CN104546832A - 一种药物组合物在制备治疗脓毒症药物中应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物组合物在制备治疗内毒素血症引起的相关疾病的药物中的应用，所述的药物组合物含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片，所述疾病包括但不限于全身炎症反应综合征、脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克，以及脓毒症相关的弥漫性血管内凝血、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭综合征。

Description

一种药物组合物在制备治疗脓毒症药物中应用
技术领域
本发明属于制药领域，涉及3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和冰片组合物在治疗各种原因导致的内毒素血症引起的相关疾病的应用。 
背景技术
脓毒症是严重创(烧)伤、休克、外科大手术后常见的并发症，可进一步发展为脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，美国每年有75万例脓毒症患者，并且这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％(J.Clin.Invest.2003，112：460-467)。 
脓毒症的并发症是脓毒症病理生理各阶段过程中的临床表现，常见的并发症包括休克、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、深静脉血栓(DVT)形成、应激性溃疡、代谢性酸中毒、弥漫性血管内凝血(DIC)直至多器官功能障碍综合征(MODS)。 
脓毒症的根本发病机制尚未明了，涉及到复杂的全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关，脓毒症的发病机制仍需进一步阐明。 
脓毒症可以由任何部位的感染引起，临床上常见于肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等。脓毒血症和感染性休克最常见的致病菌为革兰阴性细菌(主要包括大肠埃希菌，克雷伯菌和铜绿假单胞菌)。近20年来，革兰阳性细菌(如葡萄球菌，链球菌)感染不断上升，并已占全部病例约50％。重度脓毒症治疗指南一如既往的基础治疗首先是需要利用抗生素控制感染源。 
脓毒症过程中的氧化应激通过脂质过氧化以及血浆中的抗氧化物反应出来，其中的氧化损伤或许是导致细胞损伤、器官功能失调、机体死亡的重要原因。氧化剂使细胞产生过氧化脂质，大量氧自由基作用于脂质使过氧化脂质升高，导致组织损伤。氧自由基导致线粒体的肿胀、线粒体功能失调、脂质过氧化、呼吸作用的抑制以及线粒体抗氧化剂的耗竭。氧化损伤中长时间暴露于NO导致细胞损伤，这种损伤以旁分泌或自分泌的形式进行，从而抑制细胞 的呼吸，导致血流分布不均匀，增加肠道的通透性，导致过氧化物的产生，缺血再灌注导致肠道超氧化物岐化酶的产生，从而氧自由基水平增高，大量的过氧化物从一氧化氮产生。一氧化氮生成增加意味着肠道损伤、肠道功能失调、细菌移位。 
天然免疫细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞等)通过表明的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor，PRR)识别病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern，PAMP)，包括脂多糖、肽聚糖、胞壁酸、鞭毛蛋白、脂磷壁酸等各种细菌的细胞壁成分，能激活细胞内多条信号，使免疫细胞内转录因子(NF-κB、APl、Fos、c-Jun等)激活，导致大量细胞因子释放。固有层和粘膜包含大量的免疫细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、以及中性粒细胞。脓毒症状态下，这些细胞释放大量的细胞因子，包括IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α等。IFN-γ和TNF-α可以增加病理状态下肠粘膜上皮细胞的通透性。上皮内淋巴细胞分泌的IFN-γ是完全胃肠外营养导致肠粘膜功能丧失的重要因素。IFN-γ导致iNOS的表达增加，特别是联合TNF-α以及IL-1β时，这种作用更加明显。目前认为细胞因子增加iNOS从而导致肠粘膜的通透性增加。 
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(依达拉奉，edaravone)作为一种新型强效的自由基清除剂，可以清除羟自由基(·OH)、一氧化氮自由基(NO·)、过氧亚硝基离子(ONOO-)(Chem Pharm Bull2004，52(2)：186-91；Redox Rep.2002，7(4)：219-22.J PharmacolExpTher.2007Jul；322(1)：274-81)，抑制细胞过氧化损伤，作为一种有效的神经元保护剂(自由基清除剂)具有分布广、半衰期断、安全、毒性低等优点，为临床缺血性脑卒中有效的一线治疗药物(中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2010版))。动物药效表明，依达拉奉对LPS诱导的脓毒血症和CLP引发的脓毒症有明确疗效，能降低动物死亡率，减少动物肺、肝等器官损伤(J PharmacolExpTher.2003，307(1)：74-82；Shock.2009，32(6)：586-92；TohokuJExp Med.2011，223(4)：235-41；大连科学大学学报2012，34(4)：343-347)。专利CN200510009561.1也说明依达拉奉能降低LPS诱导动物死亡率，改善心肌收缩力，降低氧化损伤。依达拉奉的结构式如下： 
冰片分为合成冰片和天然冰片。合成冰片含有异龙脑，对人体有毒副作用；而天然冰片不含异龙脑。天然冰片属于双环单萜类的化合物，可以由龙脑香科植物挠脑香 DryobalanopsaromaticaGaertn.f.树脂的加工结晶品(传统医药2006，15(9)：57)，还存在于多种药用植物的挥发油中，包括缬草(Valerianaoffi cinalis)，甘菊(Matricariachamomilla)，薰衣草(Lavandulaoffi cinalis)等(BiochemPharmacol.2005，69(7)：1101-11)。研究表明，天然冰片有较强的抑炎作用，可能是通过抑制转录因子NF-κB激活，抑制炎性蛋白(iNOS和COX-2)表达和炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β等)释放，从而细胞保护的作用(Neuroscience.2011，176：408-19；华西药学杂志2006，21(6)：523-526)。天然冰片能透过血脑屏障，能保护减少脑梗死面积和缺血诱导产生的炎症反应，并改善能量代谢，从而减少缺血性脑损伤(华西药学杂志2005，20(4)：323-325；新乡医学院学报2006，23(1)：23-25)。动物实验表明，天然冰片还能改善大鼠凝血功能，抗血栓活性(Am J ChinMed.2008；36(4)：719-27)。另外，天然冰片还能增强抑制性氨基酸GABA受体活性(BiochemPharmacol.2005，69(7)：1101-11)。天然冰片结构式如下： 
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和天然冰片质量比4∶1组合物已在临床II试验，用于治疗缺血性脑卒中。临床前动物实验表明，两者质量比4∶1～1∶1组合物能协同性减少脑梗死面积(专利CN 101848711 B)。根据上述脓毒症发病机制，选择3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和天然冰片的组合物，发挥两者清除自由基和抑制炎症作用机制，协同性阻断脓毒症发病过程中过激的炎症反应，降低组织损伤，从而降低脓毒症死亡率。 
发明内容
本发明目的是提供一种药物组合物在制备治疗内毒素血症引起的相关疾病的药物中的应用，所述的药物组合物含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片，更进一步地，此药物组合配合使用能协同性增加治疗内毒素血症引起的相关疾病的药效。 
本发明所述的冰片包括天然冰片。 
本发明所述相关疾病包括全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症(sepsis)、重度脓毒症(severe sepsis)、脓毒性休克(sepsis shock)，以及脓毒症相关的弥漫性血管内凝血(DIC)、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官衰竭综合征(MOFS)。 
优选地，将上述组合物用于制备治疗脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克。 
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮的用途专利文献CN200510009561.1披露：尾静脉给药依达拉奉1.5，3，6mg/kg，能显著改善LPS诱导脓毒症大鼠症状指标，包括动物存活率等。 
本发明人发现3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和天然冰片的组合物在治疗脓毒症的疗效明确，比3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮单独用药效果更好，特别在降低死亡率、减少炎症因子产生、改善组织损伤等方面具有明显的优效性，能显著增加生存率和中位生存期，减少脓毒症中过激的炎症反应，从而减少器官损伤。 
优选地，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与天然冰片的重量比为10∶1～1∶10，优选的重量比为4∶1～1∶4，进一步优选的重量比为4∶1～2∶1，更优选为为10∶1、4∶1、2∶1、1∶2、1∶4或1∶10。 
本发明提供了3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和天然冰片的组合物的合适给药途径和给药频率。因为患者体内炎症反应过激，病情危重，死亡率高，最好通过静脉注射方式给药，并且每天两次连续多天给药疗效更佳。 
附图说明
图1组合物(4：1)对CLP模型小鼠存活率的影响。 
图2-A不同剂量依达拉奉对CLP模型大鼠存活率的影响。 
图2-B组合物(4：1)对CLP模型大鼠存活率的影响。 
图3-A组合物(4：1)对重度脓毒症大鼠血浆中TNF-α(A)含量的影响。 
图3-B组合物(4：1)对重度脓毒症大鼠血浆中IL-6(B)含量的影响。 
图4不同比例组合物对脓毒症大鼠存活率的影响。 
图5LPS气道滴入及药物处理后的6h、12h、24h肺组织的病理改变(400X)。 
图6-A表示组合物(4：1)对MLE-12细胞分泌KC(角化生长因子)的影响。 
图6-B依达拉奉对MLE-12细胞分泌KC(角化生长因子)的影响。 
图6-C天然冰片对MLE-12细胞分泌KC(角化生长因子)的影响。 
具体实施方式
下述实施例举例说明本发明，不应被认为是对本发明的限制。实施例中提及的依达拉奉是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。 
实施例1：复制小鼠CLP脓毒症(重度)模型 
雄性BALB/c小鼠，体重25-30g，实验前一天腹部脱毛。以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，麻醉后固定，用碘伏消毒；沿腹部中线作1.5切口找到盲肠，仔细剥离肠系膜，在盲肠根部结扎盲肠，避免结扎回肠及盲肠系膜血管。用16号针头穿刺盲肠3次，挤出少量肠内容 物。再将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，术毕，涂上青霉素眼药膏预防感染，创可贴包扎伤口，手术完成后20min左右，小鼠恢复活动能力。CLP手术术前，小鼠活泼好动，皮毛光华柔顺，嘴唇、前后爪红润，进食、饮水主动，排便正常；CLP手术后，小鼠表现为精神萎靡，竖毛，嘴唇、前后爪瘀红，进食、饮水减少，大便稀溏，眼睛出现充血，发烧发热；术后8-30h内小鼠陆续死亡。尸检发现多器官异常，发生病理性损伤。这些表明模型成功。 
实施例2：组合物(4：1)单次给药对CLP模型小鼠存活率的影响 
BALB/c小鼠，雄性，64只，随机分为假手术组、脓毒症模型组、依达拉奉治疗组(单次i.v.，6mg/kg)和组合物(4：1)治疗组(单次i.v.，7.5mg/kg)。 
组合物(4：1)表示依达拉奉3mg/kg+天然冰片0.75mg/kg。 
依达拉奉注射液，规格5mL：10mg(其中含依达拉奉10mg)，南京先声东元制药有限公司生产；组合物(4：1)注射液，规格为5mL：12.5mg(其中含依达拉奉10mg和天然冰片2.5mg，溶解于8％1，2，-丙二醇水溶液)。两者使用前用生理盐水稀释到所需浓度。CLP造模后30分钟尾静脉缓慢推注(＜5min)。 
上述4组动物术后每4小时统计一次动物死亡情况，结果表明，依达拉奉能延缓动物死亡，提高动物中位生存期；组合物(4：1)能降低动物死亡率，延长脓毒症小鼠中位生存期，其药效优于依达拉奉治疗组(见图1和表1)。 
表1各组小鼠中位生存期(n＝16) 
实施例3：复制大鼠CLP脓毒症模型 
雄性SD大鼠，体重250-280g，以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后固定、腹部脱毛、消毒、铺无菌洞巾。沿腹正中线作1.5cm切口，找到盲肠，仔细剥离肠系膜，在盲肠根部结扎盲肠，避免结扎回肠及盲肠系膜血管。用16号针头穿刺盲肠2次，挤出少量肠内容物。再将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，术毕。立即动物皮下注射预热的生理盐水10mL抗休克。CLP手术术前，大鼠活泼好动，皮毛光华柔顺，嘴唇、前后爪红润，进食、饮水主动，排便正常；CLP手术后，大鼠表现为精神萎靡，竖毛，嘴唇、前后爪瘀红，进食、饮水减少，大便稀溏；术后12-48h内大鼠陆续死亡。尸检发现多器官异常，发生病理性损伤。这些表明模型成功。 
实施例4：组合物(4：1)多次给药对CLP模型大鼠存活率的影响 
80只SD大鼠，随机分为假手术组、CLP模型组、依达拉奉治疗组(3mg/kg)和组合物(4：1)治疗组(3.75mg/kg，其中含依达拉奉3mg/kg和天然冰片0.75mg/kg)。给药用生理盐水稀释 至给药体积为10mL/kg。CLP造模后30min，经尾静脉注射，之后每间隔12h尾静脉给药1次，每天给药两次(BID，每12h给药一次)。CLP给药后每4h记录大鼠死亡情况。 
依达拉奉新用途专利文献CN200510009561.1披露单次尾静脉给药依达拉奉1.5、3、6mg/kg，能显著改善LPS诱导脓毒症大鼠存活率。本发明研究发现，依达拉奉1.5和3mg/kg(BID)治疗能显著改善动物生存率，但是高剂量依达拉奉6mg/kg(BID)对动物存活率无改善，反而在24h后增加动物死亡率(见图2-A)。组合物(4：1)3.75mg/kg(BID)治疗效果明显优于依达拉奉最佳治疗组(3mg/kg，BID)，不仅提高了动物的中位生存期，也提高了重度脓毒症动物的存活率(见图2-B和表2)。这说明组合物中天然冰片能增加依达拉奉治疗脓毒症的药效。 
表2各组大鼠中位生存期(n＝20) 
实施例5：组合物(4：1)给药对脓毒症大鼠血浆中炎症因子的影响 
24只SD大鼠，随机分为假手术组、CLP模型组、依达拉奉治疗组(3mg/kg)和组合物(4：1)治疗组(3.75mg/kg，其中含依达拉奉3mg/kg和天然冰片0.75mg/kg)。CLP造模后30min，经尾静脉注射一次；给药后分别于2h和6h经眼眶采血，分离血浆，利用大鼠ELISA试剂盒(依科赛ExCell公司)分别检测TNF-α和IL-6含量。图3中柱形图数据表示为mean±SD；t-test分析结果表示为：&&&&，p＜0.0001，与假手术相比；****，p＜0.0001，与CLP模型组相比；##，p＜0.01，###，p＜0.001，与依达拉奉3mg/kg组相比。 
如图3-A和图3-B所示，CLP手术后大鼠血浆中TNF-α(2h)和IL-6(6h)显著升高。依达拉奉给药组血浆中TNF-α和IL-6水平显著下降，而组合物(4：1)组大鼠血浆中TNF-α和IL-6含量比依达拉奉组更低。这表明依达拉奉能减少CLP引起的炎症反应，而组合物抑制炎症的作用明显优于依达拉奉，能更好地控制脓毒症大鼠体内过激的炎症反应。 
实施例6：不同比例组合对脓毒症大鼠生存率的影响 
不同比例组合物，包括依达拉奉：天然冰片质量比分别为10∶1，4∶1，2∶1，1∶2，1∶4和1∶10，其配置方法见表3。组合物溶剂为含8％1，2-丙二醇的生理盐水。给药前将上述组合物用生理盐水稀释至给药体积。 
表3组合物配置表及动物给药体积 
*，组合物先用1，2-内二醇溶解充分后，用预热的生理盐水稀释。 
108只SD大鼠，随机分为假手术组、CLP模型组、组合物(10：1)治疗组(3.3mg/kg)、组合物(4：1)治疗组(3.75mg/kg)、组合物(2：1)治疗组(4.5mg/kg)、组合物(1：2)治疗组(9mg/kg)、组合物(1：4)治疗组(15mg/kg)和组合物(10：1)治疗组(33mg/kg)。各组给药剂量为依达拉奉3mg/kg和天然冰片分别为0.3mg/kg，0.75mg/kg，1.5mg/kg，6mg/kg，12mg/kg和30mg/kg。给药方式为尾静脉注射，每天给药两次(BID，每12h给药一次)。CLP手术复制重度脓毒症模型后30min尾静脉给药，之后每间隔12h尾静脉给药1次(BID)；CLP给药后每4h记录大鼠死亡情况。 
如图4和表4所示，在所设计的不同比例组合中，组合物(4：1～1：4)对动物的存活率和中位生存率均有改善较好。从动物存活率(图4)发现，随着组合物中天然冰片成分增加表现两阶段：较低剂量天然冰片能增加依达拉奉提高动物存活率，但高剂量天然冰片作用反而不利用动物后期的存活，可能高剂量天然冰片(12，30mg/kg，BID)多次给药对重度脓毒症动物有一定毒性。 
表4各组大鼠中位生存期(n＝16) 
实施例7：复制小鼠急性肺损伤(ALI)模型及组合物对肺组织损伤的影响 
健康雄性C57BL/6小鼠，7～8周，体重20～23g。将85只C57雄性小鼠随机组，每组5-6只，气道滴入LPS1mg/kg后立即阴茎静脉注射组合物(4：1)(12.5mg/kg，其中含依达拉奉10mg/kg和天然冰片2.5mg/kg)、依达拉奉(10mg/kg)、天然冰片(2.5mg/kg)、地塞米松(5mg/kg)及生理盐水等进行干预，正常对照组气道滴入生理盐水。LPS滴入后6h、12h、24h分三批处死动物，结扎右肺后，暴露气管行气管插管，用生理盐水液1mL分2次进行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，回收率达90％，混匀后进行细胞总数计数，以250×g离心10min，取细胞沉淀涂片，凉干后行瑞氏染色，做细胞分类计数。取右下肺叶用中性福尔马林液固定(n＝3)，石蜡切片，HE染色。 
单次静脉注射组合物对ALI小鼠肺组织病理学的影响如下： 
如图5所示，ALI小鼠大体观察发现，气道滴入LPS造模组小鼠的肺组织表面有点状出血点、水肿区域，而生理盐水对照组肺外观无这些异常改变。组织病理切片镜下可见气道管腔内、血管腔内有大量中性粒细胞聚集，肺组织间隙可见大量中性粒细胞浸润和红细胞渗出，肺泡内有蛋白水肿液，肺泡间隙边缘有轻度透明膜形成。随时间延长，LPS诱导的肺组织炎症浸润增加明显，24h时组织炎症细胞浸润已导致组织结构上的破坏。 
LPS诱导6h时，各给药组肺组织损伤程度均比LPS模型组轻。在LPS造模后相同时间点(分别为6、12和24h)，组合物(4：1)组整体病理改变比依达拉奉和天然冰片轻，提示组合物(4：1)能更好低保护急性肺损伤。 
实施例8：组合物对小鼠上皮细胞(MLE-12)功能的影响 
肺上皮细胞也是肺防御屏障的重要细胞，肺部炎症反应的启动细胞。本试验采用LPS诱导小鼠肺上皮细胞系(MLE-12)制作炎症模型。2×105cel l/ml MLE-12细胞重悬于完全培养基(Gibco RPMI-1640培养基+4％FBS)中，再接种于48孔板，培养24h后，分别预孵育组合物(4：1)、依达拉奉、天然冰片(终浓度均为1mM)15min，再用LPS(终浓度1μg/mL)诱导细胞。分别于LPS刺激后1h、3h、6h、9h、12h、24h收获上清(n＝3)。采用R&D公司的Duo-set试剂盒测定KC(角化生长因子)含量。 
如图6A、6B、6C所示，组合物(4：1)能明显抑制LPS刺激的小鼠肺上皮细胞释放KC，提示可以改善LPS诱导的急性肺损伤的初始炎症反应。依达拉奉只有在早期有一定作用，12h以后抑制作用消失；而天然冰片对KC的影响在9h以后开始显现。这提示，组合物(4：1)结合了两者对KC的作用，从给药后的0～24h全程发挥抑制KC释放的作用。 

Claims (9)

1.一种药物组合物在制备治疗内毒素血症引起的相关疾病的药物中的应用，所述的药物组合物含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片。
2.根据权利要求1所述组合的任一项应用，其特征在于所述3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为10∶1～1∶10。
3.根据权利要求6所述应用，其特征在于所述的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为4∶1～1∶4。
4.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为4∶1～2∶1。
5.根据权利要求6所述应用，其特征在于所述的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为10∶1、4∶1、2∶1、1∶2、1∶4或1∶10。
6.根据权利要求1-5所述的应用，其特征在于，所述疾病包括全身炎症反应综合征、脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克，以及脓毒症相关的弥漫性血管内凝血、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征或多器官衰竭综合征。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述疾病包括脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克。
8.根据权利要求1-5所述的应用，其特征在于所述的冰片为天然冰片。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的冰片为天然冰片。
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