CN104529834A - 1-芘基-碳酰肼的合成及其衍生物在糖蛋白特异性预染检测法中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测法检测技术，具体地说是1-芘基-碳酰肼(UGF202)的合成及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测中的应用。本发明还提供了应用UGF202进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法，包括步骤：向蛋白质样品中加入高碘酸溶液进行氧化；加入抗坏血酸溶液中和过量高碘酸溶液；加入染料反应；加入上样缓冲液；电泳；观察。本预染发明具有灵敏度高、选择性好、操作简单迅速、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点。此外相对于凝胶电泳后糖蛋白染色方法，预染检测法在电泳结束后即可观察，节省了凝胶电泳后染色步骤，可较好地适用于高通量蛋白质组学的研究。

Description

1-芘基-碳酰肼的合成及其衍生物在糖蛋白特异性预染检测法中的应用

技术领域

本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测技术，具体地说是1-芘基-碳酰肼(UGF202)的设计合成及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。

背景技术

蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也占到较高的比例。

分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤，是下一步结构分析得以实施的基础，目前凝胶上蛋白质染色主要分为预染及后染两类。前者在电泳前对样品进行处理，使染料特异性地与样品内糖蛋白相结合，经电泳分离之后即可在相应激发波长下进行观察，后染主要对电泳后的蛋白凝胶进行特异性染色。

目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于后染，且多数产品均以高附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。糖蛋白特异性荧光预染检测技术鲜有报道。本发明开发的UGF202及其衍生物荧光预染检测方法灵敏度与经典的Pro-Q Emerald300染色法一致，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光预染检测技术，有较好的基础与临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供UGF202的合成及其衍生物在糖蛋白特异性预荧光检测中的应用。

本发明所述的UGF202相关化合物是指UGF202阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。

UGF202母核为：

为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用UGF202进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法包括如下步骤：

1)在1-20μL含0.5-10μg蛋白样品(不足1-20μL用重蒸水补足)中加入0.005-0.05M高碘酸水溶液1-20μL，置于避光处进行氧化反应2-20min；优选的样品体积为10μL，优选的高碘酸摩尔浓为0.03M，体积为10μL，优选的反应时间是5min；

2)在反应液中加入0.1-0.3M抗坏血酸1-10μL，摇匀反应0.1-5min；优选的抗坏血酸摩尔浓度是0.24M，体积为5μL，优选的反应时间是0.5min；

3)在反应液中加入UGF202或其衍生物按重量体积比1-5％二甲基亚砜溶液1-5μL，室温下反应5-20min；优选的UGF202或其衍生物溶液为含重量体积是0.5％，体积为2.5μL，优选的反应时间是10min；

4)在反应液中加入10-50μL 3X蛋白质上样缓冲液，摇匀；优选的体积为30μL；

5)电泳，观察。

前期研究表明该技术有如下优点：

1)灵敏度高：UGF202糖蛋白特异性荧光预染检测法灵敏度同Pro-Q Emerald 300灵敏度相当；

2)操作简单迅速：省去后染必需的固定等操作步骤，可在15min内完成；电泳结束后即可观察；

3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

4)可逆性好：容易脱色；

5)质谱兼容性好：由于UGF202荧光预染检测法不影响蛋白质结构，所以可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；

6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；

7)成本低。

附图说明

图1.UGF202化学结构；

图2中(A-D)为在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对Sigma公司的八种不同标准蛋白质样品选择性及灵敏度比较。(A)UGF202糖蛋白荧光预染检测法，(B)UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，(C)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(D)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。带1，250ng；带2，125ng；带3，64ng；带4，32ng；带5，16ng；带6，8ng；带7，4ng；带8，2ng；带9，1ng；带10，0.5ng。Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法、SYPRORuby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作；图中名称用斜体字表示为糖基化蛋白质。

(E-H)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对提取的人血清样品选择性及灵敏度比较。(E)UGF202糖蛋白荧光预染检测法，(F)UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(G)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(H)Pro-Q Emerald300糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。蛋白样品从左至右(1到100倍倍稀释。

图3.二向SDS-PAGE胶上，(A)UGF202糖蛋白荧光预染检测法，(B)UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。分离样品为人血清总蛋白；IPG胶条长13厘米，pH 3-10；分离胶的浓度为11.4％；样品上样量为25μg/胶条。

图4.比较在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对去糖基化样品选择性。(-)表示未经去糖基化处理，(+)表示经PNGase F去糖基化处理。(A，C，E，G)样品为avidin，(B，D，F，H)样品为人血清总蛋白。样品电泳后，经不同的染色方法染色。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1 UGF202糖蛋白特异性荧光预染检测法

图1是UGF202染料的化学结构式。

图2-4是UGF202糖蛋白特异性荧光预染检测法数据图。

实验采用下述步骤进行：

1)在10μL含0.5-10μg蛋白样品(不足10μL用重蒸水补足)中加入0.03M高碘酸水溶液10μL，置于避光处进行氧化反应5min；

2)在反应液中加入0.24M抗坏血酸5μL，摇匀反应0.5min；

3)在反应液中加入0.5％UGF202或其衍生物2.5μL，室温下反应10min；

4)在反应液中加入30μL 3X上样缓冲液，摇匀；

5)电泳，观察。

按照上述方法分别用UGF202的钠盐、钾盐、铵盐进行糖蛋白预染，结果表明明这些衍生物均能够得到类似于UGF202的检测结果。

图2是说明UGF202糖蛋白特异性荧光预染检测法与其它染色法效果对比。

按照实施例1的方法，采用不同染色方法进行染色。

图2中(A-D)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对Sigma公司的八种不同标准蛋白质样品选择性及灵敏度比较。(A)UGF202糖蛋白荧光预染检测法，(B)UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，(C)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(D)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。带1，250ng；带2，125ng；带3，64ng；带4，32ng；带5，16ng；带6，8ng；带7，4ng；带8，2ng；带9，1ng；带10，0.5ng。Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法、SYPRORuby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作；图中名称用斜体字表示为糖基化蛋白质。

(E-H)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对提取的人血清样品选择性及灵敏度比较。(E)UGF202糖蛋白荧光预染检测法，(F)UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(G)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(H)Pro-Q Emerald300糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。蛋白样品从左至右(1到10)倍倍稀释。

UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测灵敏度与Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法一致。在选择性方面，仅糖基化蛋白(名称用斜体字表示)能被UGF202预染检测法及Pro-QEmerald 300检测，SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法则能检测凝胶上所有类型蛋白。

图3是说明UGF202糖蛋白荧光预染检测法结合二向电泳技术对糖基化蛋白进行特异性检测。

将人血清总蛋白经二向凝胶电泳分离后，分别采用实验例1的(A)UGF202糖蛋白荧光预染检测法，(B)UGF202糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法进行染色，结果如图3所示。显示UGF202糖蛋白荧光预染检测法能在二向凝胶电泳技术基础上对糖基化蛋白进行特异性检测。

图4是说明在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对去糖基化样品选择性。(-)表示未经去糖基化处理，(+)表示经PNGase F去糖基化处理。(A，C，E，G)样品为avidin，(B，D，F，H)样品为人血清总蛋白。样品电泳后，经不同的染色方法染色。结果如图4所示，经去糖基化处理后的avidin和人血清总蛋白可被SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，但几乎不能被UGF202糖蛋白荧光染色法及Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法识别。进一步说明UGF202糖蛋白荧光染色法对糖蛋白检测具有高度特异性。

图2-4中的参考染色方法及其相关文献

Pro-Q Emerald 300糖蛋白染色法操作方法参见文献：Thomas H.Steinberg，Karen PrettyOn Top Kiera N.Berggren，Wayne F.Patton，(2001)Rapid and simple single nanogram detection ofglycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots.Proteomics 1，841-855.

SYPRO Ruby荧光染色法操作方法参见文献：Malone，J.，Radabaugh，M.，Leimgruber，R.，Gerstenecker，G.(2001)Practical aspects of fluorescent staining for proteomic application.Electrophoresis 22，919-932.

Claims (10)

1.具有下列化学结构的化合物及其成盐化合物：

化合物(UGF202)为：

(E)-(pyren-1-ylmethylene)carbohydrazide

(E)-1-芘基碳酰肼。

2.权利要求上述化合物，其在糖蛋白特异性预染检测中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的UGF202的钠盐、钾盐、铵盐等。

4.一种凝胶上糖蛋白特异性荧光预染检测法，其包括步骤：

1)在1-20μL含0.5-10μg蛋白样品(不足1-20μL用重蒸水补足)中加入0.005-0.05M高碘酸水溶液1-20μL，置于避光处进行氧化反应2-20min；

2)在反应液中加入0.1-0.3M抗坏血酸1-10μL，摇匀反应0.1-5min；

3)在反应液中加入UGF202或其衍生物按体积比0.1-5％二甲基亚砜溶液1-5μL，室温下反应5-20min；

4)在反应液中加入10-50μL 3X蛋白质上样缓冲液，摇匀；

5)电泳，观察。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中蛋白样品体积为10μL：所加高碘酸水溶液体积为10μL，摩尔浓度为0.03M，避光反应。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所加抗坏血酸溶液体积为5μL，摩尔浓度为0.24M。

7.如权利要求4～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所加UGF202或其衍生物溶液为按体积比0.5％的二甲基亚砜溶液2.5μL。

8.如权利要求4～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)向反应液中加入30μL 3X蛋白质上样缓冲液。

9.如权利要求4～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)氧化时间为5min；其特征在于，步骤2)反应时间为0.5min；步骤3)反应时间为10min。

10.如权利要求4～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)可在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。