CN104521764B - 一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使在组培瓶内生根及结薯，所述诱导培养基的配方为：1/4-1/2MS、1.5-2.5mg·L^-1IBA、0.2-0.8mg·L^-1ABA、1.0-2.5mg·L^-1BR、5.15μmol·L^-1JA、450-550mg·L^-1PVP、0.8-1.5mg·L^-1核黄素、35-45g·L^-1蔗糖和3-8g·L^-1琼脂。本发明的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，克服了牛大力组培苗出现不结薯或者结薯能力远远比不上种子苗的问题，且牛大力组培苗在组培瓶内的生根率高达85.5％，平均结薯数高达6.48个。

Description

一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法。

背景技术

牛大力为豆科鸡血藤属植物美丽鸡血藤(CalleryaspeciosaChamp.)，又名大力薯、山莲藕，始载于《生草药性备要》，是《广西中药材标准》(1990年版)收载的地方药材。牛大力以根入药，味甘，具有补虚润肺、强筋活络的功效，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺虚咳嗽、肺结核、慢性支气管炎、慢性肝炎等慢性疾病有较好的疗效。壮族民间常用于腰腿痛、风湿骨痛、肺结核、慢性肝炎及慢性胃炎的治疗。

现代研究发现，牛大力含有多糖、生物碱、香豆素和多种微量元素等成分，其中牛大力多糖是其主要活性成分，是理想的免疫增强剂，具有调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性，尤其是抗肿瘤方面疗效明确，目前临床研究显示其对鼻咽癌、卵巢癌、肺癌以及结肠癌具有良好的治疗效果；生物碱和香豆素具有保肝、祛痰、镇咳、镇痛、镇静、解痉的作用，且对正常细胞均没有毒副作用，在开发抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等药物方面有着特殊的优势，已成为提取企业竞相开发的新目标，市场需求量巨大。自20世纪70年代起，作为主要原料被制药企业加工成壮腰健肾丸、强力健身胶囊、桂龙药膏、活络止痛丸、强力追风透骨丸、舒筋健腰丸、益智康脑丸、抗风湿液等中成药，在全国广泛应用。近年来，牛大力又成为提取企业竞相开发的新目标，提取多糖和高丽槐素等成分。

随着牛大力需求量的不断增加，野生资源已经枯竭，原材料严重供不应求。为了解决供需矛盾，人们尝试采用人工栽培的方法扩大药源，目前已发现有一些成功的研究报道。牛大力组织培养方面，以茎段为外植体的污染率比以种子为外植体的高，且成苗经过愈伤组织，组培周期长，容易引起变异。王祝年等以成熟果荚(种子)为外植体进行组织培养快速繁殖牛大力，种子萌发培养基为1/2MS，芽的增殖与继代培养基为MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1，生根培养基为1/2MS+IBA1.0mg·L^-1，将种子萌发的无菌苗切段接种到增殖培养基上，经过愈伤组织形成不定芽，容易引起变异，40d平均增殖系数达5.0，生根培养20d，生根率达80％。目前普遍存在牛大力组培苗不结薯或者结薯能力远远比不上种子苗的问题，为了解决这个问题，申请人对组培苗瓶内结薯开展了研究，目前仍未发现在牛大力试管苗生根的同时实现试管苗结薯的文献报道。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种诱导培养基及牛大力芽苗的诱导培养方法和炼苗移栽的方法，使牛大力芽苗在组培苗瓶内结薯，克服了牛大力组培苗出现不结薯或者结薯能力远远比不上种子苗的问题。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使在组培瓶内生根及结薯，所述诱导培养基的配方为：1/4-1/2MS、1.5-2.5mg·L^-1IBA、0.2-0.8mg·L^-1ABA、1.0-2.5mg·L^-1BR、5-15μmol·L^-1JA、450-550mg·L^-1PVP、0.8-1.5mg·L^-1核黄素、35-45g·L^-1蔗糖和3-8g·L^-1琼脂。

优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的配方为：1/2MS、2.0mg·L^-1IBA、0.5mg·L^-1ABA、2.0mg·L^-1BR、5μmol·L^-1JA、500mg·L^-1PVP、1.0mg·L^-1核黄素、40g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂。

优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的制备方法为：

先按照所述诱导培养基的配方称取蔗糖与琼脂，煮沸溶解，再按所述诱导培养基的配方添加1/2MS、IBA、ABA、BR、PVP和核黄素，于121℃灭菌20min，在超净工作台上冷却至50℃，之后按照所述诱导培养基的配方添加过滤灭菌后的JA，分装成25-30ml/瓶，冷却凝固后备用，所述过滤灭菌是指将JA通过孔径为0.22μm的膜过滤。

优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理具体是指将置有牛大力芽苗的诱导培养基置于温度为24-28℃、光照强度为700-900Lx、光照时间为9-11h/d的条件下培养23-27d。

优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理之后进行炼苗移栽，具体是指牛大力芽苗在组培瓶内培养23-27d至生根及结薯后，移到炼苗棚进行开盖炼苗，4d后用镊子将瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到混合基质上，移栽后第1-10d内控制相对湿度为92％-97％，温度白天控制在23-25℃，夜间15-18℃，移栽第15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后进行大田栽培，其中所述混合基质由椰糠和细河沙组成，且椰糠的含量占所述混合基质含量的质量百分数为60％-80％。

优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述混合基质中椰糠的含量为75％。

优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述牛大力芽苗是牛大力继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，具体包括以下步骤：

步骤一、外植体灭菌：取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min，经流水冲洗15min，在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后进行初代培养；

步骤二、初代培养：将步骤一种灭菌好的种子接种至初代诱导培养基上进行种子萌发及丛生芽诱导培养，在温度为24-28℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养20-25d，所述初代诱导培养基的配方为：MS、3.0mg·L^-16-BA、1.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1NAA和500mg·L^-1PVP；所述初代诱导培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min；

步骤三、继代增殖：将步骤二中初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继代培养基上进行增殖培养，在温度为24-28℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养20-25d，所述继代培养基的配方为：MS、2.0mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1TDZ和0.2mg·L^-1NAA；所述继代培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min。

本发明提供的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，在组培过程中使牛大力芽苗生根并结薯，有效解决目前普遍存在的牛大力组培苗不结薯的问题，且本发明的方法操作简便，生产成本低，牛大力芽苗增殖速度快，生根移栽成活率高，便于大规模工业化生产应用。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、在诱导培养基中添加IBA与核黄素用以促进牛大力在组培瓶内生根，添加ABA、BR、JA促进牛大力在组培瓶内结薯，而PVP有利于降低褐化程度从而利于牛大力在组培瓶内生根结薯，同时本发明的诱导培养基配方通过以上浓度的物质配比在提高诱导培养基渗透压的同时，促进牛大力在组培瓶内生根并结薯；

第二、高压灭菌时JA容易分解，故采用过滤灭菌方式后添加到诱导培养基中，以确保JA的有效性；

第三、确定了适宜于牛大力芽苗移栽的混合基质，即椰糠与细河沙的质量比为3∶1时，牛大力芽苗移栽的生长状况最好；

第四，本发明的牛大力组培苗瓶内结薯的方法以高质量的无菌苗作为培养材料才能或得高的生根结薯率，本发明的牛大力培养材料选用牛大力种子经外植体灭菌、初代培养和继代增殖至牛大力芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，有利于牛大力组培苗瓶内结薯。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1：

一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使在组培瓶内生根及结薯，所述诱导培养基的配方为：1/4MS、1.5mg·L^-1IBA、0.2mg·L^-1ABA、1.0mg·L^-1BR、5μmol·L^-1JA、450mg·L^-1PVP、0.8mg·L^-1核黄素、35g·L^-1蔗糖和3g·L^-1琼脂。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的制备方法为：

先按照所述诱导培养基的配方称取蔗糖与琼脂，煮沸溶解，再按所述诱导培养基的配方添加1/4MS、IBA、ABA、BR、PVP和核黄素，于121℃灭菌20min，在超净工作台上冷却至50℃，之后按照所述诱导培养基的配方添加过滤灭菌后的JA，分装成25-30ml/瓶，冷却凝固后备用，所述过滤灭菌是指将JA通过孔径为0.22μm的膜过滤。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理具体是指将置有牛大力芽苗的诱导培养基置于温度为24℃、光照强度为700Lx、光照时间为9h/d的条件下培养23d。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理之后进行炼苗移栽，具体是指牛大力芽苗在组培瓶内培养23d至生根及结薯后，移到炼苗棚进行开盖炼苗，4d后用镊子将瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到混合基质上，移栽后第1-10d内控制相对湿度为92％，温度白天控制在23℃，夜间15℃，移栽第15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后进行大田栽培，其中所述混合基质由椰糠和细河沙组成，且椰糠的含量占所述混合基质含量的质量百分数为60％。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述牛大力芽苗是牛大力继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，具体包括以下步骤：

步骤一、外植体灭菌：取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min，经流水冲洗15min，在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后进行初代培养；

步骤二、初代培养：将步骤一种灭菌好的种子接种至初代诱导培养基上进行种子萌发及丛生芽诱导培养，在温度为24℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养20d，所述初代诱导培养基的配方为：

MS、3.0mg·L^-16-BA、1.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1NAA和500mg·L^-1PVP；所述初代诱导培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min；

步骤三、继代增殖：将步骤二中初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继代培养基上进行增殖培养，在温度为24℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养20d，所述继代培养基的配方为：MS、2.0mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1TDZ和0.2mg·L^-1NAA；所述继代培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min。

在本实例中，牛大力组培苗在组织培养瓶内的生根率高达78.4％，平均结薯数高达5.83个。

实施例2：

一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使在组培瓶内生根及结薯，所述诱导培养基的配方为：1/2MS、2.5mg·L^-1IBA、0.8mg·L^-1ABA、2.5mg·L^-1BR、15μmol·L^-1JA、550mg·L^-1PVP、1.5mg·L^-1核黄素、45g·L^-1蔗糖和8g·L^-1琼脂。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的制备方法为：

先按照所述诱导培养基的配方称取蔗糖与琼脂，煮沸溶解，再按所述诱导培养基的配方添加1/2MS、IBA、ABA、BR、PVP和核黄素，于121℃灭菌20min，在超净工作台上冷却至50℃，之后按照所述诱导培养基的配方添加过滤灭菌后的JA，分装成25-30ml/瓶，冷却凝固后备用，所述过滤灭菌是指将JA通过孔径为0.22μm的膜过滤。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理具体是指将置有牛大力芽苗的诱导培养基置于温度为28℃、光照强度为900Lx、光照时间为11h/d的条件下培养27d。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理之后进行炼苗移栽，具体是指牛大力芽苗在组培瓶内培养27d至生根及结薯后，移到炼苗棚进行开盖炼苗，4d后用镊子将瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到混合基质上，移栽后第1-10d内控制相对湿度为97％，温度白天控制在25℃，夜间18℃，移栽第15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后进行大田栽培，其中所述混合基质由椰糠和细河沙组成，且椰糠的含量占所述混合基质含量的质量百分数为80％。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述牛大力芽苗是牛大力继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，具体包括以下步骤：

步骤一、外植体灭菌：取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min，经流水冲洗15min，在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后进行初代培养；

步骤二、初代培养：将步骤一种灭菌好的种子接种至初代诱导培养基上进行种子萌发及丛生芽诱导培养，在温度为28℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养25d，所述初代诱导培养基的配方为：

MS、3.0mg·L^-16-BA、1.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1NAA和500mg·L^-1PVP；所述初代诱导培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min；

步骤三、继代增殖：将步骤二中初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继代培养基上进行增殖培养，在温度为28℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养25d，所述继代培养基的配方为：MS、2.0mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1TDZ和0.2mg·L^-1NAA；所述继代培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min。

在本实例中，牛大力组培苗在组织培养瓶内的生根率高达81.2％，平均结薯数高达6.17个。

实施例3：

一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使在组培瓶内生根及结薯，所述诱导培养基的配方为：

1/2MS、2.0mg·L^-1IBA、0.5mg·L^-1ABA、2.0mg·L^-1BR、5μmol·L^-1JA、500mg·L^-1PVP、1.0mg·L^-1核黄素、40g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的制备方法为：

先按照所述诱导培养基的配方称取蔗糖与琼脂，煮沸溶解，再按所述诱导培养基的配方添加1/2MS、IBA、ABA、BR、PVP和核黄素，于121℃灭菌20min，在超净工作台上冷却至50℃，之后按照所述诱导培养基的配方添加过滤灭菌后的JA，分装成25-30ml/瓶，冷却凝固后备用，所述过滤灭菌是指将JA通过孔径为0.22μm的膜过滤。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理具体是指将置有牛大力芽苗的诱导培养基置于温度为26℃、光照强度为800Lx、光照时间为10h/d的条件下培养25d。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理之后进行炼苗移栽，具体是指牛大力芽苗在组培瓶内培养25d至生根及结薯后，移到炼苗棚进行开盖炼苗，4d后用镊子将瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到混合基质上，移栽后第1-10d内控制相对湿度为95％，温度白天控制在24℃，夜间16℃，移栽第15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后进行大田栽培，其中所述混合基质由椰糠和细河沙组成，且椰糠的含量占所述混合基质含量的质量百分数为75％。

所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述牛大力芽苗是牛大力继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，具体包括以下步骤：

步骤一、外植体灭菌：取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min，经流水冲洗15min，在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后进行初代培养；

步骤二、初代培养：将步骤一种灭菌好的种子接种至初代诱导培养基上进行种子萌发及丛生芽诱导培养，在温度为26℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养22d，所述初代诱导培养基的配方为：

MS、3.0mg·L^-16-BA、1.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1NAA和500mg·L^-1PVP；所述初代诱导培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min；

步骤三、继代增殖：将步骤二中初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继代培养基上进行增殖培养，在温度为26℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养23d，所述继代培养基的配方为：MS、2.0mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1TDZ和0.2mg·L^-1NAA；所述继代培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min。

在本实例中，牛大力组培苗在组织培养瓶内的生根率高达85.5％，平均结薯数高达6.48个。

实施例4：

本发明将牛大力芽苗移栽到不同基质中，观察其成活率和生长情况，其结果见表1。由表1可以看出，椰糠∶细河沙＝3∶1处理苗成活率最高，为87.78％，且苗生长情况良好，与其他处理相比差异达到显著水平。其他基质处理成活率也较高，均超过了70％，单独用椰糠作为基质的成活率也达到了81.11％，但在此基质上苗生长情况一般，估计是透气性不足影响了生长。因此，确定椰糠∶细河沙＝3∶1的组合为牛大力试管苗最佳移栽基质。

表1不同基质对牛大力芽苗移栽效果的影响

实施例5：

一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，以牛大力试管苗为材料直接进行瓶内生根及结薯的诱导，方法包括试管苗生根及结薯培养基配方、诱导方法、炼苗移栽过程：

(1)材料

当牛大力继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切成的单个芽。

(2)生根及结薯方法

将步骤(1)准备好的材料转接至生根及结薯诱导培养基1/2MS(Murashigeandskoog(1962)培养基，下同)+2.0mg·L^-1IBA(吲哚丁酸，下同)+0.5mg·L^-1ABA(脱落酸，下同)+2.0mg·L^-1BR(芸苔素内酯，下同)+5μmol·L^-1JA(茉莉酸甲酯，下同)+500mg·L^-1PVP(聚乙烯吡咯烷酮，下同)+1.0mg·L^-1核黄素+40g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂上进行瓶内生根及结薯诱导。

(3)培养条件

培养条件为(26±2)℃、光照强度800Lx、光照时间10h/d。培养时间＜25d，诱导率可达100％。

(4)培养基配置方法

先配置配方为1/2MS+2.0mg·L^-1IBA+0.5mg·L^-1ABA+2.0mg·L^-1BR+500mg·L^-1PVP+1.0mg·L^-1核黄素+40g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂的培养基，装入500ml的三角瓶，于121℃灭菌20分钟，再在超净工作台上冷却至50℃，用一次性针筒加入过滤灭菌好的5μmol·L^-1JA(过滤灭菌膜孔径0.22μm)，混合后分装，25～30ml/瓶，冷却待培养基的琼脂凝固后(室温3小时以上)即可使用。

(5)炼苗移栽

试管苗在瓶内培养7d开始长根原基，25d后得到生根并结薯的试管苗，此时可将瓶苗移到炼苗棚进行开盖炼苗，4d后，用镊子将瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到椰糠∶细河沙＝3∶1的基质上，移栽后10d内保持相对湿度95％左右，温度白天控制在23～25℃，夜间15～18℃，没有直射光的条件，移栽成活率85％以上。移栽15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后可进行大田栽培。

本发明的优点：本发明提供的整套方法能够在试管苗生根的同时解决试管苗结薯的技术瓶颈，操作简便，生产成本低，增殖速度快，生根移栽成活率高，便于大规模工业化生产应用，可有效解决目前普遍存在的牛大力组培苗不结薯的问题。

其中培养基配置的具体方法如下：

(1)配置配方为：

1/2MS+2.0mg·L^-1IBA+0.5mg·L^-1ABA+2.0mg·L^-1BR+500mg·L^-1PVP+1.0mg·L^-1核黄素+40g·L^-1蔗糖+5g·L^-1的培养基1L；

①用移液管量取MS基本培养基母液(1/2MS即为MS基本培养基，但其中大量元素为1/2)：

A.大量元素25ml，其中含硝酸钾(KNO₃)950mg、硝酸铵(NH₄NO₃)825mg、七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)185mg、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)85mg、无水氯化钙(CaCl₂)166.12mg；

B.微量元素5ml，其中含四水合硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)22.3mg、七水合硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg、硼酸(H₃BO₃)6.2mg、碘化钾(KI)0.83mg、二水合钼酸钠(NaMoO₄·2H₂O)0.25mg、五水合硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg、六水合氯化钴(CoCl·6H₂O)0.025mg；

C.铁盐5ml，其中含乙二胺四乙酸纳(Na₂-EDTA)37.3mg、七水合硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)27.8mg；

D.肌醇25ml，其中含肌醇(C₆H₁₂O₆)100mg；

E.有机物5ml，其中含烟酸(C₆H₅NO₂)0.1mg、盐酸硫胺素(Vit.B₁)0.1mg、盐酸吡哆醇(Vit.B₆)0.5mg、甘氨酸(NH₂CH₂COOH)2.0mg。

②用移液管量取各种激素母液；

A.0.5mg·mL^-1的IBA母液4ml；

B.0.5mg·mL^-1的ABA母液1ml；

C.0.5mg·mL^-1的BR母液4ml；

D.0.5mg·mL^-1的核黄素母液2ml；

③称量PVP0.5g、琼脂5g和蔗糖40g；

④将500ml蒸馏水煮沸后加入上述称量的PVP、琼脂和蔗糖，待药品全部溶解后加入上述量取的MS基本培养基和激素混合；

用蒸馏水定容至1L，并将PH值调节至5.8～6.0；

⑥装入500ml三角瓶中；

⑦将三角瓶放入高压灭菌锅，121℃灭菌20min；

(2)加入过滤灭菌的JA后分装冷却使用。

①将灭菌好的培养基取出移至接种室，在超净工作台上将培养基冷却至50℃；

②用过滤灭菌器(过滤灭菌膜孔径0.22μm)将配置好的5μmol·mL^-1JA母液进行过滤灭菌；

③将过滤灭菌好的JA吸取lml加入到培养基中，混合后分装，25～30ml/瓶，冷却待培养基的琼脂凝固后(室温3h以上)即可使用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (7)

1.一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使其在组培瓶内生根及结薯，所述诱导培养基的配方为：1/4-1/2MS、1.5-2.5mg·L^-1IBA、0.2-0.8mg·L^-1ABA、1.0-2.5mg·L^-1BR、5-15μmol·L^-1JA、450-550mg·L^-1PVP、0.8-1.5mg·L^-1核黄素、35-45g·L^-1蔗糖和3-8g·L^-1琼脂。

2.如权利要求1所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，所述诱导培养基的配方为：1/2MS、2.0mg·L^-1IBA、0.5mg·L^-1ABA、2.0mg·L^-1BR、5μmol·L^-1JA、500mg·L^-1PVP、1.0mg·L^-1核黄素、40g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂。

3.如权利要求2所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，所述诱导培养基的制备方法为：

先按照所述诱导培养基的配方称取蔗糖与琼脂，煮沸溶解，再按所述诱导培养基的配方添加1/2MS、IBA、ABA、BR、PVP和核黄素，于121℃灭菌20min，在超净工作台上冷却至50℃，之后按照所述诱导培养基的配方添加过滤灭菌后的JA，分装成25-30ml/瓶，冷却凝固后备用，所述过滤灭菌是指将JA通过孔径为0.22μm的膜过滤。

4.如权利要求3所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，所述诱导培养管理具体是指将置有牛大力芽苗的诱导培养基置于温度为24-28℃、光照强度为700-900Lx、光照时间为9-11h/d的条件下培养23-27d。

5.如权利要求4所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，所述诱导培养管理之后进行炼苗移栽，具体是指牛大力芽苗在组培瓶内培养23-27d至生根及结薯后，移到炼苗棚进行开盖炼苗，4d后用镊子将组培瓶内的瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到混合基质上，移栽后第1-10d内控制相对湿度为92％-97％，温度白天控制在23-25℃，夜间15-18℃，移栽第15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后进行大田栽培，其中所述混合基质由椰糠和细河沙组成，且椰糠的含量占所述混合基质含量的质量百分数为60％-80％。

6.如权利要求5所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，所述混合基质中椰糠的含量为75％。

7.如权利要求1-6中任一所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，其特征在于，所述牛大力芽苗是牛大力继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，获得牛大力继代增殖芽苗的方法具体包括以下步骤：

步骤一、外植体灭菌：取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min，经流水冲洗15min，在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后进行初代培养；

步骤二、初代培养：将步骤一中灭菌好的种子接种至初代诱导培养基上进行种子萌发及丛生芽诱导培养，在温度为24-28℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养20-25d，所述初代诱导培养基的配方为：MS、3.0mg·L^-16-BA、1.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1NAA和500mg·L^-1PVP；所述初代诱导培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min；

步骤三、继代增殖：将步骤二中初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继代培养基上进行增殖培养，在温度为24-28℃、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的条件下培养20-25d，所述继代培养基的配方为：MS、2.0mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1KT、0.2mg·L^-1TDZ和0.2mg·L^-1NAA；所述继代培养基附加30g·L^-1蔗糖和5g·L^-1琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20min。