CN107080850B - 一种RGD-石墨烯/MnO2磁性纳米球的复合探针和其应用 - Google Patents

一种RGD-石墨烯/MnO2磁性纳米球的复合探针和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RGD‑石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针和其应用，其制备方法是：1、MnO2空心磁性纳米粒子的制备：1.1、制备油酸包裹的MnO2实心磁性纳米粒子OA@SMnO2；1.2、制备BSA‑OA@SMnO2；1.3、制备HMnO2；2、制备HMnO2/Graphene；3、制备RGD‑石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针RGD‑HMnO2/Graphene。该复合探针通过实现对肺癌肿瘤靶向MR显影和靶向治疗，为肺癌的早期诊断和治疗提供新的思路、见解。

Description

一种RGD-石墨烯/MnO2磁性纳米球的复合探针和其应用
技术领域
本发明属于肿瘤的诊疗和治疗技术领域，具体涉及一种RGD-石墨烯/MnO2磁性纳米球的复合探针和其应用。
背景技术
石墨烯，作为新型二维纳米材料，具有良好的生物相容性、细胞跨膜运输性能以及易于表面修饰的特点，为构建细胞、组织甚至活体肿瘤检测的分子探针提供良好的基材。目前已报道的石墨烯肿瘤检测分子探针，按照医学成像技术大体可以归为以下五类：荧光成像、计算机X射线断层扫描(Computed Tomography，CT)、正电子发射计算机断层扫描(Positron Emission Tomography，PET)、磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)的石墨烯分子探针。其中由于MRI能穿透不透明组织，具有空间和软组织分辨率高、非侵入性、无辐射等优点，是癌症检测的首选成像模式。也是我们研究关注的重点。
当前制备MRI石墨烯分子探针的基本方法就是在石墨烯表面组装MRI信号组件。例如，Xue等通过简单的挥发溶剂法，合成了三氧化二钆磁性纳米粒子的MRI信号组件负载的石墨烯复合探针，并通过研究验证了该探针具有杰出的T1加权成像性能。中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所张智军课题组报道了四氧化三铁磁纳米的信号组件组装的氧化石墨烯MRI分子探针，与单纯的四氧化三铁磁纳米分子探针相比更容易被细胞吞噬，因而具有更高敏感性。中国科学院上海硅酸盐研究所施剑林课题组以石墨烯为基材，在其表面组装四氧化三铁、氧化锰磁性纳米粒子的信号组件和抗肿瘤药物阿霉素，制备出具有三重信号响应型的MRI纳米诊疗体系。尽管国内外对石墨烯的MRI分子探针的研究已经取得一定进展，但将石墨烯的MRI分子探针应用于肺癌的诊断和治疗还是目前研究的一个巨大挑战，一方面要求纳米探针具有高度的安全性和诊疗的双功能性，另一方面要求探针分子有足够的特异性和敏感性。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种RGD-石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针和其应用，该复合探针通过RGD配体与癌细胞上的受体特异性结合的靶向诊断和治疗的策略，引导分子探针选择性的识别肿瘤细胞，促使分子探针在预定病灶部位富集，肿瘤细胞的核磁信号被点亮，同时抗肿瘤药物在弱酸性的肿瘤微环境中释放出来，同步实现针对肺癌肿瘤的靶向诊断和靶向治疗。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种RGD-石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针，其制备方法包括如下步骤：
1、MnO2空心磁性纳米粒子的制备：
1.1、在1-十八烯中，油酸锰和油酸在300-350℃下反应20-40min，油酸锰与油酸的摩尔比为1-3:1，得到油酸包裹的MnO2实心磁性纳米粒子，记为OA@SMnO2；
1.2、将OA@SMnO2分散于氯仿中，然后加入去离子水和牛血清白蛋白，OA@ SMnO2与牛血清白蛋白的质量比为1:4-6，超声分散均匀，在室温下搅拌0.5-1.5天，得到表面修饰牛血清白蛋白的OA@SMnO2，记为BSA-OA@SMnO2；
1.3、将BSA-OA@SMnO2加入到pH＝4-6的弱酸性溶液中进行刻蚀，反应20-28h，得到MnO2空心磁性纳米粒子，记为HMnO2；
2、HMnO2/Graphene的制备：
将HMnO2分散在去离子水中，得到HMnO2悬浮液，将氧化石墨烯分散在去离子中，得到氧化石墨烯悬浮液，将HMnO2悬浮液加入到氧化石墨烯悬浮液中，HMnO2与氧化石墨烯的质量比为8-12:1，在室温下搅拌0.5-1.5h，得到石墨烯/MnO2空心磁性纳米球，记为HMnO2/Graphene。
3、RGD-HMnO2/Graphene的制备：
将HMnO2/Graphene分散在去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和环肽RGD，其中HMnO2/Graphene、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐、N-羟基琥珀酰亚胺和环肽RGD的质量比为1:0.5-2.5:0.5-1.5:0.5-1.5，搅拌1-3h，得到RGD-石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针，记为 RGD-HMnO2/Graphene。
进一步，步骤1.1.1中，以3.3℃/min的加热速率加热到320℃。
进一步，步骤1.1.3中，所述的弱酸性溶液为pH＝4的PBS缓冲溶液。
进一步，步骤3.1中，将HMnO2/Graphene分散在去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐搅拌过夜以活化羧基，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和环肽RGD。
一种RGD-石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针在制备肺癌肿瘤MRI诊断和治疗试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：
1、本发明采用液相“一锅法”，以空心的MnO2磁性纳米粒子和石墨烯的悬浮液作为前躯体，在超声作用的辅助下将空心的MnO2磁性纳米粒子组装到石墨烯的表面，进一步修饰靶向基团环肽RGD，制备靶向性、诊疗一体化的RGD-MnO2/Graphene分子探针。
2、本发明以石墨烯为基材，组装高弛豫率、高载药率的空心的二氧化锰(MnO2) 纳米粒子作为磁共振检测基元和药物的载体，选用癌细胞中过表达的细胞整合素受体αvβ方法的特异性配体RGD进行靶向修饰，得到RGD连接的空心MnO2磁性纳米粒子组装的石墨烯(RGD-MnO2/Graphene)靶向诊疗一体化的分子探针。
3、该复合探针通过实现对肺癌肿瘤靶向MRI显影和靶向治疗，为肺癌的早期诊断和治疗提供新的思路和见解。
附图说明
图1为实施例1制备的Graphene和HMnO2/Graphene的透射电镜图以及HMnO2和Graphene反应的示意图(A为采用液相法，以MnO2空心磁性纳米粒子和氧化石墨烯的悬浮液作为前躯体制备HMnO2/Graphene的示意图；B)制备的氧化石墨烯Graphene的TEM 图；C)制备的HMnO2/Graphene的TEM图)。
图2为实施例1制备的GO(A)和HMnO2/Graphene(B)的原子力显微镜图。
图3为实施例1制备的GO和HMnO2/Graphene的XPS图(其中A为原图，B为局部放大图)。
图4为实施例1制备的GO(下)、HMnO2/Graphene(中)和RGD-HMnO2/Graphene(上) 的红外光谱图。
图5为实施例1制备的GO(下)、HMnO2/Graphene(中)和RGD-HMnO2/Graphene(上) 的拉曼光谱图。
图6为实施例1制备的HMnO2/Graphene(上)与MnO2/Graphene(下)的纵向弛豫率与浓度的关系曲线(A)和横向弛豫率与浓度的关系曲线(B)。
图7为实施例1制备的HMnO2/Graphene与MnO2/G的T1加权成像与浓度的关系图(A)和T2加权成像与浓度的关系图(B)。
图8为实施例1制备的RGD-HMnO2/Graphene诊疗一体化分子探针靶向释药的机理图。
图9为实施例1制备的RGD-HMnO2/Graphene对肺癌细胞A549的杀伤效果图。
图10为实施例1制备的RGD-HMnO2/Graphene对裸鼠肿瘤部位的T1、T2加权成像图。
图11为实施例1制备的RGD-HMnO2/Graphene靶向治疗肺癌肿瘤细胞时的MRI图。
图12为实施例1制备的RGD-HMnO2/Graphene靶向治疗肺癌肿瘤细胞时的肿瘤体积与治疗天数的关系图。
图13为实施例1制备的RGD-HMnO2/Graphene的组织器官毒性测试图。
注：HMnO2/Graphene简记为HMnO2-G，MnO2/Graphene简记为MnO2-G， RGD-HMnO2/Graphene简记为RGD-MnO2-G。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
1、MnO2空心磁性纳米粒子的制备：
1.1、将3.96g MnCl2·4H2O(20mmol)、18.25g油酸钠(60mmol)溶解在40mL乙醇、30mL水和70mL正己烷的混合溶液中，在70℃下加热4h，冷却至室温(25℃) 并分层，分离，将上层有机相用30mL水和分液漏斗分液洗涤，再将正己烷蒸发掉，得到蜡状固体产物油酸锰。
1.2、在室温(25℃)下，将6.2g油酸锰(10mmol)、1.43g(5mmol)搅拌溶解到 50g 1-十八烯中，然后以3.3℃/min的加热速率加热到320℃，当反应液加热到320℃时，会发生剧烈的反应，最初透明的溶液会变得浑浊，反应液颜色变为褐色，在320℃下保温反应30min，将所得的混合产物冷却至室温，向混合产物中加入500mL乙醇，混匀后离心分离，干燥，得到油酸包裹的MnO2实心磁性纳米粒子，记为OA@SMnO2；
1.3、将20mg OA@SMnO2溶解于4mL氯仿中，加入20mL去离子水和100mg牛血清白蛋白(BSA)，放入超声仪(170W)中超声30min，所得的反应液放在室温(25℃) 搅拌1天，挥发除去氯仿，离心分离，干燥，得到修饰牛血清白蛋白的MnO2实心磁性纳米粒子，记为BSA-OA@SMnO2，将BSA-OA@SMnO2重新分散在去离子水中，得到 5mg/mLBSA-OA@SMnO2分散液；
1.4、将10mLBSA-OA@SMnO2分散液加入到20mL pH＝4的PBS缓冲溶液中，反应24h后，过滤，滤渣用去离子水洗涤，干燥，得到MnO2空心磁性纳米粒子，记为 HMnO2。
2、石墨烯的制备：
2.1、取一定量325目(粒径≤45μm)天然鳞片石墨，在80℃烘箱中干燥24h后待用；将30mL浓H2SO4(98wt％)、10g K2S2O8和10g P2O5加入三口烧瓶中，加热至80℃，接着加入20g干燥后的天然鳞片石墨，待反应液完全变为蓝黑色时停止加热，冷却至室温并放置6h，过滤，将滤渣用水充分地冲洗、过滤，直至所得的滤液呈中性，在室温下晾干，得到固体物；将2g固体物和92mL浓H2SO4(98wt％)置于三口烧瓶中，在0℃水浴中缓慢加入12g KMnO4，控制温度不能高于20℃，加完KMnO4后继续搅拌15 min，然后向三口烧瓶中加入2g NaNO3，在室温(25℃)下搅拌2h，加入560mL蒸馏水猝灭反应后加入10mL H2O2，三口烧瓶中的液体由黄褐色变成亮黄色，约15min 后停止反应，过滤，接着用37wt％的盐酸溶液反复洗涤滤饼以移除部分金属离子，将所得固体物装进透析袋中，在蒸馏水中进行透析，每2h更换一次蒸馏水，直至用BaCl2溶液检验渗出液中无SO4 2-，且用AgNO3溶液检验无Cl-为止，透析完成后，将透析后的保留液放入离心机中，在4000r.p.m.的速度下离心40min，除去少量未被氧化的石墨颗粒，得到呈粘性的棕色胶体，在P2O5存在的条件下，将棕色胶体在60℃真空干燥箱中真空干燥24h，得到氧化石墨，密封保存待用；
2.2、将一定量的氧化石墨加入蒸馏水中，搅拌分散3h，然后在超声机(120W) 中超声3h，使氧化石墨片层剥落，再在4000r.p.m.下离心40min，移去沉淀物，上清液即为0.05mg/mL氧化石墨烯的悬浮液。分散液中片层结构的氧化石墨烯表面带有大量的含氧功能团，使得片层彼此之间靠静电排斥达到很好的分散效果，这种方法合成的氧化石墨烯表面存在大量的含氧基团易于被修饰。
3、将HMnO2分散在去离子中，得到5mg/mL的HMnO2悬浮液，取1mLHMnO2悬浮液加入到10mL氧化石墨烯的悬浮液，在室温下(25℃)搅拌1h，将得到的混合产物过滤，滤渣用乙腈离心分离(4000rpm，10min)，除去上清液，即去除未修饰的空心的MnO2磁性纳米粒子，真空干燥，得到粉末状的石墨烯/MnO2空心磁性纳米球，记为 HMnO2/Graphene。
4、将合成得到的HMnO2/Graphene分散在去离子水中，得到20mL0.02mg/mL的HMnO2/Graphene悬浮液，加入1.5mL 10-3mol/L的EDC溶液搅拌过夜活化羧基，然后加入2mL10-3mol/L NHS溶液和400μL 10-3mol/L的环肽c(RGD)yk溶液，继续搅拌约 2h，最终通过真空干燥制备得到RGD-石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针粉末，记为RGD-HMnO2/Graphene。
将本实施例制备HMnO2/Graphene的过程从透射电镜观察，所得的透射电镜图和反应示意图如图1所示，图1非常直观的显示分子探针的修饰过程。
将本实施例制备的氧化石墨烯GO和HMnO2/Graphene用原子力显微镜观察，所得的原子力显微镜如图2所示，从图2中可以看出，GO和HMnO2/Graphene的厚度分别为1.0±0.2nm和22.0±0.2nm，修饰前GO的厚度有1.0±0.2nm，与文献中报道的经典单层石墨烯具有相同的厚度，经过修饰后，HMnO2/Graphene的厚度明显的增加，说明HMnO2成功修饰到石墨烯表面。
对本实施例制备的氧化石墨烯GO和HMnO2/Graphene进行X射线光电子能谱分析，所得的XPS图如图3所示，从图3中可以看出Mn元素特征新峰的出现，从而证明HMnO2空心磁性纳米粒子负载到了石墨烯表面上。
本实施例制备的氧化石墨烯GO、HMnO2/Graphene和RGD-HMnO2/Graphene的红外光谱图如图4所示，从图4中可以看出，氧化石墨烯GO和HMnO2/Graphene上-COOH的伸缩振动峰均在1686cm-1，而RGD-HMnO2/Graphene上-COOH的伸缩振动峰红移到了1615 cm-1处，证明环肽RGD成功连接到了HMnO2/Graphene上。
本实施例制备的氧化石墨烯GO、HMnO2/Graphene和RGD-HMnO2/Graphene的拉曼光谱图如图5所示，从图5中可以看出，RGD-HMnO2/Graphene的ID/IG的比率是1.1，与文献中报道的修饰后的石墨烯相同，但是这一数值大于原始的未共价修饰的石墨烯 graphene、HMnO2/graphene(ID/IG是0.99)，同样说明了靶标分子环肽RGD成功修饰到 HMnO2/Graphene表面上。
将本实施例制备的HMnO2/Graphene和MnO2/Graphene在7T的核磁共振波谱仪上测弛豫率，得到的HMnO2/Graphene与MnO2/Graphene的纵向弛豫率与浓度的关系曲线(A) 和横向弛豫率与浓度的关系曲线(B)如图6所示，得到的HMnO2/Graphene与 MnO2/Graphene的T1加权成像与浓度的关系图(A)和T2加权成像与浓度的关系图(B) 如图7所示，从图6和图7可以看出，HMnO2/Graphene具有更高的弛豫率和更好的核磁成像性能。
石墨烯/MnO2实心磁性纳米球MnO2/Graphene的制备方法为：
将1mL BSA-OA@SMnO2(5mg/mL)悬浮液加入到10mL石墨烯悬浮液中 (0.05mg/mL)，在室温下(25℃)搅拌1h，将得到的混合产物过滤，滤渣用乙腈离心分离(4000rpm，10min)，除去上清液，即去除未修饰的BSA-OA@SMnO2，真空干燥，得到石墨烯/MnO2实心磁性纳米球，记为MnO2/Graphene。
将本实施例制备的RGD-HMnO2/Graphene对药物的释放效果在细胞中考察，得到的RGD-HMnO2/Graphene诊疗一体化分子探针靶向释药的机理图如图8所示。
将本实施例制备的RGD-HMnO2/Graphene对肺癌细胞A549的杀伤作用通过经典的MTT法进行考察，所得的杀伤效果图如图9所示，从图9可以看出，RGD-HMnO2/Graphene 对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，有望用作细胞甚至活体靶向治疗的试剂。
试验一、本发明的RGD-HMnO2/Graphene的肺癌肿瘤靶向MRI诊断效果试验
试验方法：
在鼠龄4-5周的BALB/c雄性裸鼠大腿皮下种植A549细胞(使用细胞数量1*107)，并将种植肿瘤后的裸鼠再饲养2周，直到腿部可以用肉眼观察到小的肿瘤，通过尾静脉对裸鼠注射RGD-HMnO2/Graphene(将RGD-HMnO2/Graphene分散在去离子水中后再注射)，注射剂量为150μL、浓度为1.1mg Mn(以Mn元素计)/kg(裸鼠体重)，使用7.0T 小动物成像(BrukerBioSpec 70/20 USR)对裸鼠肿瘤部位进行T1、T2加权成像。
试验结果：
所得T1、T2加权成像图如图10所示，从图10可以看出，注射1小时后肿瘤部位的T1、T2弛豫时间发生明显改变，T1弛豫缩短、T2弛豫缩短，证明RGD-HMnO2/Graphene 可用作造影剂，进而可以用于肿瘤部位的T1、T2双模态成像，。
试验二、本发明的RGD-HMnO2/Graphene的肺癌肿瘤靶向治疗效果试验
试验方法：在鼠龄4-5周的BALB/c雄性裸鼠大腿皮下种植A549细胞(使用细胞数量1*107)，并将种植肿瘤后的裸鼠再饲养2周，直到腿部可以用肉眼观察到小的肿瘤，通过尾静脉对裸鼠注射负载抗癌药物DOX后的RGD-HMnO2/Graphene(将负载抗癌药物 DOX后的RGD-HMnO2/Graphene分散在去离子水中后注射)，注射剂量为150μL、浓度为1.1mg Mn(以Mn元素计)/kg(裸鼠体重)，使用7.0T小动物成像 (Bruker BioSpec 70/20 USR)对裸鼠肿瘤部位进行T1、T2加权成像。同时以注射 RGD-HMnO2/Graphene和生理盐水做对照试验。
试验结果：
1、裸鼠肿瘤部位的MRI图如图11所示，从图11所示可以看出，尾静脉注射 RGD-HMnO2/Graphene-DOX组裸鼠(试验组)肿瘤在治疗第0、7、14、21、28天时，肿瘤体积大小分别为2、5、10、14、18mm3，注射生理盐水组裸鼠(对照组)在第0、 7、14、21、28天时，肿瘤体积大小分别为2、9、18、28、40mm3。RGD-HMnO2/G-DOX 注射组肿瘤生长过程要比对照组慢很多，且最终肿瘤也比对照组小很多。由此可见，本发明RGD-HMnO2/Graphene能够在裸鼠体内具有良好的抗肿瘤效果。
2、根据检测裸鼠肿瘤部位肿瘤大小的情况，以裸鼠肿瘤部位肿瘤体积大小为纵坐标，以注射天数为横坐标，建立肿瘤体积与注射天数的关系曲线，如图12所示，从图 12中可以看出，与两对照组相比，RGD-HMnO2/G-DOX实验组肿瘤生长过程要慢很多，且最终肿瘤也比对照组小很多。由此同样可以证明，本发明RGD-HMnO2/Graphene能够在裸鼠体内具有良好的抗肿瘤效果。
试验三、本发明的RGD-HMnO2/Graphene的组织毒性测试试验
试验方法：将试验二中试验组和对照组的裸鼠(注射28天后)的心、肝、脾、肺、肾组织取出，做病理切片，通过H&E染色后，在显微镜下观察其组织切片形态。
试验结果：
组织器官毒性检测结果如图13所示，从图13中可以看出，本发明的 RGD-HMnO2/Graphene器官毒性很小，生物安全性较高。

Claims (4)

1.一种RGD-石墨烯/ MnO2空心磁性纳米球的复合探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1.1、MnO2空心磁性纳米粒子的制备：
1.1.1、在1-十八烯中，油酸锰和油酸在300-350℃下反应20-40min，油酸锰与油酸的摩尔比为1-3:1，得到油酸包裹的MnO2实心磁性纳米粒子，记为OA@ SMnO2；
1.1.2、将OA@ SMnO2分散于氯仿中，然后加入去离子水和牛血清白蛋白，OA@ SMnO2与牛血清白蛋白的质量比为1:4-6，超声分散均匀，在室温下搅拌0.5-1.5天，得到表面修饰牛血清白蛋白的OA@ SMnO2，记为BSA-OA@SMnO2；
1.1.3、将BSA-OA@SMnO2加入到pH=4-6的弱酸性溶液中进行刻蚀，反应20-28h，得到MnO2空心磁性纳米粒子，记为HMnO2；
1.2、HMnO2/Graphene的制备：
将HMnO2分散在去离子水中，得到HMnO2悬浮液，将氧化石墨烯分散在去离子中，得到氧化石墨烯悬浮液，将HMnO2悬浮液加入到氧化石墨烯悬浮液中，HMnO2与氧化石墨烯的质量比为8-12:1，在室温下搅拌0.5-1.5h，得到石墨烯/MnO2空心磁性纳米球，记为HMnO2/Graphene；
1.3、RGD-HMnO2/Graphene的制备：
将HMnO2/Graphene分散在去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和环肽RGD，其中HMnO2/Graphene、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐、N-羟基琥珀酰亚胺和环肽RGD的质量比为1:0.5-2.5:0.5-1.5:0.5-1.5，搅拌1-3h，得到RGD-石墨烯/MnO2空心磁性纳米球的复合探针，记为RGD-HMnO2/Graphene。
2.根据权利要求1所述的RGD-石墨烯/ MnO2空心磁性纳米球的复合探针的制备方法，其特征在于：步骤1.1.1中，以3.3℃/min的加热速率加热到320℃。
3.根据权利要求1所述的RGD-石墨烯/ MnO2空心磁性纳米球的复合探针的制备方法，其特征在于：步骤1.1.3中，所述的弱酸性溶液为pH=4的PBS缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的RGD-石墨烯/ MnO2空心磁性纳米球的复合探针的制备方法，其特征在于：步骤1.3中，将HMnO2/Graphene分散在去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐搅拌过夜以活化羧基，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和环肽RGD。
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Synthesis of manganese dioxide/iron oxide/graphene oxide magnetic nanocomposites for hexavalent chromium removal;Yan Liu et al.;《RSC Adv.》;20150615;第5卷;第54156-54164页 *
石墨烯/Mn02空心磁性纳米球复合探针用于肺癌靶向诊疗;毛小微等;《第十九届全国波谱学学术会议》;20160817;全文 *

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