CN104557879A

CN104557879A - 一种从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法

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Publication number: CN104557879A
Application number: CN201510036146.6A
Authority: CN
Inventors: 范培红; 闫晓丽; 唐嘉靖; 张春梅
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-01-23
Also published as: CN104557879B

Abstract

本发明公开了一种从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，步骤为：将火麻仁药材粉碎，过筛，加入石油醚常压过滤脱脂，滤渣用乙醇渗漉提取，合并提取液；再次脱脂后，用乙酸乙酯萃取，浓缩成浸膏；将浸膏柱层析，以甲醇-水梯度洗脱；洗脱液的浓缩浸膏用MCI柱层析进行脱色，以甲醇-水梯度洗脱，薄层层析检测，合并比移值相同流份，浓缩成浸膏；该浸膏用硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，合并流份，浓缩得浸膏；该浸膏甲醇溶解后作HPLC制备分离，收集Rt＝16min的流份，浓缩结晶，干燥，即得。发明的方法拓宽了化合物NeoechinulinA作为药用活性成分的来源，有利于开发新的基于SIRT1调节的防治神经退行性疾病的药物。

Description

一种从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法

技术领域

本发明涉及一种从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法,具体涉及一种从药用植物火麻仁中提取化合物Neoechinulin A的方法及其基于SIRT1调节的防治神经退行性疾病方面的应用，属于药物技术领域。

背景技术

Neoechinulin类化合物含三个特征结构区域：吲哚、二酮哌嗪、2-甲基-3丁烯-2-取代基，属于二酮哌嗪类吲哚生物碱。文献报道Neoechinulin A具有很好的抗阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)等神经退行性疾病的潜力，具体表现在：1)捕获活性氮自由基Peroxynitrite(ONOO^-)而发挥神经细胞保护作用。ONOO^-在阿尔茨海默症、帕金森病等神经退行性疾病的病理过程中发挥重要的角色(J Antibiot,2007,60(10):614–621)。2)抑制淀粉样肽Aβ42诱导的小胶质细胞的激活而调节AD相关的神经炎症过程。淀粉样肽沉积是阿尔茨海默症的主要病理标志之一，淀粉样肽可激活小胶质细胞介导的神经炎症和紊乱(Neuro Toxicology,2013,35:30–40)。

目前的文献报道表明，Neoechinulin A主要从多种不同来源的真菌代谢产物及少数药用植物中分离获得，真菌代谢产物如曲霉菌Aspergillus sp.(Chem Pharm Bull 2004,52:375–376),炭角菌Xylaria euglossa(J Antibiot,2005,58:268–270),海洋真菌Eurotium rubrum(Synlett，2006,5:677–680)，海藻内生菌Chaetomium globosum(JNat Prod,2006,69:1622–1625),浒苔共生真菌—蜡叶散囊菌Eurotium herbariorum(中国海洋药物,2013,32(1):37-45),豆科植物锦鸡儿(Caragana chamlagu Ham)根的内生真菌HB-1(天然产物研究与开发，2007，19：48-50)。药用植物如朝鲜白头翁Pulsatilla cernua(中草药，2013,44(23)：3264-3269)，贯众Cyrtomium fortunei(Nat Prod Res，27:2066-2068),旋覆花Inula hupehensis(天然产物研究与开发,2012,24(4):427-431)，仙人掌Opuntiadillenii(中国药物化学杂志，2013，23(2):120-126)；草乌Aconitum carmichaeli(专利申请号201410031796.7)。

在检索的诸多报道中，未见有以火麻仁作为来源提取化合物Neoechinulin A的报道。药用植物火麻仁(Fructus Cannabis)是桑科一年生草本植物火麻(Cannabis sativa L.)的干燥成熟果实，资源广泛，是世界长寿之乡广西巴马经常食用的“长寿汤”的主要食材，《神农本草经》列为上品，本草纲目称其“补中益气，久服肥健不老”。其是中药治疗老年痴呆的基本方中的常用中药之一(闫敬来.中医药治疗老年痴呆相关文献的用药规律研究,武汉：湖北中医学院,硕士学位论文,2007)。现代研究表明火麻仁提取物能改善D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆能力(北京师范大学学报(自然科学版),2003,39：386-389)，可预防化学药物如东莨菪碱等所致小鼠记忆学习能力损伤(Acta Pharma Sinica,2003,24(11):1137-1142)，给予动物火麻仁饮食，可抵制Aβ42毒性，具备阿尔茨海默症防治潜力(Moleculars and cells,2011,31:337-342),但文献缺乏其活性物质依据。

新近研究表明：III类组蛋白去乙酰化酶Sirtuin成员之一SIRT1，与衰老、代谢综合征、神经退行性疾病、肿瘤的发生相关，成为热门的药物设计靶标(Neurodegener Dis,2012,9:1–10)。研究表明激活SIRT1活性或上调SIRT1表达可发挥多靶点AD防治作用(Lancet Neurol,2011,10:275-279；Curr Opin Psychiatr,2012,25:226–230；Frontaging neurosci,2013,5:53)，SIRT1对AD多个病理通路具有调节作用：SIRT1可减少β-淀粉样肽和老年斑的产生(Cell,2010,142:320-332)，可降低神经元的神经缠结(Neuron,2010,67:953-966)，降低ROS水平，延缓神经退化(Nature,2009,460:87-591)，可抑制Aβ对小胶质细胞的激活，从而降低NF-κB信号介导炎症与神经毒性(J Bio Chem,2005,280:40364–40374)等，发现并发展SIRT1调节药物为AD的新疗法打开了大门(Trends Pharmacol Sci，2014,35(3):146-54)。

但在检索的诸多现有技术中，未见火麻仁或Neoechinulin A调节SIRT1作用报道，仍属于研究的空白，不利于药用植物进一步的研究和应用，因此，研究Neoechinulin A与SIRT1调节之间的相关性，进而开发SIRT1调节药物用于AD的治疗，是目前亟待解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的之一是提供一种从药用植物火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法。该方法首次从药用植物火麻仁中提取分离得到了二酮哌嗪类吲哚生物碱(化合物Neoechinulin A)，拓宽了化合物Neoechinulin A作为药用活性成分的来源。

本发明还提供了二酮哌嗪类吲哚生物碱在制备基于SIRT1调节的防治神经退行性疾病的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种防治神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物以含有药学有效量的二酮哌嗪类吲哚生物碱(化合物Neoechinulin A)为有效成分。

该药物组合物可以与药用辅料混合，以常规方法制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂或注射剂；给药形式为口服给药或注射给药。

所述的药用辅料为甘露糖醇、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、聚乙二醇或注射用溶剂中的一种或几种；

所述纤维素衍生物为结晶纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素钠；

所述注射用溶剂为水、乙醇或甘油。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

从药用植物火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，包括以下步骤：

(1)制备火麻仁脱脂总提取物：将火麻仁(Cannabis sativa L.)药材粉碎，粉碎后过80目筛，加入1-2倍体积(g/mL)的石油醚，于25℃-35℃条件下浸泡2h-4h，常压过滤脱脂，滤渣用3-6L的乙醇体积分数为70％-90％(v/v)乙醇-水，于室温下反复渗漉提取2-4次，每次1-3天，合并渗漉提取液,浓缩；提取浓缩液用石油醚萃取(1:1，v/v)再次脱脂后，再用3L-5L乙酸乙酯反复萃取，于30℃-50℃条件下减压浓缩成0.25g/mL的浸膏(50℃测)；

(2)分离：将上述乙酸乙酯萃取浸膏用反相常压色谱柱(ODS-A-HG，12nm，50μm)层析，以10％-100％(v/v)甲醇-水梯度洗脱；取60％(v/v)甲醇-水洗脱液的浓缩浸膏用MCI柱层析进行脱色，以40％-100％(v/v)甲醇-水梯度洗脱，用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚：乙酸乙酯3:7；显色剂为硫酸-香草醛溶液，合并比移值相同流份，减压浓缩成相对密度为0.51g/mL的浸膏(50℃测)；将上述浸膏用硅胶(100-200目)拌样，浸膏与硅胶的质量比为1:1；硅胶柱层析(200-300目,6×15cm)分离，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱(5:5-0:10)，薄层层析检测，合并石油醚-乙酸乙酯为(5-3)：(5-7)的流份，减压浓缩成0.5mg/mL的浸膏(50℃测)；

(3)纯化：将步骤(2)中最终得到的浸膏溶解在甲醇溶液中(5mg/mL),采用HPLC进行制备分离，以75％(v/v)的甲醇-水做流动相，收集保留时间Rt＝16min的流份，浓缩置于甲醇中析出白色结晶，得Neoechinulin A。

步骤(2)中，所述硫酸-香草醛溶液是将1g香兰素溶于100mL浓硫酸制得的溶液。

步骤(2)中，优选合并石油醚：乙酸乙酯4:6的流份。

本发明提取分离得到的化合物Neoechinulin A，分子式为C₁₉H₂₁O₂N₃，分子量为323；其结构式如下：

化合物Neoechinulin A在制备基于SIRT1调节的防治神经退行性疾病的药物中的应用。

Western blot实验表明化合物Neoechinulin A具有一定的SIRT1调节作用，同时细胞毒活性较低，在神经退行性疾病防治药物开发方面具有很好的应用前景。

培养Hek293T细胞，等细胞进入指数生长期时加入一定浓度的化合物Neoechinulin A，温育24小时，MTT法检测化合物的细胞毒性，在12.5-100μM浓度范围内未见明显细胞毒性。取药物处理24h的细胞，吸掉培养基，PBS洗至无培养基颜色，加适量细胞裂解试剂裂解后，取上清液用BCA试剂盒测蛋白浓度，之后加蛋白上样缓冲液，在100℃下变性后进行SDS－PAGE电泳、转膜、封闭，之后把PVDF膜放入小鼠来源Sirt1一抗稀释液中，4℃过夜，取出，用TBST洗膜后转移至二抗稀释液中，室温孵育1小时，取出，TBST洗膜3次。最后显影并处理结果。结果表明Neoechinulin A 50μM可明显促进Sirt1表达，具有SIRT1调节作用。

本发明的有益效果：

本发明首次从药用植物火麻仁中提取分离得到二酮哌嗪类吲哚生物碱(化合物Neoechinulin A)，通过本发明的提取分离方法拓宽了化合物Neoechinulin A作为药用活性成分的来源，也有助于揭示药用植物的作用机制。本发明还通过实验证明Neoechinulin A具有一定的SIRT1的调节作用，发现并发展了天然来源的SIRT1调节剂，为开发新型防治神经退行性疾病药物提供了新的方向。

附图说明

图1为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的¹H-NMR谱图；

图2为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的¹³C-NMR谱图；

图3为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的¹H-¹HCOSY谱图；

图4为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的HMBC谱图；

图5为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的HMQC图谱；

图6为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的HRESI-MS图谱；

图7为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的手性分析图谱；

图8为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的UV图谱；

图9为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的IR图谱。

图10为实施例1制备的化合物Neoechinulin A的纯度检测度。

图11为实施例5中Neoechinulin A的SIRT1调节活性

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

1.实验材料及仪器设备

火麻仁(广西省巴马县)；乙醇，石油醚，乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司)；氘代氯仿(青岛腾龙微博科技有限公司)；硅胶(200-300目，青岛海洋化工有限公司)；硅胶板(青岛硕远化工有限公司)；核磁共振分析仪(Bruker Avance)；傅里叶红外分光光度计仪(Nicolet Nexus470FT-IR Thermo公司)；1260高效液相仪(Agilent)

2.实施方式

实施例1：

将采自广西省巴马县的火麻仁(Cannabis sativa L.)粉碎，称取5.7Kg火麻仁,粉碎后过80目筛，加入1倍体积(g/mL)的石油醚，于25℃条件下浸泡2h,常压过滤，滤渣用6L的乙醇体积分数为70％乙醇-水，于室温下反复渗漉提取3次，每次3天，合并提取液；浓缩至500mL，得到的提取浓缩液用石油醚萃取后，再用3L乙酸乙酯反复萃取，于30℃条件下减压浓缩成0.25g/mL的浸膏(50℃测)；将上述乙酸乙酯萃取物用反相常压色谱柱(ODS-A-HG，12nm，50μm)层析，用10％,20％,40％,60％,70％,80％,90％,100％甲醇-水(v/v)梯度洗脱；将60％甲醇-水(v/v)洗脱浓缩浸膏再用MCI柱层析，以40％,60％,65％,100％甲醇-水(v/v)梯度洗脱，用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚：乙酸乙酯3:7；显色剂为硫酸-香草醛溶液(1g香兰素溶于100mL浓硫酸)，合并比移值相同流份，减压浓缩成相对密度为0.51g/mL的浸膏(50℃测)；将该浸膏以1倍量(100-200目)的硅胶拌样，硅胶柱层析(200-300目,6×15cm),以5:5,4:6,3:7,2:8,0:10石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，合并石油醚-乙酸乙酯4:6的流份，减压浓缩成0.5mg/mL的浸膏(50℃测)。将该浸膏用甲醇溶解(5mg/mL)，以75％甲醇-水(v/v)为流动相作HPLC制备，收集Rt＝16min的流份，除去甲醇和水后，置于甲醇中析出白色结晶，得化合物8.22mg。经HPLC分析，其纯度达96％。

对分离得到的白色结晶化合物进行分析，硅胶薄层层析(石油醚:乙酸乙酯3:7)显示为Rf＝0.61，喷硫酸香草醛显色剂显示黄色。

HRESI-MS:[M+H]⁺324.1710，分子式为C₁₉H₂₁O₂N₃。UVλ_max(甲醇)：225.9nm,291.7nm,333.2nm；IRγ_max(KBr)cm^-1：3448.92，3192.81，972.04,1687.13，1424.74，929.76，739.55，488.80；¹H-NMR(CDCl₃+CD₃OD，600MHz，ppm)：1.54(6H,m,18/19-H)，1.61(3H,d,20-H),4.31(1H,q，12-H)，5.21(2H,dd，17-H)，6.08(1H,dd,16-H),6.66(1H,s,14-H),7.19(1H,dd,5-H),7.16(1H,dd,6-H),7.23(1H,d,4-H),7.37(1H,d,7-H),7.49(1H,s,11-H),8.52(1H,s,1-H)。参考文献(Chem Pharm Bull,2004,52(3):375-376)可知，该化合物为Neoechinulin A。

但是，在碳谱中一些相应的位置出现一组信号，¹³C-NMR(CDCl₃+CD₃OD，151MHz,ppm):20.7/20.8(q,20-C),27.3(q,19-C),27.4(q,18-C),39.2/39.3(s,15-C),51.7/51.6(d,12-C),102.8/102.9(s,3-C),111.3(d,7-C),111.4(s,8-C),113.3(t,17-C),118.9(d,4-C),121.1(d,5-C),122.3(d,6-C),123.8/123.9(s,9-C),125.9/126.0(s,3a-C),134.3/134.4(s,7a-C),143.9/144.0(s,2-C),144.3(d,16-C),159.9/160.0(s,13-C),165.7/165.8(s,10-C)。根据碳信号，推测该化合物可能是一对同分异构体的混合物；测定其比旋光度，其值为[α]_D ²⁰＝-2.65(C＝0.2MeOH)，与文献(Molecules,2013,18:13245-13259)中[α]_D-60°(c 0.2,MeOH)相差较大，利用手性柱(CHIRALPAK AS-H)对该化合物分析，流动相：正己烷-异丙醇-二已胺(1mg^-1.ml)，先用正己烷：异丙醇：二已胺90:10:1/40洗脱40min后，改用80:20:1/20洗脱，在52min，55min出现两个峰，峰面积约为1:2(327nm下积分)，结果见图7，从而证明该化合物确为一对R/S同分异构体。

化合物鉴定中涉及的¹H-NMR、¹³C-NMR、¹H-¹HCOSY、HMBC、HMQC、HREI－MS、手性分析、UV、IR图谱见图1-9，¹H-NMR、¹³C-NMR数据见表1。

表1 (R/S)Neoechinulin A的¹H-NMR、¹³C-NMR数据(CDCl₃+CD₃OD,ppm,600MHz,150MHz)

实施例2

将采自广西省巴马县的火麻仁(Cannabis sativa L.)粉碎得4.5Kg,粉碎后过80目筛，加入1.5倍体积(g/mL)的石油醚，于30℃条件下浸泡3h,常压过滤，滤渣用4L80％乙醇-水(v/v)，于室温下反复渗漉提取2次，每次2天，合并提取液，浓缩至500mL；提取浓缩液用石油醚萃取后，再用4L乙酸乙酯反复萃取，于40℃条件下减压浓缩成0.25g/mL的浸膏(50℃测)；将上述乙酸乙酯萃取物用反相常压色谱柱(ODS-A-HG，12nm–50nm)层析，以20％,40％,60％,70％,80％,90％,100％甲醇-水(v/v)梯度洗脱；60％甲醇-水(v/v)洗脱浓缩浸膏再用MCI柱层析，用40％,60％,65％,100％甲醇-水(v/v)梯度洗脱，用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚：乙酸乙酯3:7；显色剂为硫酸-香草醛溶液，合并比移值相同流份，减压浓缩成0.51g/mL的浸膏(50℃测)；将该浸膏用1倍量(100-200目)的硅胶拌样，硅胶柱层析(200-300目，6×15cm)，以5:5,4:6,3:7,2:8,0:10石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，合并石油醚-乙酸乙酯5:5的流份，减压浓缩成相对密度为0.5mg/mL的浸膏(50℃测)。将该浸膏用甲醇溶解(5mg/mL)，以75％的甲醇-水为流动相作HPLC制备，收集Rt＝16min的流份，浓缩置于甲醇中析出白色结晶，得化合物Neoechinulin A 7.25mg。

实施例3

将采自广西省巴马县的火麻仁(Cannabis sativa L.)粉碎得3Kg,过80目筛，加入2倍体积(g/mL)的石油醚，于35℃条件下浸泡4h,常压过滤，滤渣用3L90％乙醇-水(v/v)，于室温下反复渗漉提取4次，每次4天，合并提取液,浓缩至500mL；提取浓缩液用石油醚萃取后，再用5L乙酸乙酯反复萃取，于50℃条件下减压浓缩成相对密度为0.25g/mL的浸膏(50℃测)；将上述乙酸乙酯萃取物用反相常压色谱柱(ODS-A-HG，12nm–50nm)层析，以20％,40％,60％,70％,80％,90％,100％甲醇-水(v/v)梯度洗脱；60％甲醇-水(v/v)洗脱浓缩浸膏再用MCI柱层析，以40％,60％,65％,100％甲醇-水(v/v)梯度洗脱，用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚：乙酸乙酯3:7；显色剂为硫酸-香草醛溶液，合并比移值相同流份，浓缩成浸膏；将该浸膏用0.1倍量(100-200目)的硅胶拌样，硅胶柱层析(200-300目，6×15cm)，以5:5,4:6,3:7,2:8,0:10石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，合并石油醚-乙酸乙酯3:7的流份，减压浓缩成相对密度为0.5mg/mL的浸膏(50℃测)。将该浸膏用甲醇溶解(5mg/mL)，以75％的甲醇-水(v/v)为流动相作HPLC制备，收集Rt＝16min的流份，浓缩置于甲醇中析出白色结晶，干燥后得化合物Neoechinulin A 6.60mg。

实施例4：活性实验

Neoechinulin A的细胞毒性与SIRT1调节活性

1.细胞毒性检测：

(1)实验材料：

HeK293T细胞珠(山东大学医学院)；DMEM培养液：89％DMEM(美国Hyclone公司),10％胎牛血清(美国Gibco公司)，1％青霉素-链霉素溶液(100X，中国赛尔斯公司)；胰蛋白酶(美国Amresco公司)；MTT(四甲基偶氮唑，美国Sigma公司)，DMSO(二甲基亚砜，美国Sigma公司)；PBS(磷酸盐缓冲液，鼎国昌盛有限公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；紫外分光光度计(Bio-Rad公司)

(2)实验方法：

DMEM培养液培养Hek293T细胞，待细胞长至70％-80％时，弃去培养基，用胰蛋白酶消化，将细胞收集到含血清的培养基中，离心细胞悬液。用培养基重悬细胞，计数。将细胞稀释至5×104个/ml，用加样器按照每孔100μl细胞悬液加入96孔板中。将96孔板放于孵箱(37℃，5％CO2)中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可用于药物细胞毒性检测。待测药物储备液(DMSO配制)用培养基2倍系列依次稀释，共制备4个浓度(12.5μM,25μM,50μM,100μM)，将Neoechinulin A加入含细胞的96孔板中，每个浓度做5个复孔，以等体积新鲜配制的培养基做对照，继续在孵箱温育24小时，之后加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续孵育4小时，将96孔板中的培养基和MTT吸出，每孔中各加入200μl DMSO，在570nm处记录吸光值。

(3)实验结果：

结果所测4个浓度均未显示明显细胞毒性(细胞生长抑制率均<2％)。

2.SIRT1调节活性：

(1)实验材料：

RIPA(细胞裂解液，北京solarbio公司)；Tris碱(三羟甲基氨基甲烷，北京solarbio公司)；PMSF(美国Amresco公司)；Aprotinin(蛋白酶抑制剂，北京Ruitaibio公司)；Glycine(甘氨酸，北京Ruitaibio)；PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜，美国Millipore公司)；HRP发光液(美国Millipore公司；过硫酸铵(APS，美国Sigma公司)；TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺，济南朋远生物公司)；SDS(十二烷基磺酸钠，济南朋远生物公司)；30％丙烯酰胺(Acrylamide，碧云天生物技术公司)；BCA试剂(碧云天生物技术公司)；Tween-20(天津市光复精细化工研究所)；小鼠来源Sirt1一抗，小鼠来源β-actin一抗(美国CellSignalling公司)；HRP标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥有限公司)；凝胶成像仪(AlphaInnotech公司)

(2)实验方法：

DMEM培养液培养Hek293T细胞，给予浓度梯度为10μM/L,25μM/L,50μM/L的Neoechinulin A溶液(DMSO配制)，每个浓度重复三次，给药24h后，吸掉培养基，PBS洗3遍至无培养基颜色，加适量细胞裂解试剂。在冰上裂解2分钟后刮下细胞，转移至EP管并放在在0℃全温金属浴上继续裂解30分钟且每十分钟吹打一次，离心，取上清液。上清液用BCA试剂盒测蛋白浓度后加蛋白上样缓冲液，在100℃下变性10分钟，备用。将制备好的蛋白样品依次上样进行SDS－PAGE电泳，先用90V电压压缩30分钟后换成130V继续电泳90分钟。之后将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜(PVDF膜)上：

PVDF膜预先用甲醇活化2分钟，将PVDF膜铺在凝胶上，赶走所有的气泡后放入电泳装置中，电流200mA转膜50分钟。转膜结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。将膜放入牛奶溶液(1g脱脂奶粉/20ml TBST)中室温封闭4小时。把PVDF膜放入一抗稀释液(小鼠来源Sirt1一抗或小鼠来源β-actin一抗)中孵育，4℃过夜。取出，用TBST洗膜3次后转移至二抗(HRP标记山羊抗兔IgG)稀释液中，室温孵育1小时，取出，TBST洗膜3次。打开显影仪与imagelab软件，将PVDF膜铺展于显影仪显影板面上，HRP发光液中两试剂按体积比1:1混合(避光)后浸润PVDF膜，显影并处理结果。

(3)实验结果：

结果显示Neoechinulin A可浓度依赖性促进细胞SIRT1表达，见附图11，说明化合物Neoechinulin A具有基于SIRT1调节的防治神经退行性疾病潜力。

Claims

1.一种从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备火麻仁脱脂总提取物：将火麻仁药材粉碎，过筛，加入1-2倍体积的石油醚，于25℃-35℃条件下浸泡2h-4h，过滤脱脂，滤渣用1.5-2.5L的乙醇体积分数为70％-90％的乙醇-水于室温下反复渗漉提取2-4次，每次1-3天，合并提取液；浓缩后用石油醚萃取再次脱脂后，再用乙酸乙酯萃取，于30℃-50℃条件下减压浓缩成浸膏；

(2)分离：将步骤(1)的乙酸乙酯萃取浸膏用反相常压色谱柱层析，以甲醇-水梯度洗脱；60％洗脱浓缩浸膏用MCI柱层析进行脱色素，以甲醇-水梯度洗脱，用硅胶薄层层析检测，合并比移值相同流份，浓缩成0.51g/mL浸膏；浸膏用硅胶拌样,硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并石油醚-乙酸乙酯为(5-3)：(5-7)的流份，浓缩得浸膏；

(3)纯化：将步骤(2)中最终得到的浸膏用甲醇溶解,以甲醇-水作流动相,进行HPLC制备分离，收集Rt＝16min的流份，浓缩置于甲醇中析出白色结晶，干燥，即得。

2.如权利要求1所述的从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，步骤(2)中，反相常压色谱柱层析所用的甲醇-水梯度洗脱液中，甲醇的体积分数的梯度范围为10％-100％。

3.如权利要求1所述的从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶薄层层析检测所用的展开剂为石油醚：乙酸乙酯3:7；显色剂为硫酸-香草醛溶液。

4.如权利要求3所述的从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述硫酸-香草醛溶液是将1g香兰素溶于100mL浓硫酸制得的溶液。

5.如权利要求1所述的从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶柱层析拌样用浸膏与硅胶的质量比为1:1，硅胶的目数为100-200目。

6.如权利要求1所述的从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶柱层析所用的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱液中，石油醚与乙酸乙酯的体积比的梯度范围为5:5-0:10。

7.如权利要求1所述的从火麻仁中提取分离二酮哌嗪类吲哚生物碱的方法，其特征在于，步骤(2)中，合并硅胶柱层析中洗脱液石油醚：乙酸乙酯为4:6的流份。

8.权利要求1至7任一项所述的方法制备得到的二酮哌嗪类吲哚生物碱，其特征在于，该二酮哌嗪类吲哚生物碱为化合物Neoechinulin A。

9.权利要求8所述的二酮哌嗪类吲哚生物碱在制备基于SIRT1调节的防治神经退行性疾病的药物中的应用。

10.一种防治神经退行性疾病的药物组合物，其特征在于，该药物组合物以含有药学有效量的权利要求8的二酮哌嗪类吲哚生物碱为有效成分。