CN104530236B - 一种全人源her2抗体、其编码基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物化学领域，具体涉及两种全人源HER2抗体、其编码基因及应用。本发明提供了两种全人源HER2抗体，其中一种HER2抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，另一种HER2抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。全人源HER2抗体可降低输液反应和免疫原性，提高药物安全性，具有更好的药物动力学特征。此外，本发明的全人源抗体可以与其他HER2阳性肿瘤治疗剂联合用于治疗HER2阳性肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种全人源HER2抗体、其编码基因及应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤。HER家族调节正常乳腺的生长和发育，HER2的过度表达与乳腺癌有关。曲妥珠单抗(Trastuzumab)，商品名赫赛汀(赫赛汀)，是第一个用于治疗人表皮生长因子受体2(HER2)阳性转移性乳腺癌的人源化的单克隆抗体药物。虽然在HER2阳性的恶性肿瘤中，赫赛汀已成为标准的治疗方案，但仍然有40％的患者对赫赛汀没有响应。此外，在抗HER2的治疗方法中，耐药性已成为一个常见的严重问题。生长因子的冗余和细胞内信号转导通路之间的串扰被认为是在乳腺癌患者中促进耐药性的主要原因。帕妥珠单抗(Pertuzumab)是美国Genentech公司与罗氏公司联合开发近来研制出的一种新的抗HER2人源化抗体，与赫赛汀不同，它所针对的抗原表位位于HER2受体的细胞外II区，但临床实验研究结果表明单独使用帕妥珠仅产生较弱的抗肿瘤治疗作用。虽然治疗HER2阳性的转移性乳腺癌，尽管有多种方案可供选择，但是仍然没有满足需求。治疗这种疾病的优化方案持续出现，但大多数转移性乳腺癌患者出现了复发的情况。
发明内容
本发明提供了一种全人源的HER2抗体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明还提供了一种全人源的HER2抗体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:10，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
本发明的全人源HER2抗体，其是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv的形式。所述Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv具有本领域所惯常理解的含义。
本发明的上述两种全人源HER2抗体，还可以包括人IgG的重链恒定区和轻链恒定区。在一个具体的实施方案中，所述人IgG为IgG1。在一个具体的实施方案中，所述人IgG重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述人IgG轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
本发明提供了编码本发明全人源HER2抗体的核苷酸序列。
在一个具体的实施方案中，编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2的轻链可变区的核苷酸序列为SEQID NO:4。
在一个具体的实施方案中，编码氨基酸序列为SEQ ID NO:10的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:12，编码氨基酸序列为SEQ ID NO:11的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:13。
在一个具体的实施方案中，当本发明的两种全人源HER2抗体为全长抗体时，在本发明的核苷酸序列中，编码重链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，编码轻链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
本发明提供了一种表达载体，其中本发明的核苷酸序列与表达载体的表达控制序列可操作地连接。在具体的实施方案中，所述表达载体是pGEM-T载体或293载体。
本发明提供了一种细胞，其包含本发明的表达载体。所述细胞可以是原核或真核的。在具体的实施方案中，所述细胞可以哺乳动物细胞，例如FreeStyle 293F细胞。
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的全人源HER2抗体和可药用载体。
本发明提供了一种联合药物，其包含本发明的全人源HER2抗体和其他HER2阳性肿瘤治疗剂，所述HER2阳性肿瘤治疗剂为赫赛汀和/或帕妥珠。其中，所述联合药物可以以如下的量施用于受试者：0.001-500mg/kg全人源HER2抗体+0.001-500mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.001-300mg/kg全人源HER2抗体+0.001-300mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.001-200mg/kg全人源HER2抗体+0.001-200mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.01-200mg/kg全人源HER2抗体+0.01-200mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.01-100mg/kg全人源HER2抗体+0.01-100mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.1-90mg/kg全人源HER2抗体+0.1-90mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.1-70mg/kg全人源HER2抗体+0.1-70mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.1-60mg/kg全人源HER2抗体+0.1-60mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.1-50mg/kg全人源HER2抗体+0.1-50mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；0.1-40mg/kg全人源HER2抗体+0.1-40mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠；1-40mg/kg全人源HER2抗体+1-40mg/kg赫赛汀和/或帕妥珠。本发明的全人源HER2抗体与所述其他HER2阳性肿瘤治疗剂可以分开或同时给予受试者。给药途径可以为本领域常用的抗体给药途径。
本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的全人源HER2抗体。所述试剂盒可用于检测样品中的HER2蛋白。所述试剂盒还可包含本领域检测HER2试剂盒中的其他常用组分。
本发明提供了本发明的全人源HER2抗体用于制备用于治疗受试者中的HER2阳性肿瘤的药物的用途。
所述“HER2阳性肿瘤”是指如果IHC〔免疫组化法〕检查结果为3个加号(+++)，即，大于30％的肿瘤细胞的胞膜呈现完整的强着色，就表明为HER2阳性；如果是2个加号(++)，即，至少10％的肿瘤细胞呈现弱至中度完整的胞膜染色，那么进一步做FISH〔荧光原位杂交法〕或CISH〔显色原位杂交法〕检查，倘若结果为阳性〔发生基因扩增〕，就可以确诊为HER2阳性。优选地，HER2阳性肿瘤检测结果是使用我国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒(IHC,FISH和CISH检测试剂盒)获得的结果。执业医师熟知如何判定肿瘤是否为HER2阳性肿瘤。
所述HER2阳性的肿瘤可以选自HER2阳性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、结肠癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆囊癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)癌、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞瘤和垂体腺瘤。
优选地，所述受试者是人。
附图说明
图1A显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019和GB235-042重链表达载体(293-VH-CH)的结构示意图；图1B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019和GB235-042轻链表达载体(293-VL-CL)的结构示意图。以PCR方法，利用相应模板和引物(详见实施例5)分别获得含5’端EcoRI酶切位点的信号肽、重链可变区(VH)、含TGA终止密码子和3’端BamH I酶切位点的重链恒定区(CH)基因片段，并以over-lapping PCR方法将三段联接，获得GB235-019和GB235-042抗体的重链全长基因片段。以相同方法获得GB235-019和GB235-042抗体含信号肽、轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)的轻链全长基因片段。利用EcoR I和BamH I酶切形成的粘性末端分别将重链和轻链全长基因片段克隆至pGEM-T载体。
图2A和图2B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019和GB235-042的SDS-PAGE电泳结果图。将纯化得到的GB235-019和GB235-042抗体和赫赛汀对照样品在50mM二硫苏糖醇还原条件下经10％聚丙烯酰氨凝胶电泳解析，结果显示GB235-019和GB235-042抗体和赫赛汀均呈现分子量为50KDa和25KDa的两条带，分别为抗体的重链和轻链。
图3A显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019，GB235-042与人HER2抗原的结合结果图。以人HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-019，GB235-042抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合，并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一样，GB235-019，GB235-042抗体可结合于人HER2，并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
图3B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019，GB235-042与猴HER2抗原的结合结果图。以猴HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-019，GB235-042抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合，并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一样，GB235-019，GB235-042抗体可结合于猴HER2，并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
图3C显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019，GB235-042与小鼠HER2抗原的结合结果图。以小鼠HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-019，GB235-042抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合，并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示，GB235-019，GB235-042抗体可结合于小鼠HER2，并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
图3D显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019，GB235-042与人HER1、HER2、HER3、HER4抗原的结合结果图。以人HER1、HER2、HER3、HER4抗原包被ELISA板，以固定浓度的GB235-019，GB235-042抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合，并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示，GB235-019，GB235-042抗体能结合人HER2，GB235-019，GB235-042抗体不能结合人HER1、HER3、HER4抗原。
图4显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019与GB235-042与赫赛汀表位竞争的结果图。用ELISA方法，以重组人HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-019与GB235-042抗体和赫赛汀分别与生物素标记的赫赛汀(0.005μg/mL固定浓度)共同室温孵育2小时后和重组人HER2抗原包被的板结合，并用HRP标记的抗生物素抗体检测结合的抗体。结果显示，随赫赛汀浓度增加，生物素标记的赫赛汀在HER2上的结合受到抑制；而GB235-019与GB235-042抗体即使是在实验涉及的最高浓度(10μg/mL)时，仍对生物素标记的赫赛汀在HER2上的结合无抑制作用。
图5显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019与帕妥珠表位竞争的结果图。用ELISA方法，以重组人HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-019抗体和帕妥珠分别与生物素标记的GB235-019抗体(0.1μg/ml固定浓度)共同室温孵育2小时后和重组人HER2抗原包被的板结合，并用HRP标记的抗生物素抗体检测结合的抗体。结果显示，随GB235-019抗体浓度增加，生物素标记的GB235-019抗体在人HER2上的结合受到抑制；而帕妥珠即使是在实验涉及的最高浓度(30μg/mL)时，仍对生物素标记的GB235-019抗体在人HER2上的结合无抑制作用。
图6显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体与BT-474细胞的结合曲线结果图。将HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞在96-孔U型板中分别与不同浓度的GB235-019抗体、赫赛汀和帕妥珠孵育，在充分洗涤后，加入FITC标记的羊抗人Fc抗体检测，以流式细胞仪检测结合的抗体。结果显示，GB235-019抗体和赫赛汀、帕妥珠一样可结合于表达HER2的细胞表面，且呈现出浓度依赖性和可饱和性，提示GB235-019抗体对HER2有高度选择性。
图7A显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制SK-BR-3细胞增殖活性的实验结果。将HER2高表达的SK-BR-3乳腺癌细胞在完全培养基中分别与不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，赫赛汀在完全培养基中能抑制SK-BR-3细胞增殖，并呈现出浓度依赖性。GB235-019抗体在完全培养基中不能抑制SK-BR-3细胞增殖。
图7B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外逆转Heregulinα诱导SK-BR-3细胞对赫赛汀耐药作用的实验结果。将HER2高表达的SK-BR-3乳腺癌细胞在完全培养基中添加Heregulinα，产生对赫赛汀的耐药作用。不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀单独给药，或GB235-019抗体和赫赛汀联合给药，孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，完全培养基中添加Heregulinα，Heregulinα诱导了SK-BR-3的增殖。SK-BR-3对赫赛汀单独给药变得不敏感，GB235-019抗体单独给药没有抑制作用，而GB235-019抗体和赫赛汀联合给药抑制了Heregulinα的诱导增殖作用，并呈现出浓度依赖性。
图8显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体对乳腺癌SK-BR-3细胞信号转导的抑制作用。HER2高表达乳腺癌细胞SK-BR-3在0.1％胎牛血清培养基饥饿培养24小时后，加入GB235-019抗体 20μg/ml,赫赛汀 20μg/ml单独给药，以及GB235-019抗体和赫赛汀的联合给药，抗体处理SK-BR-3细胞6小时后，添加终浓度为100ng/ml的Heregulinα诱导15分钟后取样。以细胞裂解液做免疫印迹，以相应抗体分别探测全部和磷酸化的HER3、Akt和ERK。图8的结果显示，相比较不加Heregulinα的对照组，Heregulinα引起SK-BR-3细胞HER3磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀各自单独用药轻微抑制了Heregulinα对SK-BR-3细胞中HER3磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药，完全逆转了Heregulinα对HER3磷酸化的上调作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，没有抑制Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药明显抑制了Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，也明显抑制了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用，而GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全逆转了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用。
图9A显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制BT-474细胞增殖活性的实验结果。将P-HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞在完全培养基中分别与不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀单独给药以及联合给药孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，赫赛汀在完全培养基中能抑制BT-474细胞增殖，并呈现出浓度依赖性。GB235-019抗体在完全培养基中不能抑制BT-474细胞增殖。GB235-019抗体与赫赛汀联合用药，没有增加赫赛汀的抑制作用。
图9B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外逆转Heregulinα诱导BT-474细胞对赫赛汀耐药作用的实验结果。将P-HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞在完全培养基中添加Heregulinα，不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀单独给药，或GB235-019抗体和赫赛汀联合给药，孵育6天后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，完全培养基中添加Heregulinα，Heregulinα诱导了BT-474细胞的增殖。BT-474细胞对赫赛汀单独给药变得耐药，GB235-019抗体单独给药也没有抑制作用。而GB235-019抗体和赫赛汀联合给药抑制了Heregulinα诱导的增殖作用，并明显抑制到低于Heregulinα诱导前的水平，并呈现出浓度依赖性。
图10显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体对乳腺癌BT-474细胞信号转导的抑制作用。P-HER2高表达乳腺癌细胞BT-474在0.1％胎牛血清培养基饥饿培养24小时后，加入GB235-019抗体 20μg/ml,赫赛汀20μg/ml单独给药，以及GB235-019抗体和赫赛汀的联合给药，抗体处理BT-474细胞6小时后，添加终浓度为100ng/ml的Heregulinα诱导10分钟后取样。以细胞裂解液做免疫印迹，以相应抗体分别探测全部和磷酸化的HER3、Akt和ERK。图10的结果显示，相比较不加Heregulinα的对照组，Heregulinα引起BT-474细胞HER3磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀各自单独用药明显抑制了Heregulinα对BT-474细胞中HER3磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药，完全逆转了Heregulinα对HER3磷酸化的上调作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，没有抑制Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀联合用药微弱的抑制了Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀单独用药微弱的抑制了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用，而GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全逆转了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用。
图11显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制MDA-MB-175Ⅶ细胞增殖活性的实验结果。将表达中等水平的HER2和中等水平的HER3的MDA-MB-175Ⅶ乳腺癌细胞在完全培养基中分别与不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀单独给药以及联合给药孵育6天后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，GB235-019抗体与赫赛汀单独给药在完全培养基中能微弱的抑制MDA-MB-175Ⅶ细胞增殖。GB235-019抗体与赫赛汀联合用药，可以完全抑制MDA-MB-175Ⅶ细胞增殖，并呈现出浓度依赖性。
图12A显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制MCF 7细胞增殖活性的实验结果。将表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3的MCF 7乳腺癌细胞在完全培养基中分别与不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀单独给药以及联合给药孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，赫赛汀与GB235-019抗体单独给药在完全培养基中都不能抑制MCF 7细胞增殖，赫赛汀与GB235-019抗体联合给药在完全培养基中，也不能抑制MCF 7细胞增殖。
图12B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外对完全培养基中Heregulinα诱导MCF 7细胞增殖活性的实验结果。将表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3的MCF 7乳腺癌细胞在完全培养基中添加Heregulinα，不同浓度的GB235-019抗体和赫赛汀单独给药，或GB235-019抗体和赫赛汀联合给药，孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，完全培养基中添加Heregulinα，Heregulinα微弱的诱导了MCF 7细胞的增殖。赫赛汀单独给药抑制了Heregulinα对MCF 7细胞的诱导增殖作用部分，但作用有限，GB235-019抗体单独给药没有抑制作用。而GB235-019抗体和赫赛汀联合给药没有增加赫赛汀的抑制作用。
图13A和图13B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外对低胎牛血清培养基中Heregulinα诱导MCF 7细胞增殖活性的实验结果。将表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3的MCF 7乳腺癌细胞在低胎牛血清培养基中添加Heregulinα，不同浓度的GB235-019抗体单独给药，或不同浓度的GB235-019抗体和固定浓度赫赛汀联合给药，孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示，低胎牛血清培养基中添加Heregulinα，Heregulinα显著诱导了MCF 7细胞的增殖。GB235-019抗体单独给药抑制了Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖，并呈现出浓度依赖性。GB235-019抗体与10ng/ml赫赛汀联合给药，协同抑制了Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖。GB235-019抗体与100ng/ml赫赛汀联合给药，协同抑制了Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖，并增加了最大抑制作用。
图14显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体对乳腺癌MCF 7细胞信号转导的抑制作用。表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3的MCF 7乳腺癌细胞在0.1％胎牛血清培养基饥饿培养24小时后，加入GB235-019抗体 20μg/ml,赫赛汀20μg/ml单独给药，以及GB235-019抗体和赫赛汀的联合给药，抗体处理MCF 7细胞6小时后，添加终浓度为100ng/ml的Heregulinα诱导10分钟后取样。以细胞裂解液做免疫印迹，以相应抗体分别探测全部和磷酸化的HER3、Akt和ERK。图14的结果显示，相比较不加Heregulinα的对照组，Heregulinα引起MCF 7细胞HER3磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀各自单独用药明显抑制了Heregulinα对MCF 7细胞中HER3磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药，完全逆转了Heregulinα对HER3磷酸化的上调作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，明显抑制Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药完全逆转了Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀单独用药明显抑制了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用，而GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全逆转了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用。
图15重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体对乳腺癌KPL-4细胞小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。人乳腺癌(KPL-4)细胞表达高水平的P-HER2。KPL-4细胞按5×106细胞/只小鼠分别接种至38只SCID Beige小鼠身体右侧倒数第二对乳垫下。当肿瘤体积达到100-200mm3时，依照肿瘤体积大小和体重选取24只小鼠随机分为4组，每组6只动物。赫赛汀组(30mg/kg赫赛汀)，GB235-019抗体组(30mg/kg GB235-019抗体)，联合用药组(30mg/kg赫赛汀+30mg/kg GB235-019抗体)及空白对照组(PBS)，所有药物给药途径为腹腔注射，一周一次，共给药四周。每周两次测量肿瘤体积并进行称量小鼠体重。如图15的结果显示赫赛汀单独用药可部分抑制KPL-4肿瘤的生长；GB235-019抗体单独用药不能抑制KPL-4肿瘤的生长；GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全抑制了KPL-4肿瘤的生长，并可使已经生成的肿瘤明显缩小，体现显著地协同抑制KPL-4肿瘤生长作用。
具体实施方式
下面以具体的实施例，对本发明的技术方案做进一步的说明；但本发明并不限于这些实施例。
实施例1从全人源scFv噬菌体文库中筛选和人HER2-Fc特异性结合的克隆
利用ELISA技术的抗原抗体结合专一性，将人HER2(胞外域)-Fc融合蛋白(简称为hHER2-Fc)抗原包被到酶标板，通过洗涤和淘选特异性地粘附于包被抗原上的噬菌体。人HER2-Fc(购自Sino Biological公司，货号：10004-H02H)抗原用PBS(0.01M Na2HPO4·12H2O+0.002M KH2PO4+0.14M NaCl+0.002M KCl，pH＝8.6)稀释至5μg/ml，按照100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST(含0.05％吐温20的PBS缓冲液)洗板4次后加入5％BSA(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)300μl/孔，37℃封闭1小时。再用PBST洗板2次。将含有7×1010独立克隆的全人源scFv噬菌体抗体文库(此抗体库由优瑞科(北京)生物技术有限公司以多个健康人淋巴细胞的抗体可变区基因与人工合成的重链CDR3基因组合构建而成)的悬液按照100μl/孔加入酶标板中，在37℃条件下孵育2小时。孵育结束后，吸出酶标板孔中的噬菌体悬液，然后在每孔中加入PBST 300μl/孔，充分吹打一遍，每遍5分钟，以去除与包被抗原的非特异性结合的噬菌体。加入含0.1％BSA(购自Amresco,货号:0332-100g,溶液为PBS)的0.2M甘氨酸-盐酸(pH＝2.2)洗脱液，室温孵育10分钟后，充分地吹打，洗脱特异性地粘附于包被抗原上的噬菌体。将洗脱下的噬菌体悬液用1M Tris-HCl(pH9.1)缓冲液中和。将洗脱的噬菌体感染加入1ml对数期的TG1(OD600约0.3～04.)(Lucigen,货号:60500-0，美国)进行感染，37℃，静置1小时。将感染后菌液取10μl进行10倍梯度稀释，进行10倍、100倍、1000倍稀释后涂平板计数。取90μl感染后菌液保存甘油菌，甘油终浓度为10％，放-80℃保存。剩余侵染后菌液全部涂于150mm 2×YT-A固体平板(17g/L胰化蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄青霉素)，37℃过夜培养。加入5ml 2×YT-A-10％甘油培养基到150mm平板菌上过夜培养，并用无菌涂布棒轻轻刮下，到平板上无残留菌液即可。第二轮扩增,取适量刮取得菌液到5ml2×YT-AMP-glucose液体培养基(17g/L胰化蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)中(OD600约0.05～0.1即可)，37℃、200rpm培养到对数期(OD600约0.3～0.4)，加入20倍菌体总数的M13K07辅助噬菌体(NEB公司，货号:N0315S，美国)侵染，37℃，1小时。侵染完后1500g、5分钟收集菌体重悬于2×YT-AMP-Kana培养基中(17g/L胰化蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨苄青霉素)，30℃、200rpm过夜培养，完成重组噬菌体的扩增制备。进行相同的第二轮淘选，第三轮扩增和淘选。挑取菌落到5ml(2×YT-AMP-glucose液体培养基(17g/L胰化蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)，37℃、200rpm过夜培养。质粒提取试剂盒(Qiagen公司，货号：12943，美国)抽提质粒，通过测序鉴定，质粒-80℃保存。
实施例2用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定特异性结合人HER2-Fc噬菌体的免疫反应性
用酶联免疫吸附法(ELISA)进一步鉴定实施例1中得到的特异性结合人HER2-Fc噬菌体的免疫反应性。人HER2-Fc抗原(购自Sino Biological公司，货号：10004-H02H)用PBS(pH＝8.6)稀释2μg/ml，按照100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5％BSA(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)300μl/孔，37℃封闭1小时。再用PBST洗板2次，加入100μl/孔噬菌体克隆悬液，在37℃条件下孵育2小时。PBST洗板4次。加入HRP标记的抗M13K07噬菌体抗体(GE，货号：27-9421-01，PBST 1:5000稀释，100μl/孔)，室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100μl/孔可溶型单组分3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液(Tiangen，货号：PA107-01)。室温孵育15分钟显色，加入50μl/孔终止液(1M硫酸)，在多功能酶标仪(Bio-Rad，Model 680Micro reader)上450/570nm波长下读出吸光值。
结果显示，经过三轮重复筛选，共获得1312个可与人HER2-Fc抗原结合的scFv噬菌体克隆,其中499个可与人HER2-Fc抗原特异性结合的scFv噬菌体克隆数。经DNA测序，这些克隆中有102种DNA/氨基酸序列都不相同的scFv(如表1所示)。
表1
实施例3用ELISA法检测102个人HER2-Fc特异性scFv的种属交叉反应和HER家族成员分子间的交叉反应
用ELISA法检测102个人HER2-Fc特异性scFv的种属交叉反应和与HER家族成员分子间的交叉反应。方法同实施例2，将包被的人HER2-Fc抗原分别换成猴HER2-Fc(购自SinoBiological公司，货号：90295-C02H)、小鼠HER2-Fc(购自Sino Biological公司，货号：50714-M02H)、人HER1-Fc(购自Sino Biological公司，货号：10001-H02H)、人HER3-Fc(购自Sino Biological公司，货号：10201-H05H)和人HER4-Fc(购自Sino Biological公司，货号：10363-H02H)。抗原用PBS(pH＝8.6)稀释2μg/ml，按照100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5％BSA(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)300μl/孔，37℃封闭1小时。再用PBST洗板2次，加入100μl/孔102个scFv噬菌体克隆悬液，在37℃条件下孵育2小时。PBST洗板4次。加入HRP标记的抗M13K07噬菌体抗体(购自GE，货号：27-9421-01，PBST 1:5000稀释，100μl/孔)，室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100μl/孔可溶型单组分3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液(购自Tiangen，购自：PA107-01)。室温孵育15分钟显色，加入50μl/孔终止液(1M硫酸)，在多功能酶标仪(Bio-Rad，Model 680Micro reader)上450/570nm波长下读出吸光值。
结果显示，有96个scFv噬菌体克隆与猴HER2-Fc抗原有交叉反应，其中有20个scFv噬菌体克隆与鼠HER2-Fc抗原有交叉反应。所有的102个克隆与人HER1-Fc、人HER3-Fc和人HER4-Fc抗原均无交叉反应(如表2所示)。
表2
实施例4 102个scFv噬菌体克隆的亲和力排序
102个scFv噬菌体克隆通过ELISA法亲和力排序,将人HER2-Fc抗原用PBS缓冲液从25μg/ml开始十倍比稀释共8个梯度，分别与102个scFv噬菌体克隆的噬菌体悬液在室温孵育4小时以达到平衡；将所得到的混合液加入到2μg/ml人HER2-Fc抗原(pH＝8.6PBS，4℃过夜，100μl/孔)事先包被的酶标板中，并以5％BSA(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)封闭好的酶标板，以结合未被捕获的scFv抗体。加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(购自GE，货号：27-9421-01，以PBST1:5000稀释，100μl/孔)，以与实施例2相同的方法检测。以IC50值对102个阳性克隆的亲和力进行排序(IC50值越低，亲和力越高)。
结果显示了102个scFv噬菌体克隆的IC50值分布范围，其中有4个克隆的亲和力高于赫赛汀。
表3
实施例5GB235-019和GB235-042重组全长IgG1型抗体的真核表达载体的构建
从102个scFv噬菌体克隆序列中，构建GB235-019和GB235-042重组全长IgG1型抗体的真核表达载体。经全人源scFv噬菌体文库筛选得到WG1-019(scFv噬菌体文库筛选中得到单链抗体序列克隆命名为WG1-019)单链抗体克隆的核苷酸序列为SEQ ID NO:9，其包含的重链可变区序列和轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1)和SEQ ID NO:4(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2)。
得到WG1-042((scFv噬菌体文库筛选中得到单链抗体序列克隆命名为WG1-042))单链抗体的克隆核苷酸序列为SEQ ID NO:14，其包含的重链可变区序列和轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:12(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:10)和SEQ ID NO:13(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:11)。信号肽氨基酸序列为：MELGLSWIFLLAILKGVQC；核苷酸序列为：ATGGAGTTGGGACTGTCTTGGATTTTCCTGTTGGCTATTCTGAAAGGTGTGCAGTGT(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。
GB235-019和GB235-042重组全长抗体的重链恒定区和轻链恒定区的核苷酸序列为别为SEQ ID NO:7(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:5)和SEQ ID NO:8(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:6)(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。
设计引物用于构建GB235-019和GB235-042重组全长IgG1型抗体重链和轻链的真核表达载体，引物序列如下：
1-1：5’-GAATTCGCGGCCGCATGGAGTTGGGACTG-3’
2-3：5’-CTGGGTCATCTGGATGTCACACTGCACACCTTTC-3’
3-3：5’-GAAAGGTGTGCAGTGTGACATCCAGATGACCCAG-3’
4-3：5’-GATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATATCCACTTTG-3’
4-4：5’-GATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATCTCCACCTTG-3’
5-2：5’-ATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATC-3’
6-1：5’-GTTTAAACGGATCCCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’
7-6：5’-GCACCAGCTGGACCTG ACACTGCACACCTTTC-3’
7-7：5’-GTACCAGCTGGACCTC ACACTGCACACCTTTC-3’
8-6：5’-GAAAGGTGTGCAGTGTCAGGTCCAGCTGGTGC-3’
8-7：5’-GAAAGGTGTGCAGTGTGAGGTCCAGCTGGTAC-3’
9-1：5’-GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTCAC-3’
10-1：5’-ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC-3’
11-1：5’-GTTTAAACGGATCCTCATTTACCGGGAGACAGGGAG-3’
以合成的信号肽序列为模板，1-1和2-3为引物，由PCR方法扩增获得含EcoR I酶切位点的基因片段，命名为“SPL-GB235-019”；以合成的轻链可变区序列SEQ ID NO:4为模板，3-3和4-4为引物，PCR法扩增获得轻链可变区基因片段，命名为“VL-GB235-019”；同时以合成的轻链恒定区序列SEQ ID NO:8为模板，5-2和6-1为引物，PCR法扩增获得含TGA终止密码子和BamH I酶切位点的重链恒定区基因片段，命名为“CL-GB235-019”。以SPL-GB235-019、VL-GB235-019、CL-GB235-019基因片段为模板，1-1和6-1为引物，通过over-lapping PCR方法(Higuchi R,et al.A general method of in vitro preparation and specificmutagenesis of DNA fragments:study of protein and DNA interactions.NucleicAcids Research,1988,16(15):7351-67.)扩增获得GB235-019抗体的轻链全长基因片段。以合成的信号肽序列为模板，1-1和2-3为引物，由PCR方法扩增获得含EcoR I酶切位点的基因片段，命名为“SPL-GB235-042”；以合成的轻链可变区序列SEQ ID NO:13为模板，3-3和4-3为引物，PCR法扩增获得轻链可变区基因片段，命名为“VL-GB235-042”；同时以合成的轻链恒定区序列SEQ ID NO:8为模板，5-2和6-1为引物，PCR法扩增获得含TGA终止密码子和BamHI酶切位点的轻链恒定区基因片段，命名为“CL-GB235-042”。以SPL-GB235-042、VL-GB235-042、CL-GB235-042基因片段为模板，1-1和6-1为引物，通过over-lapping PCR方法扩增获得GB235-042抗体的轻链全长基因片段。
同样的方法，以合成的信号肽序列为模板，1-1和7-7为引物，由PCR(聚合酶链反应)方法扩增获得含EcoR I酶切位点的基因片段，命名为“SPH-GB235-019”；以合成的重链可变区序列SEQ ID NO:3为模板，8-7和9-1为引物，PCR法扩增获得重链可变区基因片段，命名为“VH-GB235-019”；同时以合成的重链恒定区序列SEQ ID NO:7为模板，10-1和11-1为引物，PCR法扩增获得含TGA终止密码子和BamH I酶切位点的重链恒定区基因片段，命名为“CH-GB235-019”。以SPH-GB235-019、VH-GB235-019、CH-GB235-019基因片段为模板，1-1和11-1为引物，通过over-lapping PCR方法扩增获得GB235-019抗体的重链全长基因片段。以合成的信号肽序列为模板，1-1和7-6为引物，由PCR(聚合酶链反应)方法扩增获得含EcoR I酶切位点的基因片段，命名为“SPH-GB235-042”；以合成的重链可变区序列SEQ ID NO:12为模板，8-6和9-1为引物，PCR法扩增获得重链可变区基因片段，命名为“VH-GB235-042”；同时以合成的重链恒定区序列SEQ ID NO:7为模板，10-1和11-1为引物，PCR法扩增获得含TGA终止密码子和BamH I酶切位点的重链恒定区基因片段，命名为“CH-GB235-042”。以SPH-GB235-042、VH-GB235-042、CH-GB235-042基因片段为模板，1-1和11-1为引物，通过over-lapping PCR方法扩增获得GB235-042抗体的重链全长基因片段。
将以上重链和轻链全长基因片段克隆至pGEM-T载体(购自Promega公司，货号：A3600)，使所述基因片段5’端含有EcoR I酶切位点，3’端含有TGA终止密码子和BamH I酶切位点。经DNA测序后，将测序正确的克隆用EcoR I(购自NEB公司，货号：R0101S)和BamH I(购自NEB公司，货号：R0136S)双酶切消化(37℃，4小时)，回收目的基因片段。同时将293载体(购自Invitrogen公司，货号：K8300-01)用EcoR I和BamH I双酶切消化(37℃，4小时)，回收293-EcoRI/BamHI载体片段。
将上述酶切获得的抗体重链全长基因片段和轻链全长基因片段分别与293-EcoRI/BamHI载体片段用T4DNA连接酶(购自NEB公司，货号：M0202S)进行连接(16℃，16小时)，热休克法(42℃，90秒)转化大肠杆菌，铺板(Amp+LB培养基)，挑取克隆，EcoRI/BamHI双酶切消化(37℃，2小时)进行鉴定筛选，筛选得到含有构建成功的全长抗体重链真核表达载体或全长抗体轻链真核表达载体的克隆。
图1A为重组全长抗人HER2抗体重链(293-VH-CH)表达载体的结构示意图；图1B为重组全长抗人HER2抗体轻链(293-VL-CL)表达载体的结构示意图。
实施例6GB235-019和GB235-042重组全长IgG1型抗体的真核细胞瞬时转染表达及纯化
实施例5中所构建的GB235-019和GB235-042重组载体的表达，可采用共转染FreeStyle 293F细胞(购自Invitrogen，货号：R790-07，美国)的方法。转染前24小时，将FreeStyle 293F细胞按6×105个细胞/ml传代，于恒温摇床135转/分，37℃，8％CO2条件下培养，使得转染当天的细胞密度(血球板计数法)为1.2-1.5×106个细胞/ml。用FreeStyle293培养基(购自Invitrogen公司，货号：12338-018，美国)稀释细胞，至密度为1×106个细胞/ml。为确保最佳转染效果，细胞活力(台盼蓝染色法)应大于95％。
将转染用试剂FreeStyle Max Reagent(购自Invitrogen公司，货号：16447-500，美国)轻度颠倒混匀4次。将各315μg重链和轻链表达载体质粒分别加入转染用培养液OptiPRO SFM(购自Invitrogen公司，货号：12309-050，美国)中，并用OptiPRO SFM补充体积至10ml，混匀。另取一支离心管，用OptiPRO SFM稀释625μl FreeStyle Max Reagent至10ml，轻度颠倒混匀。将稀释的质粒与稀释的FreeStyle Max Reagent混匀，室温孵育15分钟。将所得的20ml混合液缓慢加入装有500ml FreeStyle 293F培养基(购自Invitrogen公司，货号：12338-018，美国)的摇瓶中。摇瓶于恒温摇床培养7天(135转/分，37℃，8％CO2)。冷冻离心机9000转/分离心20分钟，收集上清液进行下一步蛋白纯化。
上述含GB235-019抗体或GB235-042抗体的FreeStyle 293F细胞上清液，经离心后使用蛋白A(Protein A)柱(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)捕获IgG1型抗体，用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝3.3)洗脱，收集洗脱物(0.5ml)，加入100μl 1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液(pH＝11.0)中和至中性，经10K透析膜(购自上海捷瑞生物工程有限公司，货号：M1915)在磷酸盐缓冲液PBS(0.01M Na2HPO4·12H2O+0.002M KH2PO4+0.14M NaCl+0.002M KCl，pH＝7.2)中透析后，OD280nm测定蛋白含量。经0.22μm滤器(购自Millipore公司)过滤除菌后-80℃保存。将纯化得到的GB235-019和GB235-042抗体在终浓度为50mM的二硫苏糖醇还原条件下,经10％聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小。
图2A，图2B的结果显示，在完全还原的条件下，GB235-019抗体和GB235-042抗体各呈现分子量为50KDa和25KDa的两条带，其分别为抗体的重链和轻链条带(赫赛汀为阳性对照，购自Roche公司)。这些结果表明，我们所构建的GB235-019和GB235-042抗体结构正确，其分子量大小与理论值一致。
实施例7重组全长抗人HER2GB235-019和GB235-042抗体的免疫学活性鉴定
用ELISA结合实验验证GB235-019和GB235-042抗体与人HER2抗原的结合能力。方法如下：将人HER2抗原(购自Sino Biological公司，货号：10004-H08H)抗原用PBS缓冲液稀释至1μg/ml，按照100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5％BSA 300μl/孔(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)，室温封闭1小时。PBST洗板4次后，将GB235-019、GB235-042抗体和赫赛汀(购自Roche公司)分别从10μg/ml开始五倍比稀释共7个梯度，按照100μl/孔加入酶标板中，在室温条件下孵育1小时。PBST洗板4次，将HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(购自CalBiochem公司)用PBS缓冲液以1:10000稀释，按照100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100μl/孔显色液，室温孵育15分钟显色，加入50μl/孔终止液，在M5多功能酶标仪上450/630nm波长下读出吸光值。
用ELISA结合实验验证GB235-019和GB235-042抗体分别与猴HER2(购自SinoBiological公司，货号：90295-C08H)、小鼠HER2(购自Sino Biological公司，货号：50714-M08H)、人HER1(购自Sino Biological公司，货号：10001-H08H)、人HER3(购自SinoBiological公司，货号：10201-H08H-10)、人HER4(购自Sino Biological公司，货号：10201-H08H)抗原的交叉反应。方法如下：猴HER2、小鼠HER2、人HER1、人HER3或人HER4抗原用PBS稀释至1μg/ml，按照100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5％BSA 300μl/孔(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)，室温封闭1小时。PBST洗板4次后，将GB235-019和GB235-042抗体分别用PBS缓冲液从10μg/ml开始五倍比稀释共8个梯度，按照100μl/孔加入酶标板中，在室温条件下孵育1小时。PBST洗板4次，将HRP标记的羊抗人IgGFc抗体用PBS缓冲液以1:10000稀释，按照100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100μl/孔显色液，室温孵育15分钟显色，加入50μl/孔终止液，在M5多功能酶标仪上450/630nm波长下读出吸光值。
图3A，图3B的结果显示，GB235-019，GB235-042抗体具有与人HER2和猴HER2抗原特异性的结合能力，图3C的结果显示，GB235-019，GB235-042抗体具有与小鼠HER2特异性的结合能力；图3D的结果显示，GB235-019，GB235-042抗体与人HER1、人HER3、人HER4抗原均没有结合能力，表明GB235-019，GB235-042抗体与人HER2其它家族成员没有交叉反应。
实施例8竞争ELISA法鉴定重组全长抗人HER2抗体GB235-019与GB235-042分别与赫赛汀的表位竞争结果
将人HER2抗原(购自Sino Biological公司，货号：10004-H08H)用PBS缓冲液稀释至1μg/ml，按照100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5％BSA 300μl/孔(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)，室温封闭1小时。将GB235-019和GB235-042抗体分别从10μg/ml开始十倍比稀释共8个梯度，分别与0.005μg/ml生物素标记(由上海友科生物科技有限公司标记)的赫赛汀在室温孵育2小时，按照100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1小时；PBST洗板4次，将HRP标记的抗生物素抗体(购自Invitrogen公司)用PBS缓冲液以1:10000稀释，按照100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100μl/孔显色液，室温孵育15分钟显色，加入50μl/孔终止液，在M5多功能酶标仪上450/570nm波长下读出吸光值。
图4结果显示，GB235-019和GB235-042抗体都与赫赛汀不发生竞争，表明其结合表位在赫赛汀的结合表位之外。
实施例9竞争ELISA法鉴定重组全长抗人HER2抗体GB235-019与帕妥珠的表位竞争结果
将人HER2抗原(购自Sino Biological公司，货号：10004-H08H)用PBS缓冲液稀释至1μg/ml，按照50μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入2％BSA 200μl/孔(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)，室温封闭2小时。将帕妥珠(购自Roche公司)和未标记生物素的GB235-019抗体从30μg/ml开始十倍比稀释3个梯度和从10μg/ml开始十倍比稀释3个梯度，分别与0.1μg/ml生物素标记(购自Invitrogen公司，APEX Biotin试剂盒标记,货号：A10495)的GB235-019抗体在室温孵育2小时，按照100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1小时；PBST洗板4次，将HRP标记的Streptavidin抗体(购自Invitrogen公司)用1％BSA(购自Amresco,货号：0332-100g,溶液为PBS)以1:10000稀释，按照100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100μl/孔显色液，室温孵育15分钟显色，加入50μl/孔终止液，在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上450/630nm波长下读出吸光值。
图5结果显示，GB235-019抗体与帕妥珠不发生竞争，表明其结合表位在帕妥珠的结合表位之外。
实施例10重组全长抗人HER2抗体GB235-019的体外细胞结合活性测定
乳腺癌细胞BT-474(购自美国典型培养物保藏中心，登录号：HTB-20)中等水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2，但不表达P-HER3(RichardM.Neve.Acollectionof breast cancer cell lines for the study of functionallydistinct cancer subtypes.CANCER CELL，2006，515-527.)。BT-474细胞以2.0×105/100μl接种96孔U型板。同时将本发明的抗体GB235-019与赫赛汀(购自Roche公司)，帕妥珠(购自Roche公司)，分别从20μg/ml开始，用PBS含0.1％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)缓冲液进行三倍比稀释共7个梯度，分别为20,6.6,2.2,0.74,0.25,0.08,0.03μg/ml。
96孔U型板的细胞1000rpm，5min离心后弃上清，稀释后的GB235-019抗体，赫赛汀和帕妥珠按照100μl/孔分别加入BT-474细胞，在4℃孵育1小时。再次离心后弃上清，用200μl PBS-0.1％FBS缓冲液洗涤2次，加入FITC标记的羊抗人Fc抗体(购自Abcam公司，英国，货号：ab97224)，100μl/孔(用PBS含0.1％胎牛血清缓冲液1:10000稀释),并在4℃孵育45分钟。细胞离心后，用200μl/孔PBS含0.1％胎牛血清缓冲液洗涤2次，加入200μl PBS含0.1％胎牛血清缓冲液,并连同细胞转移到含有300μl PBS含0.1％胎牛血清缓冲液的流式管的样品管(Beckman)，重悬样品管中的细胞，流式细胞仪检测(FC500,Beckman)检测FITC荧光值。通过分析荧光值与抗体浓度的曲线表示相应抗体与BT-474细胞亲和力。
图6的结果显示，GB235-019抗体和赫赛汀、帕妥珠一样可结合于表达HER2的BT-474细胞表面，且呈现出浓度依赖性和可饱和性，表明GB235-019抗体对HER2有高度选择性。GB235-019抗体与BT-474细胞在结合率为50％时所对应的半结合浓度为0.77μg/ml，赫赛汀与BT-474细胞在结合率为50％时所对应的半结合浓度为0.48μg/ml，帕妥珠与BT-474细胞的在结合率为50％时所对应的半结合浓度(结合率为50％时所对应的浓度)为1.62μg/ml。本发明的GB235-019抗体与BT-474细胞的结合活性与赫赛汀类似，优于帕妥珠。
实施例11重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制SK-BR-3细胞增殖活性
乳腺癌SK-BR-3细胞表达高水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2和中等水平的P-HER3(Richard M.Neve.Acollectionof breast cancer cell linesfor the study of functionally distinct cancer subtypes.CANCER CELL,2006:515-527.)。将处于对数生长期的SK-BR-3细胞(购自美国典型培养物保藏中心，登录号：HTB-30)以5000个细胞每孔于RPMI1640(购自Invitrogen公司，货号：A10491)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)的完全培养基中培养到96孔培养板，37℃，5％CO2中培养24小时。GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药抑制试验。单独用药组分别加入GB235-019抗体和赫赛汀(工作终浓度为75,18.8,4.7,1.2,0.29,0.07,0.018,0.005,0.0011,0μg/ml)。37℃，5％CO2中继续培养72小时。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测SK-BR-3细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
完全培养基中添加Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)诱导增殖的抑制试验中，单独用药组分别加入GB235-019抗体和赫赛汀(工作终浓度为75,18.8,4.7,1.2,0.29,0.07,0.018,0.005,0.0011,0μg/ml)，同时联合用药组加入以上述每个剂量的GB235-019抗体和赫赛汀。在上述GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药处理2小时后，加入工作终浓度为100ng/ml的Heregulinα溶液，设置未加Heregulinα溶液的孔，37℃，5％CO2中继续培养72小时。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测SK-BR-3细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
图7A显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制SK-BR-3细胞增殖活性的实验结果。结果显示，赫赛汀在完全培养基中能抑制SK-BR-3细胞增殖，并呈现出浓度依赖性。GB235-019抗体在完全培养基中不能抑制SK-BR-3细胞增殖。
图7B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外逆转Heregulinα诱导SK-BR-3细胞对赫赛汀耐药作用的实验结果。结果显示，完全培养基中添加Heregulinα，Heregulinα诱导了SK-BR-3的增殖。SK-BR-3对赫赛汀单独给药变得不敏感，GB235-019抗体单独给药也没有抑制作用，而GB235-019抗体和赫赛汀联合给药抑制了Heregulinα的诱导增殖作用，并呈现出浓度依赖性。乳腺癌SK-BR-3细胞表达高水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2和中等水平的P-HER3。赫赛汀抑制SK-BR-3细胞P-HER2驱动的生长作用，但不能抑制Heregulinα诱导SK-BR-3细胞的生长作用。生长因子Heregulinα使SK-BR-3细胞产生了对赫赛汀的耐药性，GB235-019抗体和赫赛汀联合给药抑制了生长因子Heregulinα对SK-BR-3细胞的诱导生长作用。
实施例12重组全长抗人HER2GB235-019抗体对乳腺癌SK-BR-3细胞信号转导的抑制作用
将处于对数生长期的SK-BR-3细胞以1.8×105细胞每孔于RPMI1640(购自Invitrogen公司，货号：A10491)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)完全培养基中培养到6孔培养板，37℃，5％CO2中培养24小时。第二天，弃去培养基换成0.1％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)的低血清培养基培养24小时。随后添加GB235-019抗体20μg/ml,赫赛汀20μg/ml单独给药，以及GB235-019抗体和赫赛汀的联合给药，抗体处理SK-BR-3细胞6小时后，添加终浓度为100ng/ml的Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)诱导15分钟，设置未加Heregulinα的空白对照孔。4℃预冷的PBS洗涤一次后终止反应，添加120μl LDS(购自Invitrogen公司，货号：NP0007)，冰上放置并迅速收集细胞裂解液，-80℃保存备用。
收集的细胞裂解液在终浓度为50mM的二硫苏糖醇(购自Sangon公司，货号：D0281)还原条件下,经Western-blot分析检测抗体对Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)诱导SK-BR-3细胞中HER-3，Akt和ERK1/2磷酸化的影响。Western-blot方法如下：将电泳后的胶通过电转移(300mA，80分钟)的方法转移至NC膜上(购自Pall公司，货号：S80209)，5％脱脂奶粉(购自Sangon公司,货号：NB0669)封闭后分别加入以1:1000稀释的兔一抗P-HER3Y1289(购自Cell Signaling Technology公司,货号：8017)，1:1000稀释的兔一抗P-AktS473(购自Cell Signaling Technology公司,货号：4060),1:1000稀释的兔一抗Akt(购自Cell Signaling Technology公司,货号：4691)，1:500稀释的兔一抗P-ERK1/2(购自CellSignaling Technology公司,货号：4370),1:1000稀释的兔一抗ERK1/2(购自CellSignaling Technology公司,货号：4695),1:5000稀释的兔一抗GAPDH(Cell SignalingTechnology公司,货号：5174)，4℃孵育过夜。用1×TBST洗三遍，洗膜后再加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体(购自MERCK公司，货号：401315)，用1×TBST洗三遍，后再加入ECL(购自PerkinElmer公司，货号：NEL104001EA)显示，胶片曝光记录信号(购自Kodak公司，货号：FF057)。
图8的结果显示，相比较不加Heregulinα的对照组，Heregulinα引起SK-BR-3细胞HER3磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀各自单独用药轻微抑制了Heregulinα对SK-BR-3细胞中HER3磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药，完全逆转了Heregulinα对HER3磷酸化的上调作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，没有抑制Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药明显抑制了Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，也明显抑制了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用，而GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全逆转了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用。
实施例13重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制乳腺癌BT-474细胞增殖活性
乳腺癌BT-474细胞表达中等水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2，但不表达P-HER3(Richard M.Neve.Acollectionof breast cancer cell lines forthe study of functionally distinct cancer subtypes.CANCER CELL,2006:515-527)。将处于对数生长期的BT-474细胞以5000细胞每孔于RPMI1640(购自Invitrogen公司，货号：A10491)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)完全培养基中培养到96孔培养板，37℃，5％CO2中培养24小时。GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药抑制试验。单独用药组分别加入GB235-019抗体和赫赛汀(工作终浓度为75,18.8,4.7,1.2,0.29,0.07,0.018,0.005,0.0011,0μg/ml)，同时联合用药组加入以上述每个剂量的GB235-019抗体和赫赛汀。37℃，5％CO2中继续培养72小时。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测BT-474细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
完全培养基中添加Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)的增殖抑制试验中，在上述GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药处理2小时后，加入工作终浓度为100ng/ml的Heregulinα溶液，设置未加Heregulinα溶液的孔，37℃，5％CO2中继续培养6天。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测BT-474细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
图9A显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制BT-474细胞增殖活性的实验结果。结果显示，赫赛汀在完全培养基中能抑制BT-474细胞增殖，并呈现出浓度依赖性。GB235-019抗体在完全培养基中不能抑制BT-474细胞增殖。GB235-019抗体与赫赛汀联合用药，没有增加赫赛汀的抑制作用。
图9B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外逆转Heregulinα诱导BT-474细胞对赫赛汀耐药作用的实验结果。结果显示，完全培养基中添加Heregulinα，Heregulinα诱导了BT-474细胞的增殖。BT-474细胞对赫赛汀单独给药变得不敏感，GB235-019抗体单独给药也没有抑制作用。而GB235-019抗体和赫赛汀联合给药抑制了Heregulinα诱导的增殖作用。GB235-019抗体和赫赛汀联合给药使得不仅抑制了Heregulinα诱导BT-474细胞增殖的作用，并明显抑制到低于Heregulinα诱导前的水平，并呈现出浓度依赖性。
乳腺癌BT-474细胞表达中等水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2，但不表达P-HER3。赫赛汀抑制P-HER2驱动的生长作用，但不能抑制Heregulinα诱导BT-474细胞的生长作用。生长因子Heregulinα使BT-474细胞产生了对赫赛汀的耐药性，GB235-019抗体和赫赛汀联合给药抑制了生长因子Heregulinα对BT-474细胞的诱导生长作用，并且明显抑制到低于Heregulinα诱导前的水平，GB235-019抗体和赫赛汀联合给药不仅关闭了HER2信号通路驱动的生长作用，也关闭了HER3信号通路驱动的生长作用，产生协同抑制作用。
实施例14重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外对乳腺癌BT-474细胞信号转导的抑制作用
将处于对数生长期的BT-474细胞1.8×105细胞每孔于RPMI1640完全培养基中培养到6孔培养板，37℃，5％CO2中培养24小时。第二天，弃去培养基换成含0.1％血清的低血清培养基饥饿培养24小时。随后添加GB235-019抗体20μg/ml,赫赛汀20μg/ml单独给药，以及GB235-019抗体和赫赛汀的联合给药，抗体处理BT-474细胞6小时后，添加终浓度为100ng/ml的Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)诱导10分钟，设置未加Heregulinα的空白对照孔。4℃预冷的PBS洗涤一次后终止反应，添加120μl LDS(购自Invitrogen公司，货号：NP0007),冰上放置并迅速收集细胞裂解液，-80℃保存备用。
收集的细胞裂解液在终浓度为50mM的二硫苏糖醇(购自Sangon公司，货号：D0281)还原条件下,经Western-blot分析检测抗体对Heregulinα诱导BT-474细胞HER3磷酸化的影响，以及对HER3下游Akt和ERK1/2磷酸化的影响。Western-blot方法同实施例12。
乳腺癌BT-474细胞表达高水平的P-HER2，但不表达P-HER3，是对赫赛汀敏感的细胞株。图10的结果显示，相比较不加Heregulinα的对照组，Heregulinα引起BT-474细胞HER3磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀各自单独用药明显抑制了Heregulinα对BT-474细胞中HER3磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药，完全逆转了Heregulinα对HER3磷酸化的上调作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，没有抑制Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药微弱的抑制了Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀单独用药微弱的抑制了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用，而GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全逆转了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用。
实施例15重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制乳腺癌MDA-MB-175Ⅶ细胞的增殖活性
乳腺癌MDA-MB-175Ⅶ细胞表达中等水平的HER2和中等水平的HER3。同时MDA-MB-175Ⅶ细胞是一个内源性分泌HER 3配体Heregulinα且依赖性的细胞株，所以MDA-MB-175Ⅶ细胞表达高水平的P-HER3，但不表达P-HER2(Richard M.Neve.Acollectionof breastcancer cell lines for the study of functionally distinct cancersubtypes.CANCER CELL,2006:515-527.)。将处于对数生长期的MDA-MB-175Ⅶ(购自美国典型培养物保藏中心，登录号：HTB-25)细胞2×104细胞每孔于100μl L-15(购自Invitrogen公司，货号：11415-064)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)培养基中培养到96孔培养板，37℃，空气中培养24小时。GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药抑制试验。单独用药组分别加入GB235-019抗体和赫赛汀，工作终浓度为(75,18.8,4.7,1.2,0.29,0.07,0.018,0.005,0.0011,0μg/ml)，同时联合用药组加入上述每个剂量的GB235-019抗体和赫赛汀。37℃，5％CO2中继续培养6天。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测MDA-MB-175Ⅶ细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
图11显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外抑制MDA-MB-175Ⅶ细胞增殖活性的实验结果。结果显示，GB235-019抗体与赫赛汀单独给药在完全培养基中能微弱的抑制MDA-MB-175Ⅶ细胞增殖。GB235-019抗体与赫赛汀联合用药，明显增加了协同抑制作用，并呈现出浓度依赖性。
实施例16重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外对乳腺癌MCF 7细胞在完全培养基中增殖活性的影响
乳腺癌MCF 7细胞表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3(Richard M.Neve.Acollectionof breast cancer cell lines for the study offunctionally distinct cancer subtypes.CANCER CELL,2006:515-527.)。将处于对数生长期的MCF 7(购自美国典型培养物保藏中心，登录号：HTB-22)细胞6000细胞每孔于RPMI1640(购自Invitrogen公司，货号：A10491)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)的完全培养基中培养到96孔培养板，37℃，5％CO2中培养24小时。GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药抑制试验。单独用药组分别加入GB235-019抗体和赫赛汀(工作终浓度为75,18.8,4.7,1.2,0.29,0.07,0.018,0.005,0.0011,0μg/ml)，同时联合用药组加入GB235-019抗体和赫赛汀(工作终浓度均为75,18.8,4.7,1.2,0.29，0μg/ml)。37℃，5％CO2中继续培养72小时。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测MCF 7细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
完全培养基中添加Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)的诱导增殖抑制试验中，在上述GB235-019抗体单独用药和与赫赛汀联合用药处理2小时后，加入工作终浓度为100ng/ml的Heregulinα溶液，设置未加Heregulinα溶液的孔，37℃，5％CO2中继续培养3天。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测MCF 7细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值。
图12A显示了重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外对完全培养基中抑制MCF 7细胞增殖活性的实验结果。结果显示，赫赛汀与GB235-019抗体单独给药在完全培养基中都不能抑制MCF 7细胞增殖，赫赛汀与GB235-019抗体联合给药在完全培养基中，也不能抑制MCF7细胞增殖。
图12B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外对完全培养基中Heregulinα诱导MCF 7细胞增殖活性的实验结果。结果显示，完全培养基中添加Heregulinα，Heregulinα微弱的诱导了MCF 7细胞的增殖。赫赛汀单独给药抑制了Heregulinα对MCF 7细胞的诱导增殖作用，并呈现出浓度依赖性，GB235-019抗体单独给药没有抑制作用。而GB235-019抗体和赫赛汀联合给药没有增加赫赛汀的抑制作用。
实施例17重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外对乳腺癌MCF 7细胞在低血清培养中Heregulinα诱导生长的抑制作用
乳腺癌MCF 7细胞表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3(Richard M.Neve.Acollectionof breast cancer cell lines for the study offunctionally distinct cancer subtypes.CANCER CELL，2006:515-527.)。将处于对数生长期的MCF 7细胞1×104细胞每孔于100μl RPMI1640(购自Invitrogen公司，货号：A10491)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)完全培养基中培养到96孔培养板，37℃，5％CO2中培养24小时。吸去培养基后，每孔换成含0.1％胎牛血清的RPMI1640培养基，饥饿培养24小时。GB235-019抗体单独用药抑制试验，吸去培养基，加入GB235-019抗体，工作终浓度为(30,6.0,1.2,0.24,0.048,0.009 6,0.001 9,0.000 4,0μg/ml)。联合用药抑制试验中，上述每个剂量的GB235-019抗体，GB235-019抗体上述每个剂量分别与10ng/ml和100ng/ml的赫赛汀的联合用药组。37℃，5％CO2中培养2小时后，加入工作终浓度为100ng/ml的Heregulinα溶液(购自R&D公司，货号：296-HR)，设置未加Heregulinα溶液的对照孔，37℃，5％CO2中继续培养72小时。加入AlamarBlue(购自Invitrogen公司，货号：DAL1100)检测MCF 7细胞活性,在M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)上544/590nm波长下读取荧光值，细胞生长倍数计算时以不加Heregulinα诱导的细胞活性的对照组设为100％。
图13A和图13B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-019抗体体外对低胎牛血清培养基中Heregulinα诱导MCF 7细胞增殖活性的实验结果。结果显示，低胎牛血清培养基中添加Heregulinα，Heregulinα诱导了MCF 7细胞的增殖。GB235-019抗体单独给药抑制了Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖，并呈现出浓度依赖性。GB235-019抗体与10ng/ml赫赛汀联合给药，协同抑制了Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖。GB235-019抗体与100ng/ml赫赛汀联合给药，协同抑制了Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖，增加了最大抑制作用。
实施例18重组全长抗人HER2GB235-019抗体体外对乳腺癌MCF 7细胞信号转导的抑制作用
乳腺癌MCF 7细胞表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3。评价了GB235-019抗体单独用药或与赫赛汀联合用药对Heregulinα激活的HER3信号通路的抑制作用。
将处于对数生长期的MCF 7细胞1.0×105细胞每孔于RPMI1640(购自Invitrogen公司，货号：A10491)含10％胎牛血清(购自Invitrogen公司，货号：10099-141)完全培养基中培养到12孔板中培养24小时。第二天，弃去培养基换成含0.1％胎血清的低血清培养基饥饿培养24小时。随后含20μg/ml的GB235-019抗体和20μg/ml的赫赛汀的RPMI-0.1％胎血清的培养基单独用药处理或者联合用药处理MCF 7细胞6小时，随后加入工作终浓度为100ng/ml的Heregulinα(购自R&D公司，货号：296-HR)诱导10分钟。设置未加Heregulinα的空白对照孔。4℃预冷的PBS洗涤一次后终止反应，添加120μl LDS(购自Invitrogen公司，货号：NP0007),冰上放置迅速收集细胞裂解液，-80℃保存备用。
收集的细胞裂解液在终浓度为50mM的二硫苏糖醇还原条件下,经Western-blot分析检测抗体对Heregulinα诱导MCF 7细胞HER3磷酸化的影响，以及对HER3下游Akt和ERK1/2磷酸化的影响。Western-blot方法同实施例12。
图14显示了GB235-019抗体对乳腺癌MCF 7细胞信号转导的抑制作用。图14的结果显示，相比较不加Heregulinα的对照组，Heregulinα引起MCF 7细胞HER3磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀各自单独用药明显抑制了Heregulinα对MCF 7细胞中HER3磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药，完全逆转了Heregulinα对HER3磷酸化的上调作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀单独用药，明显抑制Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用，相比较单独给药，GB235-019抗体与赫赛汀的联合用药完全逆转了Heregulinα对Akt磷酸化的上调作用。GB235-019抗体与赫赛汀单独用药明显抑制了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用，而GB235-019抗体与赫赛汀联合用药完全逆转了Heregulinα对ERK1/2磷酸化的上调作用。
HER3受体在HER2过度表达的乳腺癌中HER2介导的转化和肿瘤进展以及对HER2抑制剂治疗获得性的耐药中，发挥至关重要的作用。HER3的靶向抑制剂在HER2依赖性的多个乳腺癌模型中增加了HER2受体抑制剂的药效(Joan T.Garrett.Dual Blockade of HER2inHER2-Overexpressing Tumor Cells Does Not Completely EliminateHER3Function.Clin Cancer Res 2013(19):610-619.)。GB235-019抗体在低血清培养基中单独给药抑制了HER3配体Heregulinα诱导MCF 7细胞的增殖活性，GB235-019抗体与10ng/ml赫赛汀联合用药可以产生协同抑制Heregulinα诱导MCF7乳腺癌细胞(表达较低水平的HER2和高水平HER3，但不表达P-HER2和P-HER3)的增殖活性，GB235-019抗体与100ng/ml赫赛汀联合用药可以增强赫赛汀抑制Heregulinα诱导MCF 7细胞增殖活性的最大抑制作用。同时，GB235-019抗体与赫赛汀在完全培养基中联合用药可以抑制HER3配体Heregulinα诱导乳腺癌SK-BR-3细胞(表达高水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2和中等水平的P-HER3)增殖作用部分，GB235-019抗体与赫赛汀在完全培养基中联合用药不仅可以抑制HER3配体Heregulinα诱导乳腺癌BT-474细胞(表达中等水平的HER2和中等水平的HER3，同时表达高水平的P-HER2，但不表达P-HER3)增殖作用部分，且并明显抑制到低于Heregulinα诱导前的水平。GB235-019抗体在完全培养基中单独给药微弱抑制了乳腺癌MDA-MB-175Ⅶ细胞(表达中等水平的HER2和中等水平的HER3，同时MDA-MB-175Ⅶ细胞是一个内源性分泌HER 3配体Heregulin且依赖性的细胞株，所以MDA-MB-175Ⅶ细胞表达高水平的P-HER3，但不表达P-HER2)的增殖活性，GB235-019抗体与赫赛汀在完全培养基中联合用药可以完全抑制乳腺癌MDA-MB-175Ⅶ细胞的增殖作用，并呈现出浓度依赖性。在信号通路的研究中，GB235-019抗体20μg/ml单独给药部分抑制了HER 3配体Heregulinα诱导SK-BR-3细胞HER3的磷酸化，GB235-019抗体20μg/ml与赫赛汀20μg/ml联合用药完全抑制了配体Heregulinα激活的HER3信号通路。GB235-019抗体20μg/ml单独给药明显抑制了HER 3配体Heregulinα诱导BT-474细胞HER3的磷酸化，GB235-019抗体20μg/ml与赫赛汀20μg/ml联合用药也完全抑制了配体Heregulinα激活的HER3信号通路。同样，GB235-019抗体20μg/ml单独给药明显抑制了HER 3配体Heregulinα诱导MCF 7细胞HER3的磷酸化，GB235-019抗体20μg/ml与赫赛汀20μg/ml联合用药也完全抑制了配体Heregulinα激活的HER3信号通路。这些结果表明，GB235-019抗体通过抑制HER-3信号通路,与赫赛汀联合用药在HER2高表达的乳腺癌细胞中发挥协同抑制作用。
实施例19重组全长抗人HER2GB235-019抗体对人乳腺癌(KPL-4)细胞小鼠移植瘤的生长抑制作用
人乳腺癌KPL-4细胞表达高水平的P-HER2(Werner Scheuer.Strongly EnhancedAntitumor Activity of Trastuzumab and Pertuzumab Combination Treatment onHER2-Positive Human Xenograft Tumor Models.Cancer Res,2009(69):9330-9336.)。重组全长抗人HER2GB235-019抗体对人乳腺癌(KPL-4)细胞小鼠移植瘤的生长抑制作用(实验委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，合同号:GRBI-2013-057)。扩增培养KPL-4细胞(南京金斯瑞生物科技有限公司保存)，按5×106细胞/只小鼠(细胞悬液和Matrigel(购自BD公司)体积比为1:1)分别接种至38只SCID Beige小鼠(购自北京维通利华)身体右侧倒数第二对乳垫下。当肿瘤体积达到100-200mm3时，依照肿瘤体积大小和体重选取24只小鼠随机分为4组，每组6只动物。
赫赛汀组(30mg/kg赫赛汀)，GB235-019抗体组(30mg/kg GB235-019抗体)，联合用药组(30mg/kg赫赛汀+30mg/kg GB235-019抗体)及空白对照组(PBS)，所有药物给药途径为腹腔注射，一周一次，共给药四周。每周两次测量肿瘤体积并进行称量小鼠体重。
如图15，赫赛汀30mg/kg单独用药可部分抑制KPL-4肿瘤的生长；GB235-019抗体30mg/kg单独用药不能抑制KPL-4肿瘤的生长；GB235-019抗体30mg/kg与赫赛汀30mg/kg联合用药完全抑制了KPL-4肿瘤的生长，体现显著地协同抑制KPL-4肿瘤生长作用。
KPL-4细胞表达高水平的P-HER2，但是对低剂量的赫赛汀显示耐药作用。赫赛汀30mg/kg单独用药可明显抑制KPL-4肿瘤的生长，但是GB235-019抗体30mg/kg与赫赛汀30mg/kg联合用药完全抑制了KPL-4肿瘤的生长，说明GB235-019抗体有不同机理的抑制作用，结合前面GB235-019抗体体外细胞学研究数据，GB235-019抗体可以抑制HER-3信号通路。提示GB235-019抗体通过抑制HER-3信号通路与赫赛汀在体内联合用药可以协同抑制肿瘤的生长。
Claims (15)
1.一种全人源的HER2抗体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.权利要求1的全人源HER2抗体，其是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv的形式。
3.权利要求1的全人源HER2抗体，还包括人IgG的重链恒定区和轻链恒定区。
4.权利要求3的全人源HER2抗体，其中所述人IgG为IgG1。
5.权利要求4的全人源HER2抗体，其中所述人IgG重链恒定区的氨基酸序列为SEQ IDNO:5，所述人IgG轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
6.编码权利要求1的全人源HER2抗体的核苷酸序列。
7.权利要求6的编码全人源HER2抗体的核苷酸序列，其中在所述核苷酸序列中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNO:4。
8.权利要求6的编码全人源HER2抗体的核苷酸序列，其中当所述全人源HRE2抗体包含重链恒定区和轻链恒定区时，编码所述重链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，编码所述轻链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
9.一种包含权利要求6的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
10.权利要求9的表达载体，其中所述表达载体为pGEM-T载体或293载体。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1的全人源HER2抗体和可药用载体。
12.一种联合药物，其包含权利要求1的全人源HER2抗体和其他HER2阳性肿瘤治疗剂，所述其他HER2阳性肿瘤治疗剂为赫赛汀或帕妥珠。
13.一种检测人HER2的试剂盒，其包含权利要求1或2的全人源HER2抗体。
14.权利要求1的全人源HER2抗体用于制备用于治疗受试者中的HER2阳性的乳腺癌的药物的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述受试者是患有HER2阳性的乳腺癌的人。
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