CN104549085B - 一种抗氧化酶纳米胶囊及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗氧化酶纳米胶囊及其制备方法与应用。该制备方法，包括如下步骤：(1)抗氧化酶的表面修饰：将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的有机溶剂滴加到抗氧化酶的磷酸缓冲溶液中，经丙烯酰化完成所述抗氧化酶的表面修饰；(2)原位自由基聚合：惰性气氛下，将单体、交联剂和引发剂加入到经表面修饰的抗氧化酶溶液中，经原位自由基聚合即可得到。本发明抗氧化酶纳米胶囊具有表面官能性、环境稳定性、高效催化性和自由基清除性；通过EDC-NHS活化将所述抗氧化酶纳米胶囊固定在所述卷烟的滤嘴上，具有优异的清除烟气中自由基的效果；将其制备成气雾剂，可协同清除烟气自由基，预防或缓解吸烟后肺部疾病的发生。

Description

一种抗氧化酶纳米胶囊及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种抗氧化酶纳米胶囊及其制备方法与应用，特别涉及一种抗氧化酶纳米胶囊及其制备方法与在清除卷烟烟气自由基中的应用。
背景技术
众所周知，吸烟有害健康。随着近年来有关吸烟和健康的研究发现，每支卷烟在燃烧时产生约1×1016个自由基，这些自由基是引起各种疾病的重要原因。烟气中的自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团，易与其他物质发生氧化还原等反应而形成稳定的物质。大多数自由基的性质极为活泼，具有很高的反应活性，参与大量的化学反应。烟气中自由基的直接毒性会产生DNA损伤、生物膜氧化损伤和神经损伤等病理生物学作用；其间接毒性是可在体内激活和产生大量活性更高、毒性更大的其他自由基，如超氧自由基和羟基自由基，从而最终导致细胞的损伤和疾病的发生。据报道多种癌症、肺气肿、呼吸道疾病和心血管疾病均与之有关。为了减少烟气中自由基对吸烟者的危害，烟草行业对烟草自由基的研究主要侧重于自由基的降低，在国内外烟草界已有很多研究者做了这方面的工作。然而由于烟气温度很高(50～60℃)且通过卷烟滤嘴的时间很短，这就使得自由基清除剂必须同时满足热稳定性好以及反应速率快等特性。
近年来，在去除卷烟烟气中自由基的研究上取得了一些进展。目前主要的清除方式是在滤嘴或烟丝中添加抗氧化剂，包括天然植物提取物和矿物质等。但是这些抗氧化剂反应速率低，并且长期放置后对自由基的清除效果会受到影响。因此，寻找新型、廉价、稳定、高效、缓释的活性物质用于清除卷烟烟气中的气相自由基是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗氧化酶纳米胶囊及其制备方法与应用，该抗氧化酶纳米胶囊具有表面官能性、环境稳定性和高效催化性，可有效清除卷烟烟气中的自由基。
本发明提供的抗氧化酶纳米胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗氧化酶的表面修饰：将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺在有机溶剂中形成的溶液滴加到抗氧化酶的磷酸缓冲溶液中，经丙烯酰化完成所述抗氧化酶的表面修饰；
(2)原位自由基聚合：在惰性气氛下，将单体、交联剂和引发剂加入到经表面修饰的抗氧化酶溶液中，经原位自由基聚合得到所述抗氧化酶纳米胶囊；
所述单体为丙烯酰胺或烷基丙烯酰胺。
此外，为了进一步减轻烟气中自由基对人体的损伤，将上述抗氧化酶纳米胶囊制成气雾剂，可以起到协同清除烟气自由基的作用。本发明进一步提供了抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗氧化酶的表面修饰：将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺在有机溶剂中形成的溶液滴加到抗氧化酶的磷酸缓冲溶液中，经丙烯酰化完成所述抗氧化酶的表面修饰；
(2)原位自由基聚合：在惰性气氛下，将单体、交联剂和引发剂加入到经表面修饰的抗氧化酶溶液中，经原位自由基聚合得到抗氧化酶纳米胶囊；
所述单体为具有双键的可聚合基团的有机物，所述可聚合基团为乙烯基、丙烯酰基、丙烯酰氨基、烷基丙烯酰基、烷基丙烯酰氨基、甲基丙烯酰基和甲基丙烯酰氨基中的任一种；
(3)将所述抗氧化酶纳米胶囊与抛射剂混合后装入耐压容器中即得抗氧化酶纳米胶囊气雾剂；
所述抛射剂的质量占所述抗氧化酶纳米胶囊和所述抛射剂总质量的6％～8％，具体可为6％或8％；所述抛射剂为氢氟烷烃类、碳氢化合物类和二甲醚中的任一种。
上述抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法中，所述单体可为中性的、中性亲水的、疏水的、带正电荷的或带负电荷的。
上述抗氧化酶纳米胶囊或抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法中，步骤(1)中，所述抗氧化酶表面的氨基与所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺发生丙烯酰化，在酶的表面修饰上乙烯基团；步骤(2)中，通过原位自由基聚合，在经过表面修饰的抗氧化酶的外层形成一层聚合物，形成核壳结构的纳米胶囊。所述抗氧化酶与外层的聚合物通过共价键连接，可有效防止酶分子热伸展变性而导致解离，并且在较高的温度下，包裹在外层的高分子聚合物可以有效的保护酶的活性中心，抑制了酶蛋白分子的自降反应，可增强包埋的抗氧化酶的耐热性。
上述抗氧化酶纳米胶囊或抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法，步骤(1)中，所述抗氧化酶与所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的质量比可为1：1～20：1，具体可为1：1或20：1；
所述抗氧化酶在所述磷酸缓冲溶液中的浓度可为0.2～60mg/mL，具体可为0.26mg/mL～52mg/mL、0.26mg/mL～26mg/mL、26mg/mL～52mg/mL；所述磷酸缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值可为7，浓度可为1～200mM，具体可为1～100mM、100～200mM、1mM、100mM或200mM；
所述抗氧化酶为过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶中的至少一种。抗氧化酶能够高效催化氧化还原反应，是目前已知几乎所有好氧生物体内最重要的抗氧化屏障。其中过氧化氢酶在有过氧化物的条件下，能迅速催化降解烟气中的氮氧化物，破坏气相自由基的反应链，从而降低烟气中气相自由基的含量；并且其蛋白质分子中的血红素基团能特异性吸附CO、NO等小分子有害气体，可有效清除卷烟气相自由基；
所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的浓度为0.3～35mg/mL，具体可为3.3～33.3mg/mL、3.3mg/mL～16.6mg/mL、16.6mg/mL～33.3mg/mL、3.3mg/mL、16.6mg/mL或33.3mg/mL；所述有机溶剂为二甲基亚砜。
上述抗氧化酶纳米胶囊或抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法，步骤(1)中，所述丙烯酰化的温度为10～50℃，具体可在10～30℃、30～50℃、10℃、30℃或50℃下进行；所述丙烯酰化的时间为1～5h，具体可为2小时；
所述丙烯酰化之后还包括将反应后的混合溶液进行透析的步骤；
所述透析采用截留分子为3500的透析袋，在所述磷酸缓冲溶液中进行，具体可在4℃下透析过夜。
上述抗氧化酶纳米胶囊或抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法，步骤(2)中，所述惰性气氛具体可为氩气气氛；
具有两个或更多个可聚合基团的化合物均可作为交联剂，一般而言，可以使用任何交联化合物，只要该交联剂上的可聚合基团能够与表面修饰过的抗氧化酶以及聚合单体单元发生聚合反应，形成交联的共聚物，具体可为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、1,1,1-三(丙烯酰氧甲基)丙烷和2,2,2-三(丙烯酰氧甲基)乙醇中至少一种；
所述引发剂为过硫酸铵和/或四甲基乙二胺，具体为过硫酸铵和四甲基乙二胺形成的氧化还原体系。
上述抗氧化酶纳米胶囊或抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法，步骤(2)中，所述原位自由基聚合之前，还包括将所述透析之后的酶溶液稀释至0.1～20mg/mL的步骤，具体可稀释至0.1～10mg/mL、10～20mg/mL、0.1mg/mL、10mg/mL或20mg/mL；
所述原位自由基聚合的温度可为20～60℃，具体可为30℃；所述原位自由基聚合的时间可为1～5h，具体可为2小时；
所述原位自由基聚合之后还包括所述透析的步骤。
上述抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法的制备方法，步骤(3)中，所述抛射剂为氢氟烷烃类(HFC)、碳氢化合物类和二甲醚中的任一种，所述氢氟烷烃类(HFC)为氟利昂的一种，是一种常用抛射剂；所述碳氢化合物类即烷烃类，常用的有丙烷、正丁烷或异丁烷。
本发明进一步提供了上述方法制备的抗氧化酶纳米胶囊或上述方法制备的抗氧化酶纳米胶囊气雾剂。
上述抗氧化酶纳米胶囊或抗氧化酶纳米胶囊气雾剂可应用于清除卷烟烟气自由基。
将上述抗氧化酶纳米胶囊应用于清除卷烟烟气，具体可通过制备抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物，从而将所述抗氧化酶纳米胶囊固定在卷烟烟嘴上。
上述抗氧化酶纳米胶囊气雾剂可协同清除烟气自由基，预防或缓解吸烟后肺部疾病的发生，例如癌症、肺气肿、呼吸道疾病和心血管疾病。
本发明进一步提供了一种利用上述抗氧化酶纳米胶囊制备抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的方法，包括如下步骤：
将醋酸纤维素置于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和所述抗氧化酶纳米胶囊的混合水溶液中，经反应得到所述抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物。
上述抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备方法中，通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)-NHS(N-羟基丁二酰亚胺)活化将醋酸纤维素膜上的羧基和抗氧化酶纳米胶囊表面富余的氨基通过共价键连接起来，使得抗氧化酶纳米胶囊不易从纤维素上脱落，最终将所述抗氧化酶纳米胶囊固定在所述卷烟滤嘴上。此种固定方式不但不会破坏酶的二级结构而保持酶的活性，而且相比物理吸附，共价键作用力更强，使得清除剂不易从烟嘴上脱落。
上述抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备方法中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度可为1～200mM，具体可为1～100mM、100～200mM、1mM、100mM或200mM；
所述N-羟基丁二酰亚胺的摩尔浓度可为1～50mM，具体可为1～30mM、30～50mM、1mM、30mM或50mM；
所述抗氧化酶纳米胶囊的质量体积浓度可为0.1～100mg/mL，具体可为0.1mg/mL、10mg/mL或100mg/mL；
所述反应的温度可为0～50℃，具体可为0℃～4℃、4℃～50℃、0℃、4℃或50℃；反应时间可为1～20h，具体可为1～10h、10～20h、1h、10h或20h。
本发明提供了上述方法制备的抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物，该抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物结构稳定，可应用于清除卷烟烟气中自由基或作为卷烟滤嘴，具有优异的自由基清除效果。
本发明具有如下优点：
1、本发明抗氧化酶纳米胶囊具有表面官能性、环境稳定性、高效催化性和自由基清除性。
2、本发明通过EDC-NHS活化将所述抗氧化酶纳米胶囊固定在所述卷烟的滤嘴上，不但可以保持酶的活性，而且通过共价键作用力固定可使所述抗氧化酶纳米胶囊不易脱落，达到优异的清除烟气中自由基的效果。
3、将本发明抗氧化酶纳米胶囊制备成气雾剂，可协同清除烟气自由基，预防或缓解吸烟后肺部疾病的发生。
4、相比于口服剂型，本发明制备的气雾剂具有起效迅速，服用方便等特点，更适合应用于预防吸烟后肺部疾病的发生。
附图说明
图1为本发明抗氧化酶纳米胶囊的制备过程及应用示意图。
图2为实施例1中过氧化氢酶纳米胶囊的TEM照片。
图3为实施例1中过氧化氢酶和过氧化氢酶纳米胶囊的粒径大小分布图，其中，曲线a表示过氧化氢酶的粒径大小分布，曲线b表示过氧化氢酶纳米胶囊的粒径大小分布。
图4为实施例1中过氧化氢酶和过氧化氢酶纳米胶囊在65℃下过氧化氢酶的相对活性随时间的变化曲线，其中曲线a表示过氧化氢酶纳米胶囊的变化曲线，曲线b表示过氧化氢酶的变化曲线。
图5为实施例2中过氧化氢酶和过氧化氢酶纳米胶囊在65℃下过氧化氢酶的相对活性随时间的变化曲线，其中曲线a表示过氧化氢酶纳米胶囊的变化曲线，曲线b表示过氧化氢酶的变化曲线。
图6为实施例3中过氧化氢酶和过氧化氢酶纳米胶囊在65℃下过氧化氢酶的相对活性随时间的变化曲线，其中曲线a表示过氧化氢酶纳米胶囊的变化曲线，曲线b表示过氧化氢酶的变化曲线。
图7为实施例4未处理的纤维素和过氧化氢酶/醋酸纤维素纳米复合物的SEM照片，其中，照片A为未处理的纤维素的SEM照片，照片B为过氧化氢酶/醋酸纤维素纳米复合物的SEM照片。
图8为自制单通道模拟吸烟及烟气收集装置组合结构示意图。
图9为单根卷烟主流烟气的气相自由基EPR谱图，其中，谱线a表示空白条件下的烟气自由基的EPR谱图，谱线b表示将过氧化氢酶原酶处理后的烟气自由基的EPR谱图，谱线c表示实施例4烟气自由基的EPR谱图，谱线d表示实施例5烟气自由基的EPR谱图，谱线e表示实施例6烟气自由基的EPR谱图，图中每竖线长度大小代表强度为40000。
图10为单根卷烟主流烟气气相自由基EPR谱图，其中，谱线a表示实施例7烟气自由基的EPR谱图，谱线b表示实施例8烟气自由基的EPR谱图，谱线c表示实施例9烟气自由基的EPR谱图，图中每竖线长度大小代表强度为20000。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：过氧化氢酶纳米胶囊的制备
(1)过氧化氢酶的表面修饰
将1mg的过氧化氢酶溶解在3.8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(1mM，pH7.0)中，将1mgN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)溶解在300μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后向酶溶液中逐滴加入，在10℃条件下反应2h。将溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(1mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的NAS。
(2)原位自由基聚合
将透析后的酶溶液浓度稀释至0.1mg/mL,然后将1mg单体丙烯酰胺(AAM)和1mgN，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)逐滴加入到上述稀释的酶溶液中，30℃下搅拌溶解，通氩气30分钟。接着加入1mg过硫酸铵(APS)引发剂和1μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应，在30℃和氩气氛围下反应2h。反应结束后，将反应后溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(1mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的小分子，然后真空干燥一天获得过氧化氢酶的纳米胶囊粉末产品待用。
(3)过氧化氢酶纳米胶囊的TEM和DLS表征：
上述制备得到的过氧化氢纳米胶囊的结构和形态如图2，可看出单个过氧化氢酶纳米胶囊的粒径大小为20nm左右，呈现球形的形貌特征且大小分布比较均匀。此外，通过动态光散射(DLS)如图3所示，游离的过氧化氢酶的粒径大小约为10nm，单分散，过氧化氢酶纳米胶囊的粒径大小20nm，单分散。
由以上结果可知，经过纳米胶囊固定化的过氧化氢酶，其粒径大小明显增大。这种粒径大小的变化，表明经过纳米胶囊固定化处理，在过氧化氢酶外部成功包裹了一层聚丙烯酰胺聚合物。
(4)过氧化氢酶纳米胶囊中过氧化氢酶的热稳定性
将游离的未经修饰的原酶(过氧化氢酶)和上述制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊在65℃条件下进行孵育，然后在不同时间分别点取出样品进行催化活性的测试。具体通过采用分光光度法测量H2O2在240nm处吸光值的降低对过氧化氢酶的活性进行测定(H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度A240随反应时间而降低，根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性)，操作如下：
取0.6mL30％过氧化氢溶液稀释至100mL配制成底物溶液。用移液管将1.0mL底物溶液和1.9mL蒸馏水滴入1cm比色皿，并调节水温至25℃。为检查不加酶的情况下吸光度是否也降低，在240nm处以蒸馏水为参比测定吸光度。若吸光度的降低幅度超过0.01，则在计算时减去此值。取另一比色皿，分别加入上述溶液，并0.1mL酶液，在240nm处以蒸馏水为参比连续测定5min的吸光度。酶活按下式计算：
U/mg＝(E240×3)/(Ew×0.0436)
式中：U为过氧化氢酶活力，其定义为：在pH7.0，25℃条件下，过氧化氢酶在1min内分解1μmolH2O2的量为一个酶活力单位；E240为240nm处每分钟内吸光度的降低值；Ew为每0.1mL所用酶液中含酶的重量(mg)；3为反应混合液的总体积(mL)；0.0436为240nm处1μmolH2O2的吸光度。
图4为游离的原酶和经固定化的酶的相对活性(酶的相对活性＝酶在某时刻的活性/酶的初始活性)随时间的变化曲线。由图4可知，在高温的条件下，游离的原酶随着时间的推移，其活性连续不断快速的损失，并且在65℃条件下，孵育60分钟后就失去了其所有的活性；而经纳米胶囊固定化的过氧化氢酶，在初始的20分钟损失了部分活性，在随后的时间内都一直保持其相对催化活性在50％左右，这说明经包埋的过氧化氢酶的耐热性明显增强。
实施例2、过氧化氢酶纳米胶囊的制备
(1)过氧化氢酶的表面修饰
将100mg的过氧化氢酶溶解在3.8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(100mM，pH7.0)中，将5mgN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)溶解在300μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后向酶溶液中逐滴加入，在30℃条件下反应2h。将溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(100mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的NAS。
(2)原位自由基聚合
将透析后的酶溶液浓度稀释至10mg/mL，然后将100mg单体丙烯酰胺(AAM)和100mgN，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)逐滴加入到上述稀释的酶溶液中，30℃下搅拌溶解，通氩气30分钟。接着加入30mg过硫酸铵(APS)引发剂和30μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应，在30℃和氩气氛围下反应2h。反应结束后，将反应后溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(100mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的小分子，然后真空干燥一天获得过氧化氢酶的纳米胶囊粉末产品待用。
(3)过氧化氢酶纳米胶囊的TEM和DLS表征结果与实施例1一致。
(4)过氧化氢酶纳米胶囊中过氧化氢酶的热稳定性
将游离的未经修饰的原酶(过氧化氢酶)和上述制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊在65℃条件下进行孵育，然后在不同时间分别点取出样品进行催化活性的测试，其中催化活性的测试方法与实施例1相同。实验结果如图5所示，为游离的原酶和经固定化的酶的相对活性(酶的相对活性＝酶在某时刻的活性/酶的初始活性)随时间的变化曲线。由图5可知，在高温的条件下，游离的原酶随着时间的推移，其活性连续不断快速的损失，并且在65℃条件下，孵育60分钟后就失去了其所有的活性；而经纳米胶囊固定化的过氧化氢酶，在初始的20分钟损失了部分活性，在随后的时间内都一直保持其相对催化活性在20％左右，这说明经包埋的过氧化氢酶的耐热性明显增强。
实施例3、过氧化氢酶纳米胶囊的制备
(1)过氧化氢酶的表面修饰
将200mg的过氧化氢酶溶解在3.8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(200mM，pH7.0)中，将10mgN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)溶解在300μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后向酶溶液中逐滴加入，在50℃条件下反应2h。将溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(200mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的NAS。
(2)原位自由基聚合
将透析后的酶溶液浓度稀释至20mg/mL，然后将200mg单体丙烯酰胺(AAM)和200mgN，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)逐滴加入到上述稀释的酶溶液中，30℃下搅拌溶解，通氩气30分钟。接着加入50mg过硫酸铵(APS)引发剂和50μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应，在30℃和氩气氛围下反应2h。反应结束后，将反应后溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(200mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的小分子，然后真空干燥一天获得过氧化氢酶的纳米胶囊粉末产品待用。
(3)过氧化氢酶纳米胶囊的TEM和DLS表征结果与实施例1一致。
(4)过氧化氢酶纳米胶囊中过氧化氢酶的热稳定性
将游离的未经修饰的原酶(过氧化氢酶)和上述制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊在65℃条件下进行孵育，然后在不同时间分别点取出样品进行催化活性的测试，其中催化活性的测试方法与实施例1相同。实验结果如图6所示，为游离的原酶和经固定化的酶的相对活性(酶的相对活性＝酶在某时刻的活性/酶的初始活性)随时间的变化曲线。由图6可知，在高温的条件下，游离的原酶随着时间的推移，其活性连续不断快速的损失，并且在65℃条件下，孵育60分钟后就失去了其所有的活性；而经纳米胶囊固定化的过氧化氢酶，在初始的20分钟损失了部分活性，在随后的时间内都一直保持其相对催化活性在35％左右，这说明经包埋的过氧化氢酶的耐热性明显增强。
实施例4、抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备及性能测试
(1)抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备
将滤嘴放入溶有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(1mM)、N-羟基丁二酰亚胺NHS(1mM)和实施例1制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊(0.1mg/mL)的1mL混合溶液中，在0℃反应1h。反应结束后，用超纯水清洗醋酸纤维素，除去未反应的EDC、NHS以及过氧化氢酶纳米胶囊，而后冻干备用。
(2)抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的SEM表征
从抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的扫描电镜图(图7所示)可以看出，相比于未处理的纤维素表面光滑平整，过氧化氢酶/醋酸纤维素纳米复合物表面粗糙。这说明过氧化氢酶成功固定到醋酸纤维素上，并进一步固定到卷烟滤嘴中。
(3)卷烟烟气自由基的清除
将市售卷烟滤嘴替换成本实施例制备的生物酶/醋酸纤维素纳米复合物，采用图8所示装置捕获烟气中不稳定自由基，再进行测定。采用N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)的四氯化碳溶液作为自由基捕获剂，具体步骤是：
用2mL0.2MPBN四氯化碳溶液收集卷烟样品中的主流烟气，收集完毕后立即移取200μL的捕获剂于核磁管，进行EPR检测。
EPR检测采用室温下X波段EPR波谱，测试条件如下：
测试温度为25℃、微波功率10.1mW、微波频率9.488GHz、调制频率100KHz、调制幅度0.0002G、中心磁场3375G、时间常数40.96ms、扫描宽度400G。
结果如图9中谱线c所示，可以看出相比与空白组(谱线a)和游离的过氧化氢酶(谱线b)，实施例1中制备得到的过氧化氢纳米胶囊和本实施例中利用该纳米胶囊制备得到的抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物表现出优异的自由基清除能力，清除率可达90％[清除率＝(空白组自由基含量－加样自由基含量)/空白组自由基含量]。
实施例5、抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备及性能测试
(1)抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备
将滤嘴放入溶有EDC(100mM)、NHS(30mM)和实施例2制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊(10mg/mL)的100mL混合溶液中，在4℃反应10h。反应结束后，用超纯水清洗醋酸纤维素，除去未反应的EDC、NHS以及过氧化氢酶纳米胶囊，而后冻干备用。
(2)抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的SEM表征结果与实施例4一致。
(3)卷烟烟气自由基清除
将市售卷烟滤嘴替换成本实施例制备的生物酶/醋酸纤维素纳米复合物，采用图8所示装置捕获烟气中不稳定自由基，再进行测定。采用N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)的四氯化碳溶液作为自由基捕获剂，具体步骤是：
用5mL2MPBN四氯化碳溶液收集卷烟样品中的主流烟气，收集完毕后立即移取200μL的捕获剂于核磁管，进行EPR检测，测试条件与实施例4相同。
结果如图9中谱线d所示，可以看出相比与空白组(谱线a)和游离的过氧化氢酶(谱线b)，实施例2中制备得到的过氧化氢纳米胶囊和本实施例中利用该纳米胶囊制备得到的抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物表现出一定的自由基清除能力，清除率可达40％。
实施例6、抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备及性能测试
(1)抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备
将滤嘴放入溶有EDC(200mM)、NHS(50mM)和实施例3制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊(100mg/mL)的200mL混合溶液中，在50℃反应20h。反应结束后，用超纯水清洗醋酸纤维素，除去未反应的EDC、NHS以及过氧化氢酶纳米胶囊，而后冻干备用。
(2)抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的SEM表征结果与实施例4一致。
(3)卷烟烟气自由基清除
将市售卷烟滤嘴替换成本实施例制备的生物酶/醋酸纤维素纳米复合物，采用图8所示装置捕获烟气中不稳定自由基，再进行测定。采用N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)的四氯化碳溶液作为自由基捕获剂，具体步骤是：
用50mL20MPBN四氯化碳溶液收集卷烟样品中的主流烟气，收集完毕后立即移取200μL的捕获剂于核磁管，进行EPR检测，测试条件与实施例4相同。
结果如图9中谱线e所示，可以看出相比与空白组(谱线a)和游离的过氧化氢酶(谱线b)，实施例3中制备得到的过氧化氢酶纳米胶囊和本实施例中利用该纳米胶囊制备得到的抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物表现出良好的自由基清除能力，清除率可达50％。
实施例7、抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备及性能测试
(1)过氧化氢酶的表面修饰
将1mg的过氧化氢酶溶解在3.8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(1mM，pH7.0)中，将1mgN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)溶解在300μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后向酶溶液中逐滴加入，在10℃条件下反应2h。将溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(1mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的NAS。
(2)原位自由基聚合
将透析后的酶溶液浓度稀释至0.1mg/mL,然后将1mg单体丙烯酰胺(AAM)和1mgN，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)逐滴加入到上述稀释的酶溶液中，30℃下搅拌溶解，通氩气30分钟。接着加入1mg过硫酸铵(APS)引发剂和1μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应，在30℃和氩气氛围下反应2h。反应结束后，将反应后溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(1mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的小分子，然后真空干燥一天获得过氧化氢酶的纳米胶囊粉末产品待用。
(3)所述抗氧化酶纳米胶囊经除氧后分装入洁净的铝罐中，将阀门安置在罐上并且(真空)旋紧，最后通过阀门给每瓶耐压容器中加入内容物总重量6％的碳氢化合物类抛射剂丙烷与异丁烷混合物(丙烷与异丁烷的质量比为30：70)，即可得到抗氧化酶纳米胶囊气雾剂。
(4)将上述所得气雾剂按照实施例4烟气自由基测定的方法进行清除自由基效果测试。结果如图10中谱线a所示，可以看出相比与空白组(图9中a谱线)和游离的过氧化氢酶(图9中b谱线)，过氧化氢酶纳米胶囊表现出优异的自由基清除能力，清除率可达90％[清除率＝(空白组自由基含量－加样自由基含量)/空白组自由基含量]。因此可将此气雾剂用于肺部自由基的清除，起到预防疾病的作用。
实施例8、抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备及性能测试
(1)过氧化氢酶的表面修饰
将100mg的过氧化氢酶溶解在3.8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(100mM，pH7.0)中，将5mgN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)溶解在300μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后向酶溶液中逐滴加入，在30℃条件下反应2h。将溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(100mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的NAS。
(2)原位自由基聚合
将透析后的酶溶液浓度稀释至10mg/mL，然后将100mg单体丙烯酰胺(AAM)和100mgN，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)逐滴加入到上述稀释的酶溶液中，30℃下搅拌溶解，通氩气30分钟。接着加入30mg过硫酸铵(APS)引发剂和30μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应，在30℃和氩气氛围下反应2h。反应结束后，将反应后溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(100mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的小分子，然后真空干燥一天获得过氧化氢酶的纳米胶囊粉末产品待用。
(3)所述抗氧化酶纳米胶囊经除氧后分装入洁净的铝罐中，将阀门安置在罐上并且(真空)旋紧，最后通过阀门给每瓶耐压容器中加入内容物总重量8％的氢氟烷烃类抛射剂HFA-227，即可得到抗氧化酶纳米胶囊气雾剂。
(4)将上述所得气雾剂按照实施例4烟气自由基测定的方法进行清除自由基效果测试。结果如图10中谱线b所示，可以看出相比与空白组(图9中a谱线)和游离的过氧化氢酶(图9中b谱线)，过氧化氢酶纳米胶囊表现出良好的自由基清除能力，清除率可达40％[清除率＝(空白组自由基含量－加样自由基含量)/空白组自由基含量]。因此可将此气雾剂用于肺部自由基的清除，起到预防疾病的作用。
实施例9、抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备及性能测试
(1)过氧化氢酶的表面修饰
将200mg的过氧化氢酶溶解在3.8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(200mM，pH7.0)中，将10mgN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)溶解在300μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后向酶溶液中逐滴加入，在50℃条件下反应2h。将溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(200mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的NAS。
(2)原位自由基聚合
将透析后的酶溶液浓度稀释至20mg/mL，然后将200mg单体丙烯酰胺(AAM)和200mgN，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)逐滴加入到上述稀释的酶溶液中，30℃下搅拌溶解，通氩气30分钟。接着加入50mg过硫酸铵(APS)引发剂和50μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合反应，在30℃和氩气氛围下反应2h。反应结束后，将反应后溶液装入截留分子量为3500的透析袋在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(200mM，pH7.0)4℃透析过夜，除去未反应的小分子，然后真空干燥一天获得过氧化氢酶的纳米胶囊粉末产品待用。
(3)所述抗氧化酶纳米胶囊经除氧后分装入洁净的铝罐中，将阀门安置在罐上并且(真空)旋紧，最后通过阀门给每瓶耐压容器中加入内容物总重量8％的氢氟烷烃类抛射剂HFA-134a，即可得到抗氧化酶纳米胶囊气雾剂。
(4)将上述所得气雾剂按照实施例4烟气自由基测定的方法进行清除自由基效果测试。结果如图10中谱线c所示，可以看出相比与空白组(图9中a谱线)和游离的过氧化氢酶(图9中b谱线)，过氧化氢酶纳米胶囊表现出一定的自由基清除能力，清除率可达30％[清除率＝(空白组自由基含量－加样自由基含量)/空白组自由基含量]。因此可将此气雾剂用于肺部自由基的清除，起到预防疾病的作用。

Claims (16)

1.一种抗氧化酶纳米胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗氧化酶的表面修饰：将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺在有机溶剂中形成的溶液滴加到抗氧化酶的磷酸缓冲溶液中，经丙烯酰化完成所述抗氧化酶的表面修饰；
(2)原位自由基聚合：惰性气氛下，将单体、交联剂和引发剂加入到经表面修饰的抗氧化酶溶液中，经原位自由基聚合得到所述抗氧化酶纳米胶囊；
所述单体为丙烯酰胺或烷基丙烯酰胺。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述抗氧化酶与所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的质量比为1：1～20：1；
所述抗氧化酶在所述磷酸缓冲溶液中的浓度为0.3～60mg/mL，所述磷酸缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值为7，浓度为1～200mM；
所述抗氧化酶为过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶中的至少一种；
所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的浓度为0.3～30mg/mL，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述丙烯酰化的温度为10～50℃，时间为1～5h；
所述丙烯酰化之后还包括将反应后的混合溶液进行透析的步骤；
所述透析采用截留分子量为3500的透析袋，在所述磷酸缓冲溶液中进行。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述交联剂为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、1,1,1-三(丙烯酰氧甲基)丙烷和2,2,2-三(丙烯酰氧甲基)乙醇中至少一种；
所述引发剂为过硫酸铵和/或四甲基乙二胺；
所述原位自由基聚合之前还包括将所述透析之后的酶溶液稀释至0.1～20mg/mL的步骤；
所述原位自由基聚合的温度为20～60℃，时间为1～5h；
所述原位自由基聚合之后还包括透析的步骤。
5.权利要求1-4中任一项方法制备的抗氧化酶纳米胶囊。
6.权利要求5所述的抗氧化酶纳米胶囊在清除卷烟烟气自由基中的应用。
7.一种抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：
将醋酸纤维素置于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和权利要求5所述抗氧化酶纳米胶囊的混合水溶液中，经反应得到所述抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物。
8.权利要求7所述方法制备的抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物。
9.权利要求8所述抗氧化酶/醋酸纤维素纳米复合物在清除卷烟烟气中自由基或作为卷烟滤嘴中的应用。
10.一种抗氧化酶纳米胶囊气雾剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗氧化酶的表面修饰：将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺在有机溶剂中形成的溶液滴加到抗氧化酶的磷酸缓冲溶液中，经丙烯酰化完成所述抗氧化酶的表面修饰；
(2)原位自由基聚合：在惰性气氛下，将单体、交联剂和引发剂加入到经表面修饰的抗氧化酶溶液中，经原位自由基聚合得到抗氧化酶纳米胶囊；
所述单体为具有双键的可聚合基团的有机物，所述可聚合基团为乙烯基、丙烯酰基、丙烯酰氨基、烷基丙烯酰基和烷基丙烯酰氨基中的任一种；
(3)所述抗氧化酶纳米胶囊与抛射剂混合后装入耐压容器中即得抗氧化酶纳米胶囊气雾剂；
所述抛射剂的质量占所述抗氧化酶纳米胶囊和所述抛射剂总质量的6％～8％，所述抛射剂为氢氟烷烃类、碳氢化合物类和二甲醚中的任一种。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述可聚合基团为甲基丙烯酰基或甲基丙烯酰氨基。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述抗氧化酶与所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的质量比为1：1～20：1；
所述抗氧化酶在所述磷酸缓冲溶液中的浓度为0.3～60mg/mL，所述磷酸缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值为7，浓度为1～200mM；
所述抗氧化酶为过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶中的至少一种；
所述N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的浓度为0.3～30mg/mL，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
13.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述丙烯酰化的温度为10～50℃，时间为1～5h；
所述丙烯酰化之后还包括将反应后的混合溶液进行透析的步骤；
所述透析采用截留分子量为3500的透析袋，在所述磷酸缓冲溶液中进行。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述交联剂为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、1,1,1-三(丙烯酰氧甲基)丙烷和2,2,2-三(丙烯酰氧甲基)乙醇中至少一种；
所述引发剂为过硫酸铵和/或四甲基乙二胺；
所述原位自由基聚合之前还包括将所述透析之后的酶溶液稀释至0.1～20mg/mL的步骤；
所述原位自由基聚合的温度为20～60℃，时间为1～5h；
所述原位自由基聚合之后还包括透析的步骤。
15.权利要求10-14中任一项方法制备的抗氧化酶纳米胶囊气雾剂。
16.权利要求15所述的抗氧化酶纳米胶囊气雾剂在清除卷烟烟气自由基中的应用。
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