CN104546505B - 一种抑菌性义齿软衬材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抑菌性义齿软衬材料，该抑菌性义齿软衬材料通过杜仲胶复合得到，也可以称为杜仲胶复合义齿软衬材料，它包括橡胶基质、硫化活性剂、氧化镁、硬脂酸、升华硫、含硫促进剂、防老剂；其中，所述橡胶基质由杜仲胶和顺丁橡胶组成，杜仲胶占橡胶基质的质量百分含量大于90％。该义齿软衬材料具有一定的抑菌性，特别是针对白色念珠菌有较强的抑制作用。

Description

一种抑菌性义齿软衬材料及其应用

技术领域

本发明属于义齿软衬材料技术领域，具体涉及具有抑菌性的义齿软衬材料及其应用。

背景技术

义齿软衬材料(denture soft lining materials)，又名弹性义齿衬垫材料，可利用其弹性形变缓冲咬合力，紧密义齿组织面与牙槽粘膜接触关系，并可利用组织倒凹区改善义齿固位，是临床上常用的缓解活动义齿佩戴过程中出现的固位不良、反复压痛、咀嚼效率低等症状的重要措施之一。作为一种可长期使用并与口腔黏膜表面接触的材料，其性能的稳定性及易引发的口腔黏膜疾病是限制其应用的主要因素。其中，由白色念珠菌(candida albicans，C.albicans)粘附所引发的义齿性口炎是软衬材料在临床应用中常见的问题之一，如何对软衬材料进行改性以减少甚至消除白色念珠菌对其的粘附，是临床上迫切需要解决的问题。

丙烯酸树脂及硅橡胶树脂是目前临床上比较常用的义齿软衬材料。丙烯酸树脂类材料物理性能稳定，具备较强的粘结性能及较高的弹性模量，且微生物不易附着其上。但长期使用过程中，存在增塑剂析出等问题，伴随义齿性能的改变。而硅橡胶类软衬材料弹性更好，化学稳定性更强，长期使用不存在增塑剂析出问题，有学者进行临床调查研究，发现热聚合型硅橡胶的使用寿命可超过4年，83％的患者使用可超过6年；但内部结构较疏松，不易打磨抛光，易造成白色念珠菌的粘附聚集，且粘接力不足，需要辅以特殊的粘结剂来增加材料与基托树脂间的粘结强度。

义齿软衬材料作为一种可长期使用并与口腔黏膜表面接触的材料，其性能稳定性及易引发的口腔黏膜疾病是限制其应用的主要因素。义齿软衬材料与义齿性口炎发生的关系，是临床医师关注的重要问题。而导致义齿性口炎发生的关键是微生物尤其是白色念珠菌对软衬材料的粘附。因此研发一种可在生理状态下保持稳定、具有良好粘接性能并能抗白色念珠菌感染的义齿软衬材料，具有重要的临床意义。

临床上常采用加入抗菌剂的方法改善义齿软衬材料的抗菌性能，以期减少或消除白色念珠菌的粘附。常用的抗菌剂大致可分为四类：高分子抗菌剂、天然抗菌剂、有机抗菌剂、无机抗菌剂。无机抗菌剂主要的抗菌能力来源于银、锌、钛等无机金属及其离子，耐热性好、有效期长、不易产生耐药性，是临床上常用的抗菌剂。而有机抗菌剂其抗菌能力主要来源于季铵盐类、双肌类、醇类等有机物，具备杀菌能力强、作用迅速等优点，但其缺点同样明显，物理及化学性能稳定型差、细胞毒性大、易产生耐药性、引发菌群失衡、浓度依赖、药物半衰期至有效周期短等，限制其应用于软衬材料的改性。

杜仲，被子植物门，杜仲科杜仲属，是世界上非常珍贵的植物。我国杜仲森林资源丰富，总量占到了全世界的95％，种植面积达400万亩，种植范围遍及全国，可种植范围远远超过了三叶橡胶树，且不与农田争地。因此，国家正在积极推广杜仲的开发利用。杜仲树的叶、皮及种子中富含杜仲胶，它是我国特有的天然高分子资源，国际上习惯称为古塔波胶(Gutta-percha)或巴拉塔胶(Balata)。杜仲胶是典型的柔性链高分子，软化点只有60℃左右，具备优良的操作加工性能，室温下质硬、耐摩擦、熔点低，并具有高度的绝缘性、耐水性、耐酸碱性、耐强烈溶剂性，可用于特殊材料及医用器材，如医用夹板、假肢套、护膝、腰托等。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抑菌性的义齿软衬材料及其应用。该义齿软衬材料具有高弹性和适合的力学性能，吸水性与Silagum硅橡胶软衬材料接近，显著低于丙烯酸酯软衬材料，且溶解性也维持在比较低的水平，对体外培养的小鼠成纤维细胞L929没有毒性，初步认为其生物相容性良好。该义齿软衬材料具有一定的抑菌性，特别是针对白色念珠菌有较强的抑制作用，可以用于治疗义齿性口炎等。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种抑菌性义齿软衬材料，按照重量份计算，配方为：

其中，所述橡胶基质由杜仲胶和顺丁橡胶组成，杜仲胶占橡胶基质的质量百分含量大于90％。

所述抑菌性义齿软衬材料优选配方为：

橡胶基质 100份；

硫化活性剂 2份；

氧化镁 2份；

所述硫化活性剂优选为氧化锌。

所述含硫促进剂优选为N-环己基-2-苯并噻唑次磺酰胺所述杜仲胶和顺丁橡胶的质量比例优选为：90∶10。

所述抑菌药物可以为作为治疗义齿口炎的材料。抑菌性义齿软衬材料优选为抑制真菌。所述真菌优选为白色念珠菌。

所述杜仲胶可以是市购产品，也可以通过以下制备方法制备：首先将杜仲叶粉碎，加水浸提，过滤，弃去水提液；取渣加碱在140℃-160℃高温蒸煮3-5小时，然后弃去碱液，反复在蒸馏水中洗涤直至水洗液呈中性，烘干，加石油醚回流提取2-3次，每次1-2小时，合并石油醚提取液，减压浓缩至稠膏状，再加乙醇洗涤，离心，取沉淀物，真空干燥，获得杜仲胶。

所述抑菌性义齿软衬材料的制备方法，具体步骤包括：

按照所述重量份配比，将杜仲胶、顺丁橡胶、硫化活性剂、氧化镁、硬脂酸、含硫促进剂按顺序依次加入，于70℃-80℃下混匀，然后降温，待却至常温后，加入升华硫混匀；然后放置22-26小时之后，于140℃-160℃下硫化20-40分钟成型，硫化压力为9.5MPa-10.5MPa，待材料固化后脱模。

下面对本发明做进一步解释和说明

单纯由杜仲胶及填料制成的硫化胶硬度、强度过高，与软衬材料的应用要求差距太大。因此应当首先合理的拟定基础配方，加入橡胶添加剂混炼，辅以各种配料、助剂，软化杜仲胶，抑制其结晶。

选择良好的橡胶基质对于最终材料的性能具有决定的意义，本研究之所以选择高顺式顺丁橡胶作为橡胶添加剂与杜仲胶共混，是因为高顺式顺丁橡胶分子间力小，分子量高，强度低，在常温无负荷时呈无定形态，塑形能力强，是弹性和耐寒性最好的合成橡胶，具备良好的操作性能。而纯杜仲胶力学强度非常高，具备优异的共混性能及综合加工性能[，和顺丁橡胶共混后很好地弥补了高顺式顺丁橡胶强度低的问题，又由于动态能耗低，大大改进顺丁胶的动态疲劳性能。二者在部分力学性能上形成良性互补，既保证了硫化胶具备一定的强度，又同时获得了良好的弹性。

在基础配方的选择上，选用的氧化锌是硫化活性剂，氧化镁可以在高温状态下防止弹性杜仲胶材料焦烧，硬脂酸可以起到分散填料，促进硫化的作用，而防老剂可以提高耐磨耗性能，延长硫化胶使用寿命。

本实验之所以选用硬度，拉伸强度和断裂伸长率三项力学性能指标作为评判标准，是因为以上三种力学性能密切贴合了义齿软衬材料的临床使用要求。

在橡胶工业中，测试硬度的手段非常简便、快捷，可现场实施。硬度是物质受压变形程度或抵抗刮擦、刺入等引发形变的能力，反映了材料的刚性。具备适当的硬度是义齿软衬材料的必要条件，保证其具备柔性和舒适性。硬度的数值与硬度计有关，使用不同的硬度计得到的硬度值也不一样。本实验选用的是弹性体中常用的邵式A硬度，由便携式邵氏A型硬度计测定，该硬度计结构简单，适合生产检验。

拉伸强度是在拉伸试验过程中，试样直至断裂为止所受的最大拉伸应力，反映制品能够抵抗拉伸破坏的极限能力，是橡胶制品的重要指标之一。对于义齿软衬材料来说，拉伸强度可以反映其在使用过程中抵抗外力撕裂的能力。

断裂伸长率是指试样拉断时的位移值与原长度的比值，以百分比(％)表示。对于义齿软衬材料来说，断裂伸长率可以反映其发生断裂前的延伸能力。

通过本实验研究发现，随着杜仲胶在橡胶基质中所占比例的增大，弹性杜仲胶材料硬度、拉伸强度和断裂伸长率随之逐渐升高，显示二者共混既改善了杜仲胶生胶强度过高的缺点，又弥补了顺丁橡胶强度过低，加工性能不佳的缺陷。

参照临床上常用的硅橡胶义齿软衬材料和氟硅橡胶的力学性能，义齿软衬材料邵氏硬度A应不超过80，拉伸强度能够达到2.5MPa，断裂伸长率在100％～200％之间。由力学性能测试结果可看出，当杜仲胶与顺丁橡胶共混比例为70∶30时，适量添加氧化锌、氧化镁、硬脂酸、升华硫、促进剂N-环己基-2-苯并噻唑次磺酰胺(CZ)、防老剂等助剂，杜仲胶复合义齿软衬材料可获得适宜的力学性能。

对于义齿软衬材料来说，拉伸强度和断裂伸长率越大越好，硬度要适中。硬度过高，舒适度差，如果太软，又达不到分散局部压力作用。添加高比例的杜仲胶基质来提高制品的强度，存在着相矛盾的问题，即拉伸强度和断裂伸长率的提高总是伴随着硬度的增高，因此杜仲胶基质加入量的确定，需要在3种性能中寻找平衡。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1.本发明的抑菌性义齿软衬材料采用杜仲胶与顺丁橡胶共混，适量添加氧化锌、氧化镁、硬脂酸、升华硫、促进剂CZ、防老剂，可制备出力学性能适宜的高弹性杜仲胶复合义齿软衬材料。

2.本发明的抑菌性义齿软衬材料的吸水性与Silagum硅橡胶软衬材料接近，显著低于丙烯酸酯软衬材料，且溶解性也维持在比较低的水平。

3.本发明的抑菌性义齿软衬材料对体外培养的小鼠成纤维细胞L929没有毒性，初步认为其生物相容性良好。

4.本发明的抑菌性义齿软衬材料具有一定的抑菌性，特别是针对白色念珠菌有较强的抑制作用，可以用于治疗义齿性口炎等。

附图说明

图1是实施例2各组残存白色念珠菌浓度对比图(×10³CFU/mL)。

图2是实施例2各组对白色念珠菌抗菌率对比图(R％)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1.配方和制备方法

配方：

其中，所述橡胶基质由杜仲胶和顺丁橡胶组成，杜仲胶和顺丁橡胶的质量比例为：10-90∶90-10。

制备方法：

按照所述重量份配比，将杜仲胶、顺丁橡胶、硫化活性剂、氧化镁、硬脂酸、含硫促进剂按顺序依次加入，于70℃-80℃下混匀，然后降温，待却至常温后，加入升华硫混匀；然后放置22-26小时之后，于140℃-160℃下硫化20-40分钟成型，硫化压力为9.5MPa-10.5MPa，待材料固化后脱模。

2.材料与方法

2.1主要材料

2.2主要设备

主要材料与设备 来源

XK开放式炼胶机 江都市天源试验机械厂

2.3杜仲胶的提取

采用石油醚-乙醇法，首先将成熟且干燥的杜仲叶粉碎成小块，加6倍量水浸提1.5小时，过滤，弃去水提液；取药渣加入9％的NaOH在150℃下高温蒸煮4小时，使其中的纤维素、木质素等物质分解，然后弃去碱液，反复在蒸馏水中洗涤直至水洗液呈中性，于60℃烘干药渣，加石油醚适量回流提取2次，每次1.5小时，合并石油醚提取液，减压浓缩至稠膏状，再加适量乙醇洗涤2次，离心，取沉淀物，真空干燥，获得杜仲胶。

2.4杜仲胶复合义齿软衬材料(即本发明的抑菌性义齿软衬材料)的制备

2.4.1基础配方

拟定基础配方见下表(表2-1)：

表2-1.自制杜仲胶复合义齿软衬材料基础配方

*PHR-Parts per hundred resin，含义是指橡胶质量为100份时，其它物质相对于橡胶质量的份数

2.4.2试件制备

按照杜仲胶与顺丁橡胶混炼比例不同进行初次分组，即杜仲胶/顺丁橡胶分别为10∶90，30∶70，50∶50，70∶30，90∶10共5组。

上述配方按照杜仲胶、顺丁橡胶、氧化锌、氧化镁、硬脂酸、含硫促进剂CZ的顺序依次加入，在炼胶机上于80℃混匀，然后对炼胶机降温，待炼胶机冷却至常温后，加入升华硫混匀，在2mm辊距下混合5遍，1mm辊距下5遍，约30分钟。直至基胶变得均匀、细腻。

放置24小时之后，然后在液压机上于150℃下硫化30分钟成型，硫化压力为10MPa，待材料固化后脱模。

2.5杜仲胶义齿软衬材料力学性能测试

2.5.1硬度测试

将裁切成哑铃状的试件室温下放置24小时后方可进行力学性能检测，按GB/T531.1-2008的标准测试试片的邵氏硬度A。23±2℃室温，50％湿度条件下，将试件用酒精棉球擦拭干净，放置于玻璃平台工作板上，玻璃板厚度须超过5mm，且与地面平行。垂直向将便携式硬度计的压针压入试件表面，直到压力与反作用力相平衡，记录刻度盘度数。每个点只测一次，每个试样测5个点，各点之间相距不少于1cm。

2.5.2拉伸强度和断裂伸长率测试

将在液压机硫化成型的胶片，按GB/T528-1998标准使用切样机(切刀标距长1.5cm，宽0.4cm，总长5.5cm))将胶片剪裁为哑铃状标准拉伸试件，供拉伸测试使用，每个实验组制备5个试件。

拉伸强度及断裂伸长率按GB/T 528-2009的标准进行。

2.6杜仲胶复合义齿软衬材料吸水性、溶解性的测试

在本次试验中，我们选择两种在临床上常用的丙烯酸树脂和硅橡胶材料作为参照对象，分别在蒸馏水和人工唾液两种介质中放置7天和30天，与新研制的杜仲胶复合义齿软衬材料进行对比研究。

2.6.1试样制备、分组

在(23±2)℃、(50±10)％相对湿度环境下制备所有试样、进行实验。按照产品使用说明书制备对照组两种义齿软衬材料试样，仔细测量每一个试样，确保试样为直径10±0.1mm，厚度2.0±0.1mm的圆型试片，上下表面光滑平整。材料共分为7组，即杜仲胶复合义齿软衬材料(5组)、Silagum硅橡胶软衬材料组、丙烯酸酯类自凝软衬材料组，每组5个试样。

2.6.2人工唾液配制

人工唾液的配方如下表所示：加入1000ml蒸馏水，调节PH至7.0，配置完成后将人工唾液放入恒温水浴(37℃)中，搅拌均匀，备用。

表2-2人工唾液的组成

2.6.3实验步骤

(1)试样的恒定：将制备好的所有试样在蒸馏水中超声清洗10min，然后在3个大气压、121℃条件下消毒20min，然后放在(37±1)℃的干燥器中贮存24h，后移至室温的干燥器中贮存30min，然后称量所有组别试样，精确到0.01mg。多次测量，直到获得恒定质量，即在连续称量时，两次测量之间质量损失不大于0.02mg。记录为m₁。

(2)试样的浸水：分别将各组试样放入(37±1)℃的蒸馏水和人工唾液中贮存7d±2h、30d±2h。然后分别将试样从水中取出，用吸水纸轻轻拭干肉眼可见的水渍，在空气中晾干15s，在从水中取出1min左右时，称重(精确到0.01mg)，记录为m₂。

(3)试样再恒定：将试样再次放入干燥器中，当质量再次恒定时，记录为m₃。再恒定条件同于第一次干燥过程。

(4)试样吸水率、溶解率计算：

其中：m₁为起始重量；m₂为吸水后重量；m₃为脱水后最终重量。

2.7杜仲胶复合义齿软衬材料的细胞毒性测试

2.7.1实验分组

实验分杜仲胶复合材料A组(杜仲胶/顺丁胶＝10∶90)、B组(杜仲胶/顺丁胶＝30∶70)、C组(杜仲胶/顺丁胶＝50∶50)、D组(杜仲胶/顺丁胶＝70∶30)、E组(杜仲胶/顺丁胶＝90∶10)、Silagum硅橡胶软衬材料组、丙烯酸自凝软衬材料组、阳性对照组(重度毒性反应组)、阴性对照组(正常细胞培养组)、空白对照组(无细胞组，调零用)，每组5孔。

2.7.2实验步骤

(1)试样制备：所有试样最终裁成直径为10±0.1mm，厚度为2.0±0.1mm的圆片，边缘光滑、无锐角，每种软衬材料5个试样。所有试样在蒸馏水中超声清洗10min，然后在3个大气压、120℃条件下消毒30min，室温下干燥2h备用。

(2)浸提液制备：将每个试样分别放于盛有5ml含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，放置在37℃、5％CO₂、湿度95％下的培养箱内，24h后收集析出液。

(3)小鼠成纤维细胞L929的培养：L929经复苏后，置于37℃、5％CO₂培养箱，以含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养，传代两次，当细胞长满瓶底的80％左右时，进行细胞计数。

(4)测定试样细胞毒性：用0.25％胰蛋白酶消化上述对数期生长的L929细胞，配置成密度为6.0×10⁴/ml的细胞悬液，将悬液加入96孔板，然后将培养板置于5％CO₂、37℃、湿度95％条件下的培养箱中培育24h。待细胞贴壁后分别在各实验组细胞孔内加入100μL50％的浸提液，在阴性对照组细胞孔加入100μL新鲜培养液，阳性对照组细胞孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL置于培养箱中，在37℃、5％CO₂、95％湿度下培养，分别在2天、4天、7天后，各取出一块培养板，在每孔中加入20μ 1MTT，继续孵育4h后终止培养。吸去旧液，然后每孔立即加入DMSO150μl，在振荡器上将培养板轻微振荡15min，并在室温下放置10min。最后放入酶标仪在490nm下检测每孔吸光度值。

2.7.3统计学方法

采用SPSS16.0统计学软件对5组杜仲胶复合义齿软衬材料、Silagum硅橡胶软衬材料组、丙烯酸自凝软衬材料组、阳性对照组、阴性对照组、空白对照组的吸光度A值进行处理。以阴性对照组吸光度A值为100％细胞增殖率，计算各组别的细胞相对增殖率(RGR)，并以此进行细胞毒性分级，评价。相关数据进行单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni检验，检验水准α＝0.05，P＜0.05说明差异有统计学意义。

2.7.4细胞毒性测试

(1)细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)的计算公式

RGR＝各组A₄₉₀均值/阴性对照组A₄₉₀值

(2)毒性反应分级：依据RGR将材料的毒性反应分级如下：

表2-3细胞毒性级别与细胞相对增殖率的对应关系

(3)结果评价：毒性反应为0或1级，合格；毒性反应达到2级，需结合细胞的形态进行综合评价；当毒性反应达到3～5级时，则表示反应为不合格。

3.结果

3.1杜仲胶的形态特征

采用石油醚-乙醇法从杜仲叶中提取出的杜仲胶纯度可达到92％，为灰白色或土黄色的松质小块或颗粒，稍有弹性，不溶于水。

3.2杜仲胶复合义齿软衬材料的特点

制备出的试片表面平整、光滑，质地柔软、细腻，富有弹性，由于杜仲胶未经脱色处理，所以试片呈现出浅黄色，并且随着杜仲胶混炼比例增加加深渐呈浅绿色。

3.3杜仲胶复合义齿软衬材料的力学性能

3.3.1力学性能测试

对制备出的试片进行邵氏硬度(A)、拉伸强度和断裂伸长率测试，结果如下表。

表3-1不同配比的橡胶基质对杜仲胶复合义齿软衬材料力学性能的影响

由表3-1可知，当EUG/BR的比例介于10：90和90：10之间时，杜仲胶复合义齿软衬材料硬度、拉伸强度和断裂伸长率随着杜仲胶所占比例的增加而逐渐升高。

3.4杜仲胶复合义齿软衬材料的吸水率、溶解率

以下为各组别义齿软衬材料在两种介质中不同时期的吸水率和溶解率的检测结果：

表3-2各组别义齿软衬材料在人工唾液中吸水率和溶解率比较(％，)

从表3-2可以看出，无论7天还是30天，各组别的杜仲胶义齿软衬材料在人工唾液中的吸水率、溶解率均与硅橡胶组接近，远低于丙烯酸酯组。

表3-3各组别义齿软衬材料在蒸馏水中吸水率和溶解率比较(％，)

从表3-3可以看出，无论7天还是30天，各组别的杜仲胶义齿软衬材料在蒸馏水中的吸水率、溶解率均与硅橡胶组接近，远低于丙烯酸酯组。

表3-4各组别杜仲胶复合义齿软衬材料在两种介质中吸水率比较(％，)

采用两独立样本t检验比较各组别杜仲胶复合义齿软衬材料在两种介质中的吸水率和溶解率，可以发现，第7天(或第30天)在人工唾液中的吸水率均小于在蒸馏水中的吸水率，且差异有统计学意义。

表3-5各组别杜仲胶复合义齿软衬材料在两种介质中溶解率比较(％，)

由表3-5的实验结果可知，比较各组别杜仲胶复合义齿软衬材料在两种介质中的溶解率，30∶70组、50∶50组7天(或30天)在唾液中的溶解率均低于在蒸馏水中的溶解率，且差别具有显著性；70∶30组、90∶10组30天在唾液中的溶解率低于在蒸馏水中的溶解率，且差别具有显著性。其余无差异显著性，整体差异不具有规律性。

表3-6各组别杜仲胶复合义齿软衬材料在唾液中不同时期吸水率和溶解率比较

由表3-6的实验结果可知，比较各组别杜仲胶复合义齿软衬材料在唾液中不同时期吸水率和溶解率，30天时的吸水率均大于7天时的吸水率，且差别具有显著性；而在溶解率方面，50∶50组和70∶30组7天和30天的差异不具有显著性。

表3-7各组别杜仲胶义齿软衬材料在蒸馏水中不同时期吸水率和溶解率比较

由表3-7的实验结果可知，比较各组别杜仲胶义齿软衬材料在蒸馏水中不同时期吸水率和溶解率，30天时的吸水率均大于7天时的吸水率，且差别具有显著性；而在溶解率方面，10∶90组和30∶70组7天和30天的差异不具有显著性。

3.5杜仲胶复合义齿软衬材料的细胞毒性测试结果

本实验采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验方法，通过细胞形态学与细胞代谢活性综合比较和评价杜仲胶复合义齿软衬材料对体外培养细胞L929的毒性作用。

3.5.1 L929细胞形态学观察

细胞传代后约24小时可完全贴壁，细胞生长呈梭型，可见胞核。培养两天后，细胞数目明显增多，可达对数期，细胞多为多角形，密集布满瓶底，呈铺路石样。

杜仲胶复合义齿软衬材料共5组，Silagum硅橡胶软衬材料组、丙烯酸自凝软衬材料组和阴性对照组随着时间推移，细胞数目逐步增加，细胞为长梭型或多角形，长势良好，各孔内无明显差别；复合培养两天，细胞覆盖率达到50％；复合培养4天，细胞数目明显增多，间隙减小，细胞突充分伸展；到第七天时，细胞已经覆盖整个底壁，细胞紧密相连似铺路石样。各实验组和阴性对照组浸提液中培养的L929细胞生长良好，形态和核相正常，没有发生显著性的改变，未表现出细胞毒性。阳性对照组细胞明显少于其他八组，细胞贴壁覆盖率低，随时间推移，细胞皱缩变圆，脱壁凋亡，坏死变性，90％以上为死细胞，表现为重度毒性。

3.5.2各组材料50％浸提液与L929细胞复合培养的细胞相对增殖率及毒性分级

各组别材料的50％浸提液吸光度值见表3-12：

分别比较2日、4日、7日各组别材料50％浸提液内细胞相对增值率(RGR)，结果显示：

①5个组别的杜仲胶复合义齿软衬材料在2日、4日、7日的毒性级别基本都维持在1级，仅有70∶30组在7日时达到2级，显示出较轻的细胞毒性。

②Silagum硅橡胶软衬材料在各时期的细胞毒性均维持在0级或一级，尤其在2日和4日，细胞相对增值率均超过100％，表明无细胞毒性。

表3-10不同组别第2天细胞相对增殖率两两比较

表3-11不同组别第4天细胞相对增殖率两两比较

表3-12不同组别第7天细胞相对增殖率两两比较

表3-10到表3-12为组间两两比较，发现Silagum硅橡胶软衬材料和各组别的杜仲胶复合义齿软衬材料在2日、4日、7日的细胞相对增值率均高于同等条件下的国产丙烯酸酯自凝软衬材料，且差别具有显著性(P＜0.05)。

3.6总结论

1.本发明的杜仲胶复合义齿软衬材料采用杜仲胶与顺丁橡胶共混，适量添加氧化锌、氧化镁、硬脂酸、升华硫、促进剂CZ、防老剂，可制备出力学性能适宜的高弹性杜仲胶复合义齿软衬材料。

2.杜仲胶复合义齿软衬材料的吸水性与Silagum硅橡胶软衬材料接近，显著低于丙烯酸酯软衬材料，且溶解性也维持在比较低的水平。

3.杜仲胶复合义齿软衬材料对体外培养的小鼠成纤维细胞L929没有毒性，初步认为其生物相容性良好。

实施例2抑菌性测试

1.英文缩写

2.1实验材料

2.1.1标准菌株

白色念珠菌CMCC(F)98001，由中国微生物菌种保藏管理中心提供。

2.1.2主要实验设备及仪器

各粒径水砂纸、玻璃试管、灭菌镊子、250ml锥形瓶、接种环、酒精灯

2.1.3主要实验材料

2.1.3.1杜仲胶复合材料

将杜仲胶和顺丁橡胶按照下表(表4-1)配方在双辊开炼机上于65℃左右薄通数次软化，然后按照顺序依次加入升华硫、氧化锌、氧化镁、硬脂酸、含硫促进剂CZ、防老剂，

混炼一段时间，待混炼均匀后再薄通数次，均匀出片。室温放置24小时后，在平板硫化

机上于150℃下热压成型，室温冷压定型后出片备用。

表4-1实验组材料配方(质量比)

2.1.3.2对照组实验材料

选用自凝丙烯酸树脂类软衬材料(上海齿科厂)和自凝硅橡胶软衬材料(DMG公司)作为本实验的对照组材料。

2.1.4实验试剂及溶液配制

2.1.4.1薄膜密着法主要实验试剂：

2.1.4.1.1营养肉汤NB：营养肉汤的配制方法见下表(表4-2)：

表4-2营养肉汤的配制方法

2.1.4.1.2营养琼脂培养基NA：营养肉汤(NB)1000mL中加入15g琼脂，加热熔化。用0.1mol/L氢氧化钠调pH为7.0-7.2，高压灭菌；24小时内使用。

2.1.4.1.3洗脱液：含质量分数0.8％氯化钠的生理盐水500mL，同时加入少量无菌表面活性剂吐温80，用0.1mol/L氢氧化钠调pH为7.0-7.2，高压灭菌；4℃冰箱保存备用。

2.2实验方法

2.2.1真菌培养及转接(表4-3)：

表4-3真菌培养与转接方法

2.2.2薄膜密着法

2.2.2.1薄膜密着法主要实验材料：

(1)覆盖膜：聚乙烯薄膜，3cm×3cm大小，75％乙醇浸泡，1min后用无菌水冲洗干净，自然干燥；

(2)阴性对照组：直径90mm的灭菌平皿内平板；

(3)对照组：4cm×4cm正方形的自凝硅橡胶软衬材料S0和自凝丙烯酸树脂软衬材料S′；

(4)实验组：4cm×4cm正方形的实验组材料S1-S5；

实验组和对照组每组制备9个试样，依次用粒径500目、800目、1000目的水砂纸打磨抛光。然后用75％乙醇擦拭试样表面，lmin后无菌水冲洗，自然干燥。

2.2.2.2薄膜密着法实验具体步骤：

(1)制备菌悬液：用灭菌接种环从培养基上刮取1环菌落，加入少量培养液中，用巴氏德吸管吹打，充分混匀；

(2)选定菌悬液浓度：依次做10倍递增稀释液，用血球计数板计数，选定最终浓度为(5～10)×10⁵cfu/mL；

(3)滴加菌悬液：将各样品平铺在灭菌玻璃平板中，分别取菌悬液200μL滴加各样品上，每个样品制作3个平行，室温下静置5min；

(4)覆盖薄膜：用灭菌镊子夹起覆盖膜分别覆盖在各样品上，保证铺平，使菌液均匀接触样品；

(5)培养：100％湿度、28℃培养箱，培养24h；

(6)冲洗：取出样品后，分别加入洗脱液20mL，反复冲洗样品及薄膜，充分摇匀；

(7)10倍递增稀释：取10μL充分摇匀后的菌悬液，加入90μL洗脱液进行10倍系列稀释，并充分摇匀，每100μL样液平行接种2个平板培养基，以获得适宜计数的菌落形成单位(CFU)；

(8)制备平板：取出各试样菌悬液100μL加入灭菌平板，后加入约45℃的NA，轻轻摇匀，使菌分散；

(9)培养计数：100％湿度、28℃培养箱，培养48h；48h后取出培养基，进行菌落计数；

(10)以上实验步骤重复3次。

2.2.2.3计算抗菌率

抗菌率计算公式为：

式中：

R-抗菌率(％)

A-阴性对照样品(空白平板)平均回收菌落数(CFU/mL)

B-实验组样品(S0-S5、S′)平均回收菌落数(CFU/mL)

抗菌效果评定：

根据GB/T 2591-2003《抗菌塑料-抗菌性能试验方法和抗菌效果》的规定，抗菌率≥90％，表示材料有抗菌作用；抗菌率≥99％，表示材料有强抗菌作用。

2.2.2.4统计学分析方法

本实验使用SPSS 17.0软件，采用单因素方差分析(ANOVA检验)对实验结果进行统计分析。

3.实验结果

3.1薄膜密着法实验结果

各实验组和对照组的平板计数主要结果显示，S1、S2组与对照组(S0、S′)无明显差异，S3组菌落数少于S1、S2组，S4组菌落数少于S3组，明显少于S1、S2组，S5组菌落数较少，与前几组有显著性差异。

表5-1是用平板计数法得到的各实验组材料(S1-S5)、对照组(S′、S0)及阴性对照组与白色念珠菌接触培养24h后，表面残存菌浓度。见图1和图2。

表5-1各组残存白色念珠菌浓度(×10³CFU/mL)

表5-2是各实验组材料(S’-S5)对白色念珠菌的抗菌率。

表5-2各组对白色念珠菌抗菌率(R％)

以α＝0.01为检验水准，对各实验组与S’组、S0组间进行纵向比较，除S1组材料与S’组、S0组材料的抗菌率无统计学差异(P＞0.01)外，其他实验组的抗菌率与S’组、S0组之间均有显著差异(P＜0.01)，且S’组与S0组之间无统计学差异(P＞0.01)。以α＝0.01为检验水准，对各实验组间进行横向比较，除S1与S2组间材料的抗菌率无统计学差异(P＞0.01)外，其他各实验组的抗菌率之间均有显著差异(P＜0.01)。即抗菌率随杜仲胶含量的增加有明显提高。据国家标准GB/T 2591-2003《抗菌塑料-抗菌性能试验方法和抗菌效果》的规定，材料抗菌率≥90％，表示有抗菌作用；材料抗菌率≥99％，表示有强抗菌作用。即实验组S1-S4组均未表现出抗菌作用；仅S5组对白色念珠菌有一定的抗菌作用。

表5-3单因素方差分析的多重比较(ANOVA检验)

*五组间方差分析：F＝1789.121，P＝0.000；S1与S′组、S0组之间；S′、S0之间；S1、S2之间的差异无统计学意义(P＞0.01)。S′与S2、S3、S4、S5之间；S0与S2、S3、S4、S5之间；S1与S3、S4、S5之间；S2与S3、S4、S5之间、S3与S4、S5之间、S4与S5之间差异有统计学意义(P＜0.01)。

Claims (5)

1.一种抑菌性义齿软衬材料，其特征是，按照重量份计算，配方为：

橡胶基质 100份；

硫化活性剂 1-3份；

氧化镁 1-3份；

硬脂酸 3-6份；

升华硫 1-3份；

含硫促进剂 1-3份；

防老剂 0.5-1.5份；

其中，所述橡胶基质由杜仲胶和顺丁橡胶组成，杜仲胶和顺丁橡胶的质量比例为：90:10；

杜仲胶复合义齿软衬材料的制备方法如下：按照所述重量份配比，将杜仲胶、顺丁橡胶、硫化活性剂、氧化镁、硬脂酸、含硫促进剂按顺序依次加入，于70℃-80℃下混匀，然后降温，待却至常温后，加入升华硫混匀；然后放置22-26 小时之后，于140℃-160℃下硫化20-40 分钟成型，硫化压力为9.5MPa-10.5MPa，待材料固化后脱模。

2.根据权利要求1 所述抑菌性义齿软衬材料，其特征是，按照重量份计算，配方为：

橡胶基质 100份；

硫化活性剂 2份；

氧化镁 2份；

硬脂酸 5份；

升华硫 2.5份；

含硫促进剂 2.5份；

防老剂 1份。

3.根据权利要求1 所述抑菌性义齿软衬材料，其特征是，所述硫化活性剂为氧化锌。

4.根据权利要求1 所述抑菌性义齿软衬材料，其特征是，所述含硫促进剂为N-环己基-2-苯并噻唑次磺酰胺。

5.根据权利要求1-4 之一所述抑菌性义齿软衬材料作为治疗义齿口炎材料的应用。