保护作用以及温和的血管扩张作用。因此，本发明另一方面涉及治疗、改善或预防神经退行性疾病的方法，该方法包含向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药物组合物。在可以治疗的疾病中有神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森氏症、脑卒中等中枢神经系统疾病。
本发明另外提供药物组合物，其包含本发明的化合物，或其药用盐，衍生物，前药或立体异构体，以及药用载体，辅剂，或赋形剂，以用于向患者给药。
本发明的化合物和组合物可以与其它药物一起使用以提供联合治疗。其它药物可以形成相同组合物的一部分，或者可以作为同时或不同时给药的分开的组合物提供。
附图说明
附图1L-F 001与ATP口袋结合的方式。
附图2L-F 001/硫辛酸/法舒地尔对高糖刺激HT22细胞F-actin的影响
附图3L-F 001/硫辛酸/法舒地尔对预收缩血管环的舒张作用。血管环用KCl(A)和苯肾上腺素(phenylephrine，PE)(B)预收缩，接着用累加法加入不同剂量的药物。法舒地尔的扩张血管作用最为明显，而L-F 001扩血管作用弱于法舒地尔。附图4L-F 001对谷氨酸引起的活性氧产生的影响。a)正常组；b)谷氨酸；c)硫辛酸+谷氨酸；d)法舒地尔+谷氨酸；e)L-F 001+谷氨酸f)DCF荧光强度的定量分析.**P＜0.01，与正常组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，谷氨酸模型组比较。DCF染料能透过细胞膜与过氧化氢结合，生成绿色荧光，根据荧光强度就能判断活性氧的水平。
附图5L-F 001/硫辛酸/法舒地尔对GSH水平的影响。**P＜0.01，与正常组比较；##P＜0.01，###P＜0.001与谷氨酸组比较。
附图6L-F 001/硫辛酸/法舒地尔对谷氨酸模型的作用。图6表示的是将不同剂量的L-F 001/硫辛酸/法舒地尔(3μM，10μM，30μM)预处理细胞30min，再加入谷氨酸处理细胞24h，采用(A)MTT法检测细胞的存活率(B)并在倒置显微镜下拍照。**P＜0.01，与正常组比较；#P＜0.05，##P＜0.01与谷氨酸组比较。
图7L-F 001的浓度-时间曲线。
实施例
提供下列实施例进一步举例说明本发明，它们不应当认为是对本发明范围的限定。
实施例1：法舒地尔硫辛酸的合成
(R)-5-(1，2-二硫戊环-3-基)-1-(4-(异喹啉-5-基磺酰基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)戊-1-酮将硫辛酸(100mg)和法舒地尔盐酸盐(158mg)加入到干燥的25mL圆底烧瓶中，加入重蒸的二氯甲烷溶液(5mL)，三乙胺(0.18mL)和EDCI(140mg)。反应液在氩气保护下室温搅拌过夜后，加入乙酸乙酯(30mL)稀释，用饱和的氯化铵水溶液(3mL)终止反应。分离后，水相用乙酸乙酯(5mL×3)萃取。合并的有机相用饱和的食盐水(3mL×1)洗涤。在Na2SO4干燥后旋蒸除去溶剂，残留物经硅胶柱色谱纯化(甲醇/二氯甲烷1/30-1/10)得到黄色粘稠油状物(186mg，80％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.36(s，1H)，8.69-8.67(m，1H)，8.40(d，J＝6.1Hz，1H)，8.33(dd，J＝7.3，4.3Hz，1H)，8.22(dd，J＝8.2，3.3Hz，1H)，7.73-7.68(m，1H)，3.75-3.69(m，1H)，3.65-3.56(m，4H)，3.50-3.48(m，1H)，3.43(dd，J＝11.0，5.1Hz，3H)，3.36(t，J＝6Hz 1H)，3.21-3.05(m，3H)，2.48-2.41(m，2H)，2.31-2.19(m，2H)，2.00-1.96(m，5.5Hz，2H)，1.92-1.87(m，1H)，1.70-1.62(m，5H)，1.49-1.38(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ172.1，171.9，153.2，145.0，144.9，134.0，133.9，133.5，133.0，132.8，131.3，129.0，125.8，117.2，117.1，56.3，56.3，49.8，49.5，48.7，48.1，47.6，46.7，46.6，44.4，40.1，38.4，34.6，32.7，32.3，29.1，28.8，27.7，24.6，24.5；IR(KBr，cm-1)：υ2930，1640，1428，1326，1212，1146；LRMS([M+H]+)：480.2。
实施例2：计算机虚拟设计
从PDB检索到X-射线衍射的ROCK1晶型(PDB ID：2ESM)。它们之间的结合口袋用MOE(Molecular Operating Environment，Canada)和MOE自动对接算法预测。通过构效检索，找到30个优选的结合方式。引入这些结合方式来使能量最低以及结合的计算，最终得到最佳的结合方式。结合的能量以及键合方式通过MOE计算得到。从附图1可以看到，法舒地尔与L-F 001的异喹啉环都能与缬氨酸90残基形成π-π相互作用，法舒地尔的高哌嗪环能与天门冬氨酸160残基形成两个氢键作用，而接入LA之后，高哌嗪环的构象发生改变，不能再与天门冬氨酸160残基形成氢键作用，且多出的LA部分伸出口袋外，也并没有增加相互作用。
实施例3：生物学评估
二联体对多种蛋白激酶活性抑制作用
采用基于荧光共振能量转移的Z’-LYTE激酶法试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)测定化合物对ROCK 1(Rho kinase 1)，ROCK 2，PKA(protein kinase A，PKA)，PKG(proteinkinase G，PKG)激酶的IC50值。将待测化合物配置成10mM，再逐级3倍往下稀释，一共设置10个浓度。384孔板中每孔加入10μL反应液(包含2μM溶解在50mM HEPES，pH7.5，0.01％Brij-35，10mM MgCl2，1mM EGTA的短肽底物，和适量的ROCK 1，ROCK 2，PKA，PKG)和一系列3倍稀释的待测化合物。ATP的终浓度为75μM。1h的孵育之后，反应终止，根据说明书计算荧光比值。采用Prism 5.0拟合得到量效曲线，并计算IC50值。结果见附表1，可以看出L-F 001对ROCK 1和ROCK 2的抑制作用与法舒地尔相比，有所降低。
实施例4：生物学评估
二联体对应力纤维形成的影响
弃去旧培养液，振荡洗涤制作好的细胞爬片；4％多聚甲醛4℃固定15min；PBS洗涤，5min×3；0.5％Triton-L-F 001 100 4℃破膜15min；PBS洗涤，5min×3；80μl TRITC-philoidin(1μg/ml)室温孵育细胞1h；PBS洗涤，5min×3；Hochest33258(2μg/ml)染色15min，使用时避光；87％甘油封片，盖玻片细胞面朝下；指甲油封片；ZEISS激光共聚焦显微镜下观察。结果见附图2。
实施例5：生物学评估
二联体的血管舒张作用检测
采用血管环法检测L-F 001的血管舒张作用。快速去除大鼠胸主动脉，并在冰盒上冰的Krebs液中分离结缔组织；通入混合气体(95％O2，5％CO2)，调节气体速度，使基线保持平稳，将血管挂于5mL Krebs液的浴槽中，每15min换一次Krebs液；待平衡约30min后，换KCl(60mM)5mL，使血管达到最大的收缩值，并稳定15min，在换KCl(60mM)5mL，重复做2次；用苯肾上腺素(PE)刺激时，首先用KCL(60mM)刺激，10min后，换K-H液平衡10min，在加入PE(终浓度为1×10-6mM)。将血管重新平衡后，用累积法加入药物(3μM，10μM，30μM)；记录下预收缩时的最大张力以及每个药物加入后的张力，以便比较；结果见附图3。从图中可以看出硫辛酸无血管扩张作用，L-F 001血管扩张作用比法舒地尔温和，而法舒地尔强大的血管扩张作用在临床易引起不良反应，因此，L-F 001可能比法舒地尔具有更好的临床使用价值。
实施例6：生物学评估
二联体对自由基的清除作用
采用H2DCF-DA染色检测氧自由基的生成情况。HT-22细胞用DMEM+10％胎牛血清，并置于37℃，含5％CO2孵箱中。将细胞以合适的密度种在多聚赖氨酸包被的24孔板；待细胞贴壁后，分别用培养基配制好的硫辛酸/法舒地尔/L-F001(30μM)加入对应的孔中，处理30min后，加入2mM谷氨酸处理10h。收集细胞，并用H2DCF-DA染料孵育细胞15min左右，洗净H2DCF-DA染料，用流式细胞仪检测H2DCF-DA的荧光强度。结果见附图4。从图中可以看出，L-F001和硫辛酸都能够清除谷氨酸诱导的氧自由基的生成，而法舒地尔效果不明显。
实施例6：生物学评估
二联体对内源性抗氧化蛋白谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的影响
采用GSH测定的试剂盒检测L-F 001对内源性GSH的影响。HT-22细胞用硫辛酸/法舒地尔/L-F 001(30μM)处理30min后，加入2mM谷氨酸处理10h。收集细胞，方法参照南京建成GSH试剂盒进行测定，结果见附图5。从图中可以得到，法舒地尔不具有提高内源性抗氧化蛋白谷胱甘肽水平，而L-F 001和硫辛酸都能够明显升高谷胱甘肽水平，且L-F 001的作用强于硫辛酸。
实施例7：生物学评估
二联体抑制L-glutamate诱导细胞毒性作用
取对数生长期HT-22细胞，以0.25％胰酶消化后，完全培养基重悬，显微镜下细胞计数板计数并调整细胞浓度为10×104个/mL，接种96孔细胞培养板，100μL/孔，培养过夜，使细胞贴壁。将96孔板中培养基吸走，用硫辛酸/法舒地尔/L-F001(3，10，30μM)，加入到96孔板中，100μL/孔。预孵育30min后，加入2μL100mM L-glutamate。模型组不加待测化合物，直接加入2μL100mM L-glutamate。孵育24h后，每孔加入10μL5mg/mL MTT，孵育1h，弃去上清，加DMSO 100μL/孔，振荡使生成物formazan充分溶解，在酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长570nm。采用公式化合物促进细胞的存活率(％)＝100％*(A待测化合物-A模型组)/(A模型组-A空白)计算细胞存活率。结果见附图6。从结果可以看出，法舒地尔不具有神经保护作用，而硫辛酸和L-F 001都能够剂量依赖性逆转谷氨酸诱导的HT-22细胞的死亡。
实施例8：药动学评估
二联体的血脑屏障透过率
1.体外血脑屏障透过率
取4μl2％(PBL)溶液加于MAIPs4550的96孔板的疏水膜上，滴加过程中注意移液枪头勿接触膜表面以防破坏膜结构；迅速(10min内)定量吸取200μL待测样品液(0.1mg/mL)加入到96孔板中的膜上方作为给药池，膜另一侧加入200μl PBS(pH＝7.4)为接受池，注意保持接受液与膜的充分接触；室温静止120min后，小心移除给药池，用UV光谱仪测试接受池内化合物吸光度值(250-500nm)；吸取100μL待测样品液与100μL PBS充分混匀，作为理论平衡溶液，测试其吸光度值(250-500nm)，需要用acceptor板测试；根据公式计算logPe值：结果见附表2。logPe值大于4.8则表示化合物可能能够透过血脑屏障，小于1.7则表示化合物可能血脑屏障透过率较差。从表中的结果可以预测L-F 001能够透过血脑屏障，而法舒地尔的血脑屏障透过率则较差。
2.体内血脑屏障透过率
取SD大鼠6只，分为两组，分别灌胃给予L-F001、法舒地尔药液，给药剂量为30mg/kg。动物给药后5min后用10％水合氯醛麻醉，给药10min后剪断颈动脉取血，将血放尽后迅速取出脑组织。脑组织用甲醇1g∶5mL匀浆处理，取0.5mL置Ep管中离心，取上清液30μL，加入内标四氢巴马汀溶液各60μL，涡旋混合2min，13000rpm离心5min后，取出上清液，加入等体积水混匀，进样分析。精密吸取血浆样品30μL，加入内标四氢巴马汀溶液各60μL，涡旋混合2min，13000rpm离心5min后，取出上清液，加入等体积水混匀，进样分析。采用LC-MS/MS法测定大鼠血浆和组织中L-F 001的浓度。采用BDS Hypersil C18column(2.1×50mm，2.4μm，Thermo Scientific)进行分离，流动相：以乙酸铵(A)-0.05％甲酸和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，流速：0.25mL/min，。梯度洗脱：0-1.1min，90％A；1.1-1.2min，90％→15％A；1.2-3.3min，15％A；3.3-3.4min，15％→90％A。离子源为采用电喷雾正离子模式(ESI+)，碰撞电压电压分别为25V(L-F 001)和29V(法舒地尔)，58V(延胡索乙素)。以多反应监测(multiplereaction monitoring，MRM)方式进行扫描定量。结果见附表2。结果见附表3。从体内的血脑组织的比率可以看出。L-F 001在脑内的分布大于法舒地尔在脑内的分布，与体外推测的结果相符合。
实施例9：药动学评估
药动学实验
SD大鼠3只，灌胃给予L-F001药液，给药剂量为30mg/kg。动物给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12h从大鼠眼底静脉丛采血于肝素钠化Ep管，以8000rpm离心5min，分离血清，置于-20℃冷冻保存。检测药物浓度的方法同实施例9。L-F 001的药时曲线见附图7，其药动学参数见表3。
附表1化合物对不同蛋白激酶的抑制作用
附表2化合物的血脑屏障透过率，结果用均值±标准差表示
附表3L-F 001的药动学参数

Claims (4)

1.一种具有下述结构式的化合物或其药用盐
2.一种药物组合物，包括如权利1所述化合物或其药用盐类以及药学上可接受的药用载体或赋形剂。
3.权利要求1的化合物或其药用盐在制备治疗中枢神经系统退行性疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述中枢神经系统退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症或脑卒中。
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