CN104548144A - 一种医用超高场核磁造影剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种医用超高场核磁造影剂及其制备方法，所述超高场核磁造影剂为磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒。NaHoF₄中的顺磁性元素Ho拥有最大的有效电子磁矩，能够有效的改变水质子的横向弛豫时间，进而产生T₂-加权造影效果，这种造影效果随着场强的增加而急剧增加，可用于未来临床超高场核磁造影成像。又，利用磷脂PEG对NaHoF₄颗粒进行亲水改性，从而增加其生物相容性、降低毒副作用并促进血液循环性能。该方法改性方便、高效，且利于后续进一步嫁接生物配体。

Description

一种医用超高场核磁造影剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医用造影剂技术领域，具体涉及一种超高场核磁造影剂及其制备方法和应用。

背景技术

磁共振成像(MRI)是借助计算机技术和图像重建方法进行成像的一种影像手段，对软组织具有较高的分辨率，已在临床中大规模使用。然而，MRI的灵敏度较低，对微小的病灶不能有效诊断，限制了其临床进一步应用。鉴于此，研究人员开发出多种MRI造影剂以提高成像的造影效果，获得病灶部位的详细信息。目前临床核磁仪器以1.5T/3.0T为主，过去的十年，3.0T大规模替代了1.5T，大幅提高了成像质量及信噪比。与此同时，7.0T已被美国FDA批准为“无明显危害”且已被广泛用于动物及临床病人的研究。7.0T磁共振进一步提高了信噪比，优化成像质量，为临床及科研带来了新的机遇。然而，临床常用的T₁钆剂，造影效果最优值在1.0T以下，在3.0T下，其造影效果也只是最优值的三分之一，不适合做超高场核磁造影剂；另一类T₂造影剂氧化铁，在1.5T左右就达到磁化饱和，同样不利于超高场核磁造影。因此，寻找、制备新型的造影剂，在超高场下产生优良的造影效果，以满足临床需要，已成为当前亟需解决的难题之一。

对于MRI，大多数镧系离子如Dy³⁺，Ho³⁺，Tm³⁺和Yb³⁺等，具有比较短的电子横向弛豫时间，主要影响T₂。由于顺磁性，不会扭曲正常组织的磁场，因此没有磁伪影。其中，Ho³⁺(Dy³⁺)具有最大的有效电子磁矩(10.6μB)，具有最好的T₂造影效果。且造影效果随着场强的增加而急剧增加，是潜在的超高场核磁造影剂。选择Ho有三个优势：1)Ho生物相容性好，已经在临床大规模使用；2)顺磁性的Ho，可以避免像超顺磁的氧化铁那样的磁伪影；3)Ho的纵向弛豫可忽略，因此r₂/r₁值比较高，且随着场强的增加而增加，因此非常利于提高超高场MR造影效率。综上所述，制备的超高场核磁造影剂，有望解决临床中传统造影剂不适合超高场造影这一难题，对临床影像的发展具有重要意义和价值。

发明内容

针对现有临床的需求，本发明的目的在于合成简单结构的纳米颗粒，实现超高场核磁造影。

在此，一方面，本发明提供一种医用超高场核磁造影剂，所述超高场核磁造影剂为磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒。

本发明中，NaHoF₄中的顺磁性元素Ho拥有最大的有效电子磁矩，能够有效的改变水质子的横向弛豫时间，进而产生T₂-加权造影效果，这种造影效果随着场强的增加而急剧增加，可用于未来临床超高场核磁造影成像。又，利用磷脂PEG对NaHoF₄颗粒进行亲水改性，从而增加其生物相容性、降低毒副作用并促进血液循环性能。该方法改性方便、高效，且利于后续进一步嫁接生物配体。本发明的医用超高场核磁造影剂成像效果优异，灵敏度高，生物相容性好，对临床影像诊断技术的发展和应用具有重要意义。

较佳地，在所述纳米颗粒中，NaHoF₄与磷脂PEG的质量比为1：(5～10)。

较佳地，所述纳米颗粒的粒径为2～20nm，该粒径较小，易于体内逃避网状内皮系统的吞噬，从而提高在靶向区的聚集效率。

另一方面，本发明还提供上述医用超高场核磁造影剂的制备方法，包括以下步骤：

1)对含有NaHoF₄颗粒、磷脂PEG、和有机溶剂的混合液进行旋蒸以在NaHoF₄颗粒上修饰磷脂PEG，并同时去除所述有机溶剂，其中NaHoF₄颗粒和磷脂PEG的质量比按照目标产物磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒中的NaHoF₄和磷脂PEG的质量比；

2)向步骤1)所得的产物中加入水，并使所述产物分散于水中，经固液分离即制得磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒。

本发明采用旋蒸即可同时进行磷脂PEG对NaHoF₄颗粒的修饰、以及有机溶剂的去除，制备方法简单，节省时间，提高效率。

较佳地，步骤1)中，所述有机溶剂为氯仿。

较佳地，步骤1)中，旋蒸的工艺参数为：温度为50～70℃，时间为0.5～1.5小时，压强≤0.03mPa，旋转速度为50～150转/分钟。

较佳地，步骤2)中，通过超声使所述产物分散于水中。

较佳地，步骤1)中，NaHoF₄纳米颗粒的制备方法为：

a)将含有Ho³⁺的水溶液加入到油酸和十八烯中搅拌均匀得到第二混合液，并以加热方式去除第二混合液中的水，冷却至室温；

b)向步骤a)所得第二混合液中加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，搅拌1～3小时后，以加热方式去除甲醇；

c)将步骤b)所得混合液在270～280℃、惰性气体氛围下进行高温热解反应0.2～2小时；

d)从步骤c)所得混合液中分离出固体产物并洗涤，即得NaHoF₄纳米颗粒，所合成纳米颗粒中Na、Ho、F之间的摩尔比与所述超高场核磁造影剂中各组成元素的摩尔比相符合。

较佳地，步骤a)中，油酸与十八烯的摩尔比为(1～6)：10，每1mol Ho³⁺使用5～10L油酸。

较佳地，步骤b)中，氢氧化钠、氟化铵的摩尔比为1：(1.6～8)，Ho³⁺、氢氧化钠的摩尔比为1：(1～3)。

本发明首先采用高温热解法制备NaHoF₄疏水纳米颗粒，然后再利用磷脂PEG对颗粒进行亲水改性，即可制得所述医用超高场核磁造影剂。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的NaHoF₄颗粒分散于氯仿中的透射电镜(TEM)照片；

图2为本发明实施例1所制得的NaHoF₄颗粒的X射线衍射(XRD)图谱；

图3为本发明实施例1所制得的NaHoF₄颗粒的能谱(EDS)图；

图4为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的FT-IR图，其中OA-NaHoF₄表示油酸包覆的疏水性纳米颗粒，PEG-NaHoF₄表示修饰了磷脂PEG的NaHoF₄；

图5为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的TEM图(左)及水溶液图(右)；

图6为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的磁化曲线(M-H)；

图7为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的场冷却曲线(ZFC)；

图8为本发明实施例1所制得的不同浓度的UFCAs亲水颗粒在7.0T下，MR造影效果的伪彩图；

图9为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒在不同场强(1.5T/3.0T/7.0T)MR下的横向弛豫率值；

图10为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒注入昆明小鼠左腿，在3.0T和7.0T的MR下，对比成像实验结果图；

图11为本发明实施例1所制得UFCAs亲水颗粒尾静脉注射入昆明鼠体内肝脏在超高场MR下的造影成像图；

图12为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒与细胞共培养24后的细胞毒性评价；

图13为昆明鼠注射入本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒后，心、肝、脾、肺、肾等各器官的组织切片图。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明的医用超高场核磁造影剂是磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒(以下简称为UFCAs)。其中，NaHoF₄颗粒可为疏水颗粒，通过磷脂PEG对其改性而赋予其亲水性。此外，通过修饰磷脂PEG，还可以增加NaHoF₄颗粒的生物相容性、降低毒副作用并促进血液循环性能。磷脂PEG与NaHoF₄颗粒通过疏水作用相连。图4示出本发明一个示例的UFCAs的FT-IR图，由图4可知，UFCAs中含有磷脂PEG和NaHoF₄。图5中的左图示出本发明一个示例的UFCAs的TEM图，可以看出UFCAs的粒径为2～20nm。图5中的右图示出本发明一个示例的UFCAs的水溶液图，可以看出UFCAs在水中分散性良好。另外，在UFCAs中，NaHoF₄与磷脂PEG的质量比可为1：(5～10)。

图6示出本发明一个示例的UFCAs的磁化曲线(M-H)，图7示出本发明一个示例的UFCAs的场冷却曲线(ZFC)，由图6、7可知，本发明的UFCAs为顺磁性。因此，可以避免像超顺磁的氧化铁那样的磁伪影。图8示出不同浓度的UFCAs亲水颗粒在7.0T下，MR造影效果的伪彩图，由图8可知，本发明的UFCAs具有较强的超高场T₂-MRI造影功能。图9示出本发明一个示例的UFCAs在不同场强(1.5T/3.0T/7.0T)MR下的横向弛豫率值，由图9可知，本发明的UFCAs造影效果随着场强的增加而急剧增强。图10示出本发明一个示例的UFCAs注入昆明小鼠左腿，在3.0T和7.0T的MR下，对比成像实验结果图，由图10可知，本发明的UFCAs在活体水平，7.0T的MR造影效果优于3.0T。图11示出本发明一个示例的UFCAs尾静脉注射入昆明鼠体内肝脏在超高场MR下的造影成像图，由图11可知，注射UFCAs后，肝脏区域信号明显变暗，说明本发明的造影剂能够被内皮网状(RES)系统所吞噬，在肝脏处聚集，在活体水平具有高效T₂-MR造影成像性能。图12为本发明一个示例的UFCAs与细胞共培养24后的细胞毒性评价，由图12可见：UFCAs在800μg/mL的较高浓度下，共培养24小时后细胞仍有高达85％以上的存活率；表明UFCAs的低细胞毒性。图13示出昆明鼠注射入本发明一个示例的UFCAs亲水颗粒后，心、肝、脾、肺、肾等各器官的组织切片图，由图13可知，昆明鼠在注射UFCAs前后，心肝脾肺肾和脑各器官均无明显毒性反应，表明该材料在活体水平的低毒性。

因此，本发明的UFCAs可用于超高场核磁T₂加权造影成像。

本发明的UFCAs可以通过如下方法制备：先采用高温热解法制备NaHoF₄疏水纳米颗粒，然后再利用磷脂PEG对NaHoF₄颗粒进行亲水改性。

高温热解法制备NaHoF₄疏水纳米颗粒可包括如下步骤：

a)将含有Ho³⁺的水溶液加入到含有油酸和十八烯的第二混合液中，搅拌均匀后，以加热方式去除第二混合液中的水，冷却至室温；

b)向步骤a)所得第二混合液中加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，搅拌1～3小时后，以加热方式去除第二混合液中的甲醇；

c)将步骤b)所得混合液在270～280℃、惰性气体氛围下进行高温热解反应；

d)离心分离步骤c)所得混合液，并清洗分离产物，即得NaHoF₄纳米颗粒，所合成纳米颗粒中Na、Ho、F之间的摩尔比与所述超高场核磁造影剂中各组成元素的摩尔比相符合。

步骤a)中，油酸与十八烯的摩尔比可为(1～6)：10。

步骤a)中，油酸的用量可为：每1mol Ho³⁺使用5～10L油酸。

步骤b)中，氢氧化钠与氟化铵的摩尔比可为1：(1.6～8)，优选为1：(4～8)。另外，Ho³⁺与氢氧化钠的摩尔比可为1：(1～3)。

步骤c)中，高温热解反应的时间可为0.2～2小时。

在上述实施方式中，通过高温热解法制备NaHoF₄疏水纳米颗粒，但应理解，NaHoF₄疏水纳米颗粒的制备方法不限于此。

图1示出一个示例中制得的NaHoF₄颗粒分散于氯仿中的透射电镜(TEM)照片，由图1可以看出所制得的纳米颗粒为椭球形，分散均一。图1示出一个示例中制得的NaHoF₄颗粒的XRD图谱，由图2可见：所制得的纳米颗粒为六方相，与PDF卡片49-1896相一致。图3示出一个示例中制得的NaHoF₄颗粒的能谱(EDS)图，由图3可见：所制得的纳米颗粒的成分中Na、Ho和F元素均可被检测出来，进一步证实了NaHoF₄颗粒的合成。

利用磷脂PEG对NaHoF₄颗粒进行亲水改性可包括如下步骤：

1)将NaHoF₄颗粒分散于氯仿中，并加入磷脂PEG的氯仿溶液，得到第一混合液；

2)以旋蒸技术去除步骤1)制备的第一混合液中的氯仿，同时在NaHoF₄颗粒上修饰磷脂PEG，旋蒸结束后向产物中加入水，通过超声使产物分散于水中；

3)分离步骤2)溶液中所含磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒，即可制得UFCAs亲水颗粒。

步骤1)中，NaHoF₄颗粒和磷脂PEG的质量比可以按照目标产物磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒中的NaHoF₄和磷脂PEG的质量比，例如可为1：(5～10)。

步骤2)中，旋蒸技术的工艺参数可为：温度为50～70℃，时间为0.5～1.5小时，压强≦0.03mPa，旋转速度为50～150r/分钟。优选为：60℃悬蒸1小时，抽真空-0.03mPa，100r/min。

图4示出一个示例所制得的UFCAs亲水颗粒的FT-IR图，峰位的变化证实了磷脂PEG的成功改性。图5示出一个示例所制得的UFCAs亲水颗粒的TEM图(左)及水溶液图(右)，可以看出UFCAs亲水颗粒在水中分散性良好，进一步证实了材料改性的成功。

本发明提供了一种医用超高场核磁造影剂，首先采用高温热解法制备NaHoF₄颗粒，然后再利用磷脂PEG对颗粒进行亲水改性，记为UFCAs。顺磁性元素Ho，拥有最大的有效电子磁矩，能够有效的改变水质子的横向弛豫时间，进而产生T₂-加权造影效果，这种造影效果随着场强的增加而急剧增加，可用于未来临床超高场核磁造影成像。同时，该方法合成的高场核磁造影剂，制备工艺简易，成像效果优异，灵敏度高，生物相容性好，对临床影像诊断技术的发展和应用具有重要意义。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的配比、时间、温度等工艺参数也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

分别称取2mmol(758.74mg)HoCl₃·6H₂O，用2mL去离子水溶解后备用；在三口烧瓶中分别加入15mL油酸和30mL十八烯，再加入预先配制好的上述含稀土离子的氯化物水溶液，室温下搅拌2小时；通入15min氩气以除去反应瓶中空气；在氩气气氛保护下，缓慢加热(升温速率控制为30℃/小时)，升温至160℃,保温1小时以除去体系中的水；停止加热，自然降温至室温；然后滴加含200mg NaOH及296.3mg NH₄F的甲醇溶液10mL，在室温下搅拌3小时，得到黄白色溶液；继续通入氩气，在120℃下搅拌2小时，以除去反应体系中的甲醇；除去甲醇后，接好冷凝管，升温至275℃左右，保温进行高温热解反应1小时；反应结束，自然降至室温；向反应体系中加入20mL无水乙醇，室温下搅拌30min，然后进行离心分离；对收集的固体依次用环己烷和乙醇进行超声清洗3次；用20mL氯仿分散所得产物(NaHoF₄颗粒)；

取上述氯仿溶液3mL，加入1ml的磷脂PEG氯仿溶液中(含磷脂PEG 100mg)，悬蒸1h。条件：抽真空-0.03mPa，100r/min。而后加入5ml去离子水超声，分散；

图1为本发明实施例1所制得的NaHoF₄颗粒分散于氯仿中的透射电镜(TEM)照片由图1可见：所制得的纳米颗粒为椭球形，分散均一；

图2为本发明实施例1所制得的NaHoF₄颗粒的XRD图谱，由图2可见：所制得的纳米颗粒为六方相，与PDF卡片49-1896相一致；

图3为本发明实施例1所制得的NaHoF₄颗粒的能谱(EDS)图，由图3可见：所制得的纳米颗粒的成分中Na、Ho和F元素均可被检测出来，进一步证实了材料的合成；

图4为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的FT-IR图，峰位的变化证实了磷脂PEG的成功改性；

图5为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的TEM图(左)及水溶液图(右)，分散性良好，进一步证实了材料改性的成功；

图6为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的磁化曲线(M-H)；

图7为本发明实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒的场冷却曲线(ZFC)，图6、图7证实了材料为顺磁性。

实施例2

医用成像应用效果实验

1、MR成像

1.1 实验材料及仪器：

实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒；

MR成像检测仪器型号：GE Signa 1.5T,GE Signa 3.0T及Agilent,7T/160

1.2 实验动物：昆明鼠，平均体重20g，购自复旦大学医学院动物房；

1.3 实验方法：不同浓度实施例1所制得的UFCAs水溶液在1.5T/3.0T/7.0T下，对氢质子横向弛豫时间的影响；小鼠用水合氯醛进行腹腔麻醉后，其中大腿注入造影剂(2.5Ho mg/mL,～30μL)在3.0T/7.0T成像对比效果；尾静脉注射造影剂(剂量为12mg Ho/kg)，观察肝脏的MR造影效果；

1.4 实验结果：

图8为UFCAs亲水颗粒MR体外超高场MR成像图，由图8可见：UFCAs具有较强的超高场T₂-MRI造影功能；

图9为UFCAs对氢质子横向弛豫率r₂随着场强的变化图，由图8可见：UFCAs造影效果随着场强的增加而急剧增强；

图10为亲水纳米颗粒注入小鼠大腿，在不同场强造影效果，由图10可见：在活体水平，7.0T的MR造影效果优于3.0T；

图11为UFCAs在正常小鼠肝脏超高场MR成像性能的实验图，由图11可见：注射UFCAs后，肝脏区域信号明显变暗，说明上述造影剂能够被内皮网状(RES)系统所吞噬，在肝脏处聚集，在活体水平具有高效T₂-MR造影成像性能。

实施例3

毒性评价实验

1.体外细胞毒性实验

1.1 实验材料：

实施例1所制得的UFCAs亲水纳米颗粒；

1.2 实验方法：

采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)方法评价细胞存活率，具体实验方法为：(1)接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔10⁵-10⁶个细胞接种到96孔板，每孔体积100微升(2)培养细胞：加入纳米颗粒后与细胞共培养1天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH＝7.4)50微升，继续共培养4h，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。(3)定量：每孔加150微升DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果；

1.3 实验结果：

图12为UFCAs在不同浓度下的细胞毒性(脑胶质瘤细胞)评价柱状图；由图12可见：该材料在800μg/mL的较高浓度下，共培养24小时后细胞仍有高达85％以上的存活率；表明UFCAs的低细胞毒性。

2.体内组织毒性实验

2.1 实验材料

实施例1所制得的UFCAs亲水颗粒；

2.2 实验动物

昆明小鼠，平均体重20g，5～6周龄，购自复旦大学医学院动物房；

2.2.3 实验方法：尾静脉注射UFCAs水溶液(剂量为20mg Ho/kg)；

2.3 实验方法

尾静脉注射该亲水性纳米颗粒UFCAs的生理盐水溶液(剂量为20mg Ho/kg)。通过常规的H&E染色来观察注射前、注射30天后的组织切片；

2.4 实验结果

图13为昆明鼠在注射入UFCAs后，心、肝、脾、肺和肾各器官的组织切片图，由图13可见：昆明鼠在注射UFCAs前后，心肝脾肺肾和脑各器官均无明显毒性反应，表明该材料在活体水平的低毒性。

综上所述可见，本发明提供的医用超高场造影剂UFCAs具有较好的生物相容性。此外，UFCAs的MR造影效果随着场强的增加而急剧增加，适合超高场造影，并显示了良好的体内成像效果，对与医学MR影像的发展和应用具有重要价值和意义。

Claims (10)

1.一种医用超高场核磁造影剂，其特征在于，所述超高场核磁造影剂为磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的医用超高场核磁造影剂，其特征在于，在所述纳米颗粒中，NaHoF₄与磷脂PEG的质量比为1：（5～10）。

3.根据权利要求1或2所述的医用超高场核磁造影剂，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为2～20 nm。

4.一种权利要求1至3中任一项所述的医用超高场核磁造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）对含有NaHoF₄颗粒、磷脂PEG、和有机溶剂的混合液进行旋蒸以在NaHoF₄颗粒上修饰磷脂PEG，并同时去除所述有机溶剂，其中NaHoF₄颗粒和磷脂PEG的质量比按照目标产物磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒中的NaHoF₄和磷脂PEG的质量比； 

2）向步骤1）所得的产物中加入水，并使所述产物分散于水中，经固液分离即制得磷脂PEG修饰的NaHoF₄纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述有机溶剂为氯仿。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，旋蒸的工艺参数为：温度为50～70℃，时间为0.5～1.5小时，压强≤0.03mPa，旋转速度为50～150 转/分钟。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，通过超声使所述产物分散于水中。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，NaHoF₄纳米颗粒的制备方法为：

a）将含有Ho³⁺的水溶液加入到油酸和十八烯中搅拌均匀得到第二混合液，并以加热方式去除第二混合液中的水，冷却至室温；

b）向步骤a）所得第二混合液中加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，搅拌1～3小时后，以加热方式去除甲醇；

c）将步骤b）所得混合液在270～280℃、惰性气体氛围下进行高温热解反应0.2～2小时；

d）从步骤c）所得混合液中分离出固体产物并洗涤，即得NaHoF₄纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤a）中，油酸与十八烯的摩尔比为（1～6）：10，每1mol Ho³⁺使用5～10L油酸。

10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，步骤b）中，氢氧化钠、氟化铵的摩尔比为1：（1.6～8），Ho³⁺、氢氧化钠的摩尔比为1：（1～3）。