CN104507964B - P2x7受体拮抗剂和激动剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对P2X7的生物材料并且更特别是涉及多肽，编码此种多肽的核酸；制备此种多肽的方法；表达或能够表达此种多肽的宿主细胞；用于预防、治疗或诊断目的的包含此种多肽的组合物并且尤其是药物组合物。尤其是，本发明的生物材料抑制P2X7受体的生物学活性，诸如被ATP活化。

Description

P2X7受体拮抗剂和激动剂
发明领域
本发明涉及与P2X7受体相关的生物材料并且更特别是涉及多肽,编码此种多肽的核酸；制备此种多肽的方法；表达或能够表达此种多肽的宿主细胞；用于预防、治疗或诊断目的的包含此种多肽的组合物并且尤其是药物组合物。
背景技术
嘌呤核苷酸被公认为细胞外信号转导分子。P2X受体是ATP-门控(gated)阳离子通道，其介导例如在脑和脊髓的不同区域中的快速刺激性传递。P2X7亚型具有在延长的对ATP的暴露过程中改变其离子选择性的独特性质,其导致通道孔的渐进式扩张和形成对大如900Da的分子的渗透性。P2X7受体最初在造血源细胞(包括巨噬细胞,小神经胶质细胞,和某些淋巴细胞)中描述,并且介导Ca2+和Na+离子的流入,以及促炎症细胞因子的释放。P2X7受体可以通过其调节白细胞介素-1β(神经变性,慢性炎症,和慢性疼痛中的关键介质)的加工和释放能力影响神经细胞死亡。P2X7受体的活化提供炎性刺激,并且P2X7受体-缺陷小鼠具有基本上减弱的炎性反应,包括神经病性和慢性炎性疼痛的模式。此外,P2X7受体活性,通过调节促炎症细胞因子的释放,可以参与抑郁症(depression)的病理生理学。P2X7受体可以因此代表神经和免疫系统之间的关键通信连接(Skaper等人2010 FASEB J.24：337-345)。P2X7受体向免疫系统的关键细胞的定位,加上其从这些细胞释放重要炎性介质的能力提示P2X7受体拮抗剂在广泛疾病的治疗中的潜在作用，所述疾病包括疼痛和神经变性疾病,同时提供用于治疗剂开发的靶点。
在凋亡细胞死亡为重要疾病机制的癌症中,P2X7以其在凋亡中的直接作用发挥重要作用，如与正常组织相比在皮肤癌和子宫上皮癌中所显示的。可能P2X7将在未来用作生物标志物以区分正常和癌症子宫上皮组织。
已经将啮齿类动物糖尿病模型中视网膜的早期凋亡细胞死亡与在眼的那个部分的P2X7活化关联起来,提示与糖尿病微血管损伤的可能关联。
已经报道，在基于家庭的定量遗传关联研究中，P2X7受体多态性可以与高血压(hypertension)相关,P2X7的第一内含子中的单核苷酸多态性rs591874与夜间舒张压强烈相关。P2X7受体表达在心血管系统细胞中并且影响该信号转导系统的药物可以提供高血压和预防血栓形成事件方面的新疗法。
在健康肾中P2X7受体的表达非常少(如果有的话)。相反,P2X7的表达在患病的肾组织中增加并且两个肾疾病啮齿动物模型的肾小球的免疫组化显示，在足细胞、内皮和肾小球膜细胞中有显著表达。已经描述了P2X7受体对多囊性肾病(polycystic kidneydisease)和肾纤维化的可能作用。
因为ATP在神经传递和神经调节中发挥重要作用,所以嘌呤受体亚家族(包括P2X7)已经参与各种病理状态。中枢神经系统(CNS)疾病的该病理生理学包括脑外伤,局部缺血(ischemia),神经变性和神经精神性疾病。当损伤发生时,大量ATP被释放到细胞外环境，其对于引发针对外伤的细胞应答是重要的。在此情况下,P2X4和P2X7的表达水平改变，其可能刺激静止的小神经胶质细胞向损伤位点迁移和趋化。P2X7在控制小神经胶质细胞迁移和死亡方面发挥重要作用。
脑缺血可以产生CNS问题和使CNS问题加重，所述CNS问题包括卒中(stroke)并且在小神经胶质细胞上表达的P2X7受体可能参与由于葡萄糖/氧丧失而产生的皮层损伤。
神经炎症在很多神经变性疾病诸如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和帕金森病(Parkinson’s disease)的发病中发挥主要作用。尽管精确机制尚不清楚,但小神经胶质细胞中信号转导通路的失调可以增强炎症,导致突触功能障碍并最终导致神经细胞死亡。P2X7受体的表达和功能在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)患者死亡后的脑中和不同神经变性疾病动物模型中显著上调。这支持P2X7R通路在神经变性进程中的作用。已经显示，使用亮蓝G(可以穿过血脑屏障的P2X7R拮抗剂)阻断P2X7R导致各种动物模型中神经病理学的改善。突触的改变和增加的对神经死亡的易感性是已知的对亨廷顿病(Huntington’s disease)(HD)症状学的促成因素。降低的代谢长期以来与HD相关。最近的研究结果证明了由减少ATP产生的药物导致的HD的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)和果蝇(Drosophila)模型中降低的神经凋亡。已经报道，细胞外ATP通过刺激P2X7受体诱导神经死亡并且因此，P2X7-介导的钙渗透性的改变可以促进HD突触功能障碍和增加的神经凋亡。使用HD小鼠和细胞模型,证明了HD神经元的体部和末端中增加的P2X7-受体水平和改变的P2X7-介导的钙渗透性，并且向HD小鼠体内施用P2X7-拮抗剂BrilliantBlue-G(BBG)阻止了神经凋亡并且减弱了体重损失和运动协调缺陷。
总之,这些结果提升了P2X7R信号转导通路作为用于治疗各种神经变性疾病(包括AD和HD)的治疗靶点的可能性。
多发性硬化(Multiple sclerosis)(MS)是免疫原性的、复发的慢性炎性疾病。对于生物制剂，存在用作MS治疗剂的巨大可能。第一代细胞因子(IFN-γ-1a,IFN-γ-1b)和抗体(针对CD52,CD49d,CD25,CD20)在临床中既获得了有希望的结果也获得了令人失望的结果,但显然仍然存在对通过新作用机制靶向淋巴细胞来缓解炎症或靶向慢性活化的小神经胶质细胞和巨噬细胞的治疗剂的高度医疗需求。
尽管被很好证实,但离子通道代表了用于治疗MS的正在开发的靶点类型。针对离子通道的药物开发受阻，因为小分子抑制剂通常缺少特异性并且影响靶点的相关物并甚至影响无关蛋白。
P2X7受体表达在骨髓细胞以及CNS神经胶质细胞上,并且已经显示P2X7活化增加神经胶质细胞和T-细胞活化。这些性质提示在自身免疫病(包括MS)的发展中的作用。显示MS动物模型中P2X7缺陷(实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis)(EAE))导致代偿性变化，其导致增加的T-细胞细胞因子产生,并且P2X7裸鼠的脑中检测到活化的T-细胞而无临床体征。大大降低的疾病发生率提示，在这些小鼠中起始事件缺失并且指出星形胶质细胞的P2X7在EAE疾病发展中的作用。
Matute等人(J.Neuroscience 2007：27(35)：9525-9533)已经显示，在体外和体内增强的ATP信号转导导致通过P2X7受体-介导的Ca2+毒性的少突胶质细胞死亡，并且P2X7受体介导组织损伤，其引起与公认的MS模型相关的神经性缺损。相应地,在MS中损伤形成之前，轴突束中P2X7受体表达增加，提示该特征构成与此种疾病中新形成的损伤相关的风险因子。因此，阻断ATP P2X7受体具有有效的神经保护性性质,提示该机制可能用于停止MS中组织损伤的进程。
已经描述了P2X7特异性多克隆和单克隆抗体(Adriouch等人,2005"Probing theexpression and function of the P2X7 purinoceptor with antibodies raised bygenetic immunization"Cell Immunol 236：72-77；Seman等人2003.NAD-induced T celldeath：ADP-ribosylation of cell surface proteins by ART2 activates thecytolytic P2X7 purinoceptor.Immunity 19：571-582)。结果表明这些抗体是进一步表征P2X7的结构和功能的有用工具。美国专利申请号2010/0173799描述结合P2X7的纳米抗体。
发明概述
本发明提供具有与现有技术氨基酸序列和抗体相比，除了其它有利性质(诸如,例如,改善的制备容易度,良好的稳定性,和/或降低的商品成本)之外具有改善的预防,治疗和/或药学性质的多肽。
基于广泛的筛选,表征和组合策略,本发明人出人意料地观察到，包含识别类似表位的免疫球蛋白单可变结构域的多肽具有不同的交叉反应性和调节活性。此外,本发明提供包含两个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多价多肽，与现有技术中描述的P2X7中和分子相比，其显示改善的调节P2X7活性的性质。本发明人出人意料地发现，与其单价的结合P2X7的结构单元自身或现有技术单克隆抗体(mAb)L4的P2X7调节能力相比，包含两个结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域的双价多肽显示P2X7-调节功效的显著增加。此外,双价的,双特异性结合P2X7的结构单元显示改善的检测灵敏度。为此,本发明此外还提供很多高度有利的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域特异结合P2X7和/或能够显著调节,抑制或中和P2X7。完全出乎意料,本发明人鉴定了P2X7受体活性的激动剂。这些结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域和包含所述免疫球蛋白单可变结构域的多肽形成本发明的进一步的方面。
此外,本发明的多肽呈现出体内模型中炎症的显著降低。在实验性肾炎的啮齿类动物模型中，我们明确证明了用P2X7拮抗剂对抗体-介导的肾小球性肾炎(glomerulonephritis)的成功治疗(参见实施例3)。
如本文中进一步描述的,优选本发明的氨基酸序列是免疫球蛋白单可变结构域(“ISV’s”)。免疫球蛋白单可变结构域是这样的氨基酸序列，其：
-包含免疫球蛋白折叠或在合适条件下(诸如生理条件下)能够形成免疫球蛋白折叠(即,通过折叠),即,从而形成免疫球蛋白可变结构域(诸如,例如,VH,VL或VHH结构域)；和
-形成(或在此种合适条件下能够形成)包含功能性抗原结合活性的免疫球蛋白可变结构域(在这个意义上，其不需要与另一个免疫球蛋白可变结构域相互作用(诸如VH-VL相互作用)以形成功能性抗原结合位点)。
作为ISV’s的本发明的氨基酸序列在本文中也被称为“本发明的ISV’s”。从本文中的进一步描述，适用于本发明的免疫球蛋白单可变结构域的一些优选的实例将变得清楚的，并且例如包括VHH’s和/或(其它)纳米抗体(优选的),诸如人源化VHH's或骆驼源化(camelized)VH's,诸如骆驼源化人VH,dAb’s和(单)结构域抗体。
因此,本发明的ISV,多肽和组合物可以用于诊断,预防和治疗本发明的疾病和病症(在本文中也为“本发明的疾病和病症”)并且包括,但不限于以下疾病，诸如炎性肠病(imflammatory bowel disease)(IBD),类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis),骨关节炎(osteoarthritis),癌症,糖尿病(diabetes),肾炎(nephritis),神经病性疼痛(neuropathic pain),癫痫(epilepsy),神经变性疾病诸如AD和HD,MS和心血管疾病,包括卒中(stroke)和高血压(hypertension),局部缺血(ischemia),以及本文中描述的其它病症和疾病。尤其是,本发明的多肽和组合物可以用于诊断,预防和治疗疾病，所述疾病包括P2X7介导的病症,包括凋亡。
通常,所述“本发明的疾病和病症”可以被定义为可以通过向需要其的受试者(即,具有疾病或病症或其至少一种症状和/或处于引起或发展疾病或病症的风险)适当施用本发明的多肽或组合物(并且尤其是其药学活性量)和/或针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQID NO：1-3)及其同种型或P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型参与的生物学通路或机制起作用的已知活性物质(并且尤其是其药学活性量)分别诊断,预防和/或治疗的疾病和病症。
尤其是,本发明的ISVs和多肽可以用于诊断,预防和治疗本发明的疾病和病症，所述疾病和病症的特征为由ATP门控(gating)介导的过多的和/或不需要的P2X7(并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型)。基于本文中所公开的，本发明的此种疾病和病症的实例对于技术人员同样是清楚的。
因此,不限于此,本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以例如用于诊断,预防和/或治疗目前以可以调节P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型-介导的门控的活性物质被诊断,预防或治疗的所有疾病和病症,诸如上文中在疾病中提及的那些和引用的现有技术。还设想，本发明的多肽可以用于诊断,预防和/或治疗以此种活性物质的治疗目前正在被开发,已经被建议,或未来将被建议或开发所针对的所有疾病和病症。此外,设想由于如本文中进一步描述的其有利性质,本发明的多肽可以用于诊断,预防和治疗这些已知活性物质正在用于或将被建议或开发所针对的其它疾病和病症；和/或设想本发明的多肽可以提供治疗本文中描述的疾病和病症的新方法和方案。
从本文中的进一步公开，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽的其它应用和用途对于熟练技术人员将变得清楚的。
通常,本发明的一个目的是提供可以用于诊断,预防和/或治疗本发明的疾病和/或病症的药学活性剂,以及包含所述药学活性剂的组合物；和提供诊断,预防和/或治疗此种疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用此种药剂和组合物。
尤其是,本发明的目的是提供这样的药学活性剂,组合物和/或方法，所述药学活性剂,组合物和/或方法与目前使用的和/或本领域已知的药剂,组合物和/或方法相比，具有某些优点。从下文的进一步描述，这些优点将变得清楚。
更特别的是,本发明的目的是提供治疗性蛋白，所述蛋白可以用作药学活性剂,以及包含所述药学活性剂的组合物,其用于诊断,预防和/或治疗本发明的疾病和/或病症和本文中提到的进一步的疾病和病症；并且提供诊断,预防和/或治疗此种疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用此种治疗性蛋白和组合物。
因此,本发明的特定目的是提供免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域针对P2X7,尤其是针对来自温血动物的P2X7,更特别是针对来自哺乳动物诸如例如,小鼠的P2X7,并且特别是针对人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型(isoform)；并且提供蛋白和多肽，所述蛋白和多肽包含至少一个此种免疫球蛋白单可变结构域或基本上由至少一个此种免疫球蛋白单可变结构域组成。
尤其是,本发明的特定目的是提供这样的免疫球蛋白单可变结构域和这样的蛋白和/或多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域和蛋白和/或多肽适于温血动物,并且尤其是哺乳动物,并且更特别是人类中的预防,治疗和/或诊断用途。
更特别是,本发明的特定目的是提供这样的免疫球蛋白单可变结构域和这样的蛋白和/或多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域和蛋白和/或多肽可以用于预防,治疗,缓解和/或诊断温血动物,尤其是哺乳动物,并且更特别是人类中一种或多种与P2X7相关和/或由P2X7介导的疾病,病症或病状(诸如本文中提及的疾病,病症和病状)。
另外，本发明的特定目的是提供这样的免疫球蛋白单可变结构域和这样的蛋白和/或多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域和蛋白和/或多肽可以用于制备预防和/或治疗温血动物,尤其是哺乳动物,并且更特别是人类中的一种或多种与P2X7相关和/或由P2X7介导的疾病,病症或病状(诸如本文中提及的疾病,病症和病状)的药物或兽药组合物。
在本发明中,通常,这些目的通过使用本文中描述的免疫球蛋白单可变结构域,蛋白,多肽和组合物实现。
通常,本发明提供针对(如本文中定义的)和/或可以特异结合(如本文中定义的)P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域；以及包含至少一个此种氨基酸序列或免疫球蛋白单可变结构域的化合物和构建体,并且尤其是蛋白和多肽。
更特别是,本发明提供免疫球蛋白单可变结构域和多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽能够以亲和力(适当测量和/或表达为KD-值(实际的或表观的),KA-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,以及提供化合物和构建体,并且尤其是蛋白和多肽,所述化合物和构建体,并且尤其是蛋白和多肽包含至少一个此种氨基酸序列或免疫球蛋白单可变结构域。
同样,能够结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域和多肽能够以生物效力表征,所述生物效力被适当测量和/或表达为IC50值,如在本文中进一步描述和定义的,例如,诸如通过
Figure BDA0000663918210000081
测量和/或表达的；以及化合物和构建体,并且尤其是蛋白和多肽,所述化合物和构建体,并且尤其是蛋白和多肽包含至少一个此种氨基酸序列或免疫球蛋白单可变结构域。
在特别的方面,本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽是这样的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，它们以Alphascreen测定中100nM或更低,诸如50nM或更低,更优选30nM或更低,甚至更优选20nM或更低,最优选10nM或更低,诸如5nM的IC50结合人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型。
将理解，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽对(人)P2X7的结合可以导致本文中描述的抑制细胞外ATP对P2X7的活性或从(人)P2X7移去ATP。还将理解，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽对(人)P2X7的结合可以导致抑制诸如本文中描述的门控。
可以根据涉及的特定疾病或病症，使用本身已知的合适的任意体外测定,基于细胞的测定,体内测定和/或动物模型,或其任意组合,测试本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽,和包含所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽的组合物的功效。合适的测定和动物模型对于熟练技术人员将清楚的,并且例如包括用于下文实验部分和本文中引用的现有技术的测定和动物模型。
从本文中的进一步描述和实施例，本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的结合,替代或其它体内和/或体外效力的一些优选的技术值将变得清楚的。
为了结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,本发明的氨基酸序列将通常在其氨基酸序列内含有一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基片段(即,各个“片段”包含彼此相邻或彼此紧挨的两个或多个氨基酸残基,即，在氨基酸序列的一级和三级结构中)，通过所述一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基片段，本发明的氨基酸序列能够结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,所述氨基酸残基或氨基酸残基片段从而形成结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的“位点”(在本文中也称为“抗原结合位点”)。
通常,当本发明的氨基酸序列(或包含所述氨基酸序列的化合物,构建体或多肽)要施用于受试者时(例如用于本文中描述的治疗和/或诊断目的),优选其为在所述受试者中不天然存在的氨基酸序列；或,当其在所述受试者中天然存在时,其为基本上分离的形式(如本文中定义的)。
对于熟练技术人员还将清楚的是，对于药物用途,本发明的免疫球蛋白单可变结构域(以及包含所述免疫球蛋白单可变结构域的化合物,构建体和多肽)优选针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型；然而对于兽药目的,本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽优选针对来自要治疗的物种的P2X7,或至少与来自要治疗的物种的P2X7交叉反应。
同样,根据本发明,针对来自第一温血动物物种的P2X7的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以显示或可以不显示与一个或多个其它温血动物物种的P2X7的交叉反应性。例如,针对人P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以显示或可以不显示与来自一个或多个其它灵长类物种(诸如,不限于,来自猕猴(Macaca)属的猴(诸如,并且尤其是,食蟹猴(cynomolgus monkeys)(Macacafascicularis)和/或猕猴(rhesus monkeys)(Macaca mulatta))和狒狒(baboon)(Papioursinus))的P2X7和/或与来自一个或多个常用于疾病动物模型的动物物种(例如小鼠,大鼠,兔,猪或狗),和尤其是用于与P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型相关的疾病和病症的动物模型(诸如本文中提到的物种和动物模型)的动物物种的P2X7的交叉反应性。在这方面,对于熟练技术人员将清楚的是，此种交叉反应性,当存在时,从药物开发观点的角度可以具有优势,因为其允许针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域和多肽在此种疾病模型中被测试。
更通常地,与来自多种哺乳动物物种的P2X7交叉反应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽通常将在兽药应用的用途中是有利的,因为它将允许相同氨基酸序列或多肽跨多个物种被使用。因此,还包括在本发明的范围内的是针对来自一个动物物种的P2X7的免疫球蛋白单可变结构域和多肽(诸如针对人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域和多肽)可以用于治疗另一个动物物种,只要免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽的使用在要治疗的物种中提供所需效果。
本发明在其最广泛的意义中，同样不特别限制于或受限于本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽所针对的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的特定抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象(在适用的情况下)。例如,所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以针对或可以不针对ATP/P2X7相互作用位点,并且如本文中进一步定义的。
如本文中进一步描述的,本发明的多肽可以含有两个或多个本发明的针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域。通常,此种多肽将以与本发明的单个氨基酸序列相比增加的亲合力(avidity)结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型。此种多肽可以例如包含两个本发明的针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的相同抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象(在适用的情况下)的免疫球蛋白单可变结构域(其可以是或可以不是相互作用位点)；或包含至少一个本发明的针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象(在适用的情况下)的“第一”氨基酸序列(其可以是或可以不是相互作用位点)；和至少一个本发明的针对不同于第一个的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象(在适用的情况下)的“第二”氨基酸序列(并且其同样可以是或可以不是相互作用位点)。优选地,在本发明的此种“双互补位(biparatopic)”多肽中,至少一个本发明的氨基酸序列针对相互作用位点(如本文中定义的),尽管本发明在其最广的意义上不限于此。例如,本发明的多肽可以例如以双互补位的方式配制以诸如将针对如在实验部分表征的不同表位的单价结构单元组合。
同样,当所述靶点是结合对(例如,受体-配体结合对)的部分时,所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以是这样的，它们与同源的结合伙伴(例如用于结合P2X7的ATP)竞争,和/或是这样的，它们(完全或部分)中和结合伙伴对靶点的结合。
还预期的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽将通常结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的所有天然存在的或合成的类似物,变体,突变体,等位基因,部分和片段；或至少结合含有一个或多个与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的抗原决定簇或表位基本上相同的抗原决定簇或表位的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的那些类似物,变体,突变体,等位基因,部分和片段。同样,在此种情况下,本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽能够以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域结合(野生型)P2X7的亲和力和特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合此种类似物,变体,突变体,等位基因,部分和片段。
因为P2X7受体可能以多聚体形式,例如,三聚体,并特别是同源三聚体形式行使功能,因此在本发明范围内的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽i)仅结合单体形式的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,ii)仅结合多聚体/三聚体形式的P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,或iii)既结合单体形式又结合多聚体形式。在本发明优选的方面,本发明的多肽阻止(同源)三聚体人P2X7复合体的形成。
同样,如对于熟练技术人员将清楚的,含有两个或多个针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽,例如,本发明的“双互补位”多肽,能够以比相应单体氨基酸序列更高的亲合力结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型。例如,并且无限制,含有两个或多个针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的不同表位的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽可以(并且通常将)比各个不同单体更高的亲合力结合,并且含有两个或多个针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽可以(并且通常将)也以更高亲合力结合P2X7的多聚体(例如，(同源)三聚体)并且尤其是结合人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的多聚体(例如，(同源)三聚体)。
通常,本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽将至少结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的从生物学和/或治疗观点的角度最相关的那些形式(包括单体的,多聚体的,相关的或不同的构型),如对于熟练技术人员将清楚的。
还在本发明范围内的是，使用本发明免疫球蛋白单可变结构域和多肽的部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因和/或衍生物,和/或使用包含一个或多个此种部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因和/或衍生物或基本上由一个或多个此种部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因和/或衍生物组成的蛋白或多肽,只要这些适于本文中设想的用途。此种部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因和/或衍生物将通常含有用于结合针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型的(至少部分)功能性抗原结合位点；并且更优选地将能够特异结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,并且甚至更优选能够以如本文中定义的(例如,在实验部分)与如本文中进一步描述的结合,门控(gating),脱落(shedding)和/或其它测量相关的EC50值,平均Ki,IC50值结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)或其同种型,并且此种部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因和/或衍生物可以更具效力,更稳定,更可溶并且可以具有相同表位。从本文中进一步描述，此种部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因,衍生物,蛋白和/或多肽的一些非限制实例将变得清楚的。本发明的另外的片段或多肽还可以通过适当组合(即,通过连接或基因融合)一个或多个(更小的)本文中描述的部分或片段提供。
本发明优选的多互补位(multiparatopic)(诸如双互补位)多肽包含两个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两个或多个免疫球蛋白单可变结构域组成，其中,在至少一个所述免疫球蛋白单可变结构域中,所述CDR序列与至少一个具有SEQ ID NO’s：6-19的免疫球蛋白单可变结构域的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性,优选地至少80％氨基酸同一性,更优选至少90％氨基酸同一性,诸如95％氨基酸同一性或更多,或甚至基本上100％氨基酸同一性(表B-3)。
在优选的方面,本发明的多互补位(诸如双互补位)多肽包含两个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两个或多个免疫球蛋白单可变结构域组成,其中至少一个所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断P2X7对至少一个具有SEQ ID NO’s：6-19的免疫球蛋白单可变结构域的结合和/或对P2X7的结合被至少一个具有SEQ ID NO’s：6-19的免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
在本发明优选的方面,本发明的多互补位(诸如双互补位)多肽包含两个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两个或多个免疫球蛋白单可变结构域组成,其中第一免疫球蛋白单可变结构域选自SEQ ID NO’s：6-19并且第二免疫球蛋白单可变结构域选自SEQID NO’s：6-19,其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域和第二免疫球蛋白单可变结构域可以相同或不同。
在优选的方面,本发明的多互补位(诸如双互补位)多肽的两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域各自属于不同的表位箱(bin)或家族。因此,本发明涉及包含两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽,其中所述两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域各自属于不同表位箱。属于不同表位箱的免疫球蛋白单可变结构域优选不彼此交叉竞争结合靶点,P2X7。因此,本发明涉及包含两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽,其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域不交叉阻断P2X7对第二免疫球蛋白单可变结构域的结合和/或其中所述第一免疫球蛋白单可变结构与P2X7的结合不被第二免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断。
优选地,本发明的多肽选自SEQ ID NOs：118-124的任一个。
本发明的多价的,诸如多互补位,多肽可以通常通过适当连接(任选地通过合适的接头)或组合两个或多个(单价)免疫球蛋白单可变结构域(或通过适当连接或组合编码此种(单价)免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列以提供编码所需多价构建体的核酸,并随后适当表达所述多价构建体)提供(并且尤其是,有目的地针对特定生物学作用设计)。因此,显然本发明不仅提供本文中描述的多价的,优选多互补位多肽,而且提供–通过提供本文中描述的单价多肽–给熟练技术人员一系列可以用作“结构单元”的不同“结合结构域”或“结合单元”，从而通过使用本文中描述的合适的“结构单元”提供一系列不同的多价的,优选多互补位(并且尤其是双互补位)多肽(其可以具有不同结合亲和力,亲合力(avidity),特异性,效力和/或功效)。
本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以通过Fc-尾偶联,如本领域中已知的,例如,在实施例1.3中详述的。例如,可以将ISV的编码序列与IgG1-Fc("Nb-Fc")的编码序列符合阅读框地(in frame)融合,克隆入表达载体并表达(参见例如,Scheuplein等人2010"Arecombinant heavy chain antibody approach blocks ART2 mediated deletion of aniNKT cell population that upon activation inhibits autoimmune diabetes"J.Autoimmun 34：145-54)。可以将个体Nb-Fc's混合,形成同源二聚体和/或异源二聚体。备选地,两种Nb-Fc's-优选地两种不同Nb-Fc's-可以被克隆入一个表达载体并被表达。
本发明的各种免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(和/或编码所述各种免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽的核苷酸序列和/或核酸)及其作为在多价和/或多互补位多肽(或编码所述多价和/或多互补位多肽的核苷酸序列/核酸)的制备中或用于制备多价和/或多互补位多肽(或编码所述多价和/或多互补位多肽的核苷酸序列/核酸)的“结构单元”的用途形成本发明的一个方面。
本发明的单价多肽可以基本上由选自轻链可变结构域序列(例如,VL-序列)和重链可变结构域序列(例如,VH-序列)的免疫球蛋白单可变结构域组成。本发明的单价多肽可以基本上由选自源自常规四链抗体的重链可变结构域序列和源自重链抗体的重链可变结构域序列的免疫球蛋白单可变结构域组成。本发明的单价多肽可以基本上由选自结构域抗体(或适于用作结构域抗体的氨基酸),单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的氨基酸),"dAb"(或适于用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(包括但不限于VHH)的免疫球蛋白单可变结构域组成。在优选的方面,本发明的单价多肽基本上由部分或完全人源化纳米抗体,诸如部分或完全人源化VHH组成。
如上文描述的,本发明还涉及本文中描述的单价多肽在制备本发明多价的,优选多互补位多肽的用途。因此,本发明涉及本发明的单价多肽作为结合结构域或结合单元在制备本发明的多价多肽中的用途。
本发明还涉及包含以下或基本上由以下组成的多肽(在本文中也称为“本发明的多肽”)：本发明的一个或多个单价多肽或一个或多个多价,优选多互补位,多肽,并且任选地还包含一个或多个任选地通过一个或多个肽接头连接的其它基团,残基,部分或结合单元。如对于熟练技术人员从本文中进一步公开的内容将变得清楚的,此种进一步的基团,残基,部分,结合单元或氨基酸序列可以不或可以向本发明的单价或多价,优选多互补位,多肽提供进一步的功能性并且可以改变或可以不改变本发明的单价或多价多肽的性质。
本发明还涉及编码本发明的多肽的核酸或核苷酸序列。此种核酸将也被称为“本发明的核酸”并且可以例如是基因构建体形式,如本文中进一步描述的。因此,本发明还涉及基因构建体形式的核酸或核苷酸序列。
可以将编码本发明的单价多肽的核酸连接以获得编码本发明的多价,优选多互补位多肽的核酸。因此,本发明还涉及编码本发明单价多肽的核酸或核苷酸序列用于制备编码本发明的多价,优选多互补位多肽的基因构建体的用途。
本发明还涉及宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达(或在合适的环境下能够表达)本发明的多肽；和/或含有本发明的核酸。从本文中进一步的说明，此种宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性实例将变得清楚的。
本发明还涉及组合物，所述组合物含有或包含至少一种本发明的多肽和/或至少一种本发明的核酸,和任选地本身已知的此种组合物的一个或多个进一步组分(即,根据组合物的意欲用途)。此种组合物可以例如是药物组合物(如本文中描述的)或兽药组合物。从本文中进一步的说明，此种组合物的一些优选但非限制性实例将变得清楚的。
本发明还涉及制备本文中描述的多肽,核酸,宿主细胞,和组合物的方法。
尤其是,本发明涉及：
(I)免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域能够以小于50nM的Kd结合P2X7,优选人P2X7(SEQ ID NO：1-3)。
(II)根据(I)所述的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区(FRs)；并且
-其中CDR1选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：34-47,
-与SEQ ID NOs：34-47具有至少80％氨基酸同一性的多肽,和
-与SEQ ID NOs：34-47具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽；和
-其中CDR2选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：62-75；
-与SEQ ID NOs：62-75具有至少80％氨基酸同一性的多肽；和
-与SEQ ID NOs：62-75具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽；和
-其中CDR3选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：90-103；
-与至少一个SEQ ID NOs：90-103的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80％氨基酸同一性的多肽；和
-与SEQ ID NOs：90-103具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽。
(III)根据(II)所述的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述构架区(FRs)与SEQ IDNOs：6-19的FRs具有大于80％的序列同一性。
(IV)根据(I)所述的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；其中CDR1是SEQ ID NO：34,其中CDR2是SEQ ID NO：62；并且其中CDR3是SEQ ID NO：90。
(V)根据权利要求(I)所述的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；其中CDR1是SEQ ID NO：35,其中CDR2是SEQ ID NO：63；并且其中CDR3是SEQ ID NO：91。
(VI)根据(I)所述的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；其中CDR1是SEQ ID NO：40,其中CDR2是SEQ ID NO：68；并且其中CDR3是SEQ ID NO：96。
(VII)多肽，所述多肽包含根据(I)-(VI)任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
(VIII)根据(VII)所述的多肽,其中所述多肽选自由与SEQ ID NOs：6-19具有大于80％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组。
(IX)根据(VII)或(VIII)所述的多肽,其中所述多肽选自由与SEQ ID NOs：6-19具有大于80％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组。
(X)根据(VII)-(IX)任一项所述的多肽,所述多肽另外包含结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，诸如例如,Alb8(SEQ ID NO：126)或Alb11(SEQ ID NO：125)。
(XI)根据(I)-(VI)任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据(VII)-(X)任一项所述的多肽,其中Alphascreen测定中的IC50为30nM或更低。
(XII)根据(I)-(VI)任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据(VII)-(X)任一项所述的多肽,其中Alphascreen测定中IC50为3nM或更低。
(XIII)核酸序列，所述核酸序列编码i)根据(I)-(VI),(XI),或(XII)任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域,或ii)根据(VII)-(X)任一项所述的多肽。
(XIV)药物组合物，所述药物组合物包含i)根据(I)-(VI),(XI),或(XII)任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域,或ii)根据(VII)-(X)任一项所述的多肽；和任选地药用赋形剂。
(XV)根据(I)-(VI),(XI),或(XII)任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域,或根据(VII)-(X)任一项所述的多肽,所述免疫球蛋白单可变结构域或多肽用于治疗P2X7相关疾病,包括但不限于MS,IBD,神经病性疼痛(neuropathic pain),癫痫(epilepsy),卒中(stroke),糖尿病(diabetes),高血压(hypertension)和癌症。
(XVI)生产根据(I)-(VI),(XI),或(XII)任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域,或根据(VII)-(X)任一项所述的多肽的方法,所述方法至少包括以下步骤：
a)在合适的宿主细胞或宿主生物或在另一个合适的表达系统中表达根据(XIII)的核酸或核苷酸序列；任选地接着：
b)分离和/或纯化所述免疫球蛋白单可变结构域或所述多肽。
(XVII)筛选针对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NOs：1-3)的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)提供免疫球蛋白单可变结构域的组(set)、集合(collection)或文库；和
b)从所述免疫球蛋白单可变结构域的组(set)、集合(collection)或文库筛选能够结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NOs：1-3)和/或对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ IDNOs：1-3)具有亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；和
c)分离能够结合P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)和/或对P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)具有亲和力的氨基酸序列。
(XVIII)免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域能够以小于50nM的Kd结合P2X7,其中所述免疫球蛋白单可变结构域对所述P2X7的结合抑制P2X7的活性。
从本文中的进一步描述，本发明的其它方面,实施方案,优势和应用将变得清楚的。贯穿本说明书文本始终，一些文件被引用。本文中引用的各个文件(包括所有专利,专利申请,科学出版物,制造商说明书,使用说明等),不论在前或在后,在此通过引用以其整体并入。本文中没有任何之处将被解释为承认本发明不能通过先发明而早于这些公开内容。
附图简述
图1.免疫方案和样品制备并且对于美洲驼(llamas)405和418。
(A,B)免疫方案的原理图和P2X7 cDNA表达载体。以DNA-引发(prime)>蛋白加强(boost)策略(Koch-Nolte等人,2007 FASEB J.21,3490–3498)免疫美洲驼。4次冲击式DNA免疫之后,用mP2X7和hP2X7稳定转染的HEK细胞和吸附在珠子上的重组mP2X7加强免疫动物。将mP2X7和hP2X7的cDNA构建体混合物吸附在1μm金颗粒上。美洲驼接受12次注射，每次1μg DNA/mg金/免疫,以稳定表达mP2X7(2x 107,用1mM ATP预处理15min)或hP2X7(3x 107)的HEK细胞加强,和固定在AminoLink琼脂糖珠子(Pierce)(5μg/50μl珠子)的HANO43和HANO44免疫沉淀的小鼠P2X7最后加强。从在免疫的各个阶段结束时收集的血样产生噬菌体文库(PBL 1-6)。
(C)FACS分析用于以Alexa647-缀合的mAbs HANO44(抗-mP2X7)(
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等人2007Purinergic Signalling DOI 10.1007/s11302-007-9084-9)和L4(抗-hP2X7)(Buell等人1998 Blood,92 pp 3521-3528)免疫的稳定转染的HEK细胞上的P2X7表达水平。以相同抗体染色的未转染的细胞用作对照(灰色直方图)。
(D)珠子结合的用于免疫的重组mP2X7的SDS-PAGE分析(IP,泳道4)。使用固定在琼脂糖珠子(氨基-连接,Pierce)上的mAb HANO44(基质,泳道5,对照IP仅有珠子)，从稳定转染有mP2X7的HEK细胞的裂解产物(裂解产物,泳道1)免疫沉淀mP2X7(80kd,红色箭头)。
图2.为P2X7结合选择的Nbs的FACS分析。
将来自第一次(A)和第二次(B)选择的带有Nbs的粗周质裂解产物与FITC-缀合的抗-myc抗体预孵育并且加入未转染的HEK细胞和HEK_hP2X7细胞的混合物。清洗细胞并且通过流式细胞术(FACS Calibur)收集数据。阳性克隆显示双峰染色(描绘来自wt细胞的P2X7阳性细胞)，而阴性克隆显示单峰。灰色直方图显示未染色对照细胞。
图3.抗-hP2X7 Nbs的特异性的FACS分析。
将HEK细胞用mP2X7,rP2X7,或hP2X7之一和GFP的表达构建体共转染。转染24h后，通过温和的胰蛋白酶消化收获细胞并与标示在顶部的Nb-Fc融合蛋白或mAb L4孵育。用Alexa647-缀合的抗-小鼠IgG检测结合的抗体。用于对照,将未转染的HEK细胞(wt)进行相同的染色步骤。
图4.抗-hP2X7 Nbs的交叉阻断分析。
将稳定转染有hP2X7的5x 105HEK细胞与3μg各个未缀合的抗体在95μl完全DMEM中在室温孵育15min。不清洗,将1μl(～250ng)的Alexa Fluor 647-缀合的1c113-Fc,3c23-Fc或mAb L4加入并且在4℃继续孵育20min。清洗细胞并通过流式细胞术(FACS Calibur,BD)分析。MFI,平均荧光强度。用于染色的Nb-Fc或mAb的Alexa 647-缀合物在图下方标示,用于阻断的Nb-Fc和mAb在右上标示。(载体＝无阻断Abs的培养基)。
图5.hP2X7-特异的Nbs 1c113-Fc和3c23-Fc的组合对原代白细胞上P2X7的改善的染色。
(A)将来自单一供体的100μl血液等分试样与各3μg的1c113-Fc和3c23-Fc("封闭的")的组合预孵育。将平行等分试样仅与3μg的1067-Fc("未封闭的")孵育。在室温30-min的孵育后,加入缀合抗体的混合物(mastermix)：1c113-Fc Alexa647(～250ng)；3c23-FcAlexa647(～250ng)；和抗-CD4 Pacific Blue。将细胞在冰上孵育30min用于抗体染色。通过用2ml 1x BD裂解液的10min室温孵育将红细胞裂解。将细胞用3ml完全RPMI 5％FCS清洗一次并通过流式细胞术(FACS CantoII,BD)分析。基于低前向散射(low forward scatter)(FSC)相对侧向散射(SSC)(箭头)将淋巴细胞门控。黑色数字表示细胞在各自象限中的百分数。左和右MFI值分别表示CD4-和CD4+淋巴细胞的平均荧光强度。
(B)来自三个不同供体的PBL的FACS分析如在(A)中,以另外的抗-CD8 Alexa488染色mAb进行。粒细胞,单核细胞,和淋巴细胞的门控基于所指出的FSC和SSC。CD4+T细胞,CD8+T细胞和CD4-/CD8-淋巴细胞的门控基于CD4和CD8的细胞表面染色。P2X7的表达以连锁表示显示。与未染色的阻断和非阻断Nb-Fc的预孵育分别由(+)和(-)在图下方表示。
图6.Nbs 1c81和3c23阻断转染的HEK细胞中ATP-诱导的CD62L的脱落。
(A)将HEK细胞仅用CD62L的cDNA构建体转染,或用CD62L和hP2X7的构建体共转染。转染24h后,收获细胞并且通过将细胞与4mM ATP在完全DMEM培养基中在37℃孵育60min诱导CD62L的脱落。
(B)在ATP剂量应答测定中,将P2X7和CD62L共转染的细胞与0.25,1,2或4mM ATP在37℃孵育60min。将细胞等分试样与2μg的Nb-Fc融合蛋白1c81-Fc或3c23-Fc或与对照Nb-Fc(抗-hCD38 1067-Fc)在室温预孵育15min，之后与2mM或4mM ATP孵育60-min。将细胞用150μl的完全培养基清洗并在4℃染色30min以检测CD62L(MEL-14 PE)和P2X7(L4 AF647)表达。进一步清洗后,通过流式细胞术(FACS Calibur,BD)分析细胞。
图7.Nbs 3c23和1c81阻断转染的HEK细胞中ATP-诱导的CD62L脱落。
将HEK细胞与GFP,CD62L和hP2X7的cDNA构建体共转染。转染后24h,收获细胞并与以1：3稀释梯级滴定的指出的Nbs在80μl DMEM培养基中于RT预孵育15min。最高和最低Nb浓度为2.8μg/ml和4ng/ml。添加ATP至4mM的终浓度。将细胞在37℃孵育60min并随后在流式细胞术之前对CD62L染色。在门控GFP+细胞之后计算CD62L细胞表面染色的平均荧光强度(MFI)。在半数最大CD62L MFI(以红色虚线标记)计算IC50值(参见表3)。
图8.纳米抗体1c81和3c23阻止由RPMI 8226细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸外化(externalization)。
(A)通过如图5中以Alexa647-缀合的1c113-Fc和3c23-Fc的混合物染色2x105细胞检测RPMI 8226细胞上P2X7表达。灰色直方图＝与过量未缀合1c113-Fc和3c23-Fc预孵育的细胞,空心直方图＝与过量对照1067-Fc预孵育的细胞。
(B)将细胞与所示浓度的ATP在37℃孵育60min，之后用APC-缀合的膜联蛋白V对PS染色。
(C).将RPMI 8226细胞与0.5μg的1067-Fc,1c113-Fc,1c81-Fc,3c23-Fc或mAb L4在室温预孵育15min,之后加入ATP至0(对照)或4mM的终浓度。进一步将细胞在37℃孵育60min并用膜联蛋白V染色缓冲液清洗一次，之后用APC-缀合的膜联蛋白V染色。通过流式细胞术(FACS Canto II,BD)分析细胞。
图9.Nbs 1c81和3c23阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡。
将RPMI 8226细胞(150μl培养基中的5x105个细胞)与900ng的各个Fc融合蛋白或mAb L4在室温预孵育10min。加入150μl ATP的4mM储液至ATP终浓度为2mM(1：2稀释)和抗体终浓度为3μg/ml。将细胞在37℃孵育60min或24h,在膜联蛋白V染色缓冲液中清洗一次并以APC-缀合的膜联蛋白V对磷脂酰丝氨酸进行暴露染色和以碘化丙锭对细胞死亡染色。通过流式细胞术(FACS Canto II,BD)进行数据收集。
图10.Nbs 1c81和3c23阻断由人T细胞产生的ATP-诱导的PS外化和CD62L脱落。
将来自3个供体的100μl全血等分试样与0.5μg的1067-Fc,1c113-Fc,1c81-Fc,3c23-Fc或1μg的mAb L4在RT预孵育30-min,之后加入100μl培养基(未处理的对照)或完全培养基中的8mM ATP储液。将细胞在37℃孵育30min,用膜联蛋白V染色缓冲液清洗一次,并用抗-CD62L FITC,膜联蛋白V-APC,抗-CD4 APC/Cy7,和抗-CD8 Pacific Blue的混合物在RT染色60min。通过在2ml 1x BD裂解液中的10min孵育裂解红细胞。将细胞用1.5ml膜联蛋白V染色缓冲液清洗一次并通过流式细胞术(FACS CantoII,BD)分析。如图5中基于低FSC和SSC顺序门控CD4+和CD8+T细胞，并对CD4和CD8染色。血样来自与图5中分析的那些相同的供体。
图11.由全身注射的HLE-Nbs导致的P2X7体内阻断/增强的动力学分析
(A)在静脉内注射半衰期延长的Nbs(对P2X7和白蛋白双特异性的)13A7-13A7-Alb8(20μg),14D5-14D5-Alb8(100μg),或对照Nb(100μg)之后2h和24h制备脾细胞和肝细胞。将细胞用针对CD3,CD4,CD25,和NK1.1的抗体共染色并通过流式细胞术分析。以FlowJo软件计算Tregs(CD4+细胞的百分比)和iNKT细胞(CD3+细胞的百分比)的频率。**P<0.01,***P<0.001(双尾Student’s t-检验)。
(B)通过用抗-CD27共染色接着用25μM NAD+,或溶剂(sol)在活体外处理细胞，监测CD27的脱落(脾：对CD4+细胞门控；肝：对CD3+细胞门控)。
(C)在注射半衰期延长的Nbs 13A7-13A7-Alb8,8G11-8G11-Alb8,或对照Nb(200μg静脉注射)之后2h制备细胞并如在(a,b)中染色。与膜联蛋白V共染色接着用250μM ATP,25μM NAD+,或溶剂(sol)在活体外处理细胞，监测磷脂酰丝氨酸的外化(脾：对CD4+细胞门控；肝：对CD3+细胞门控)。
图12.全身施用Nb 13A7缓解,施用Nb 14D5加强抗体-诱导的肾小球性肾炎(glomerulo nephritis)中的疾病参数。
抗体-诱导的肾炎模型中治疗的时间过程。将6周龄C57BL6小鼠组(n＝6)静脉注射以半衰期延长的Nbs 13A7-13A7-Alb8,14D5-14D5-Alb8,或对照Nb(50μg)2h，之后注射抗-足细胞(AP)或免疫前(PI)血清。小鼠每3天接受另外的Nbs注射(25μg)。最后一次Nb注射后三天,处死小鼠并且将肾和血清进行进一步分析。
(A)尿中的白蛋白通过ELISA定量,肌酸酐水平通过自动测量确定。
(B)处死当天,血液尿素氮,血清甘油三酯和血清胆固醇水平通过自动测量确定；血清中的IL-6和尿中MCP-1由ELISA定量。以Mann Whitney U检验评价显著性。
(C)将脾细胞在缺少(PBS)或存在NAD+的情况下孵育30min并随后对CD4,CD25,和CD27染色，之后FACS分析。对CD4+CD25+Tregs进行门控。用P2X7激动性Nb 14D5处理的小鼠的Tregs含有更低比例的CD27+T细胞,其所有都对NAD+-诱导的CD27损失敏感；来自用P2X7拮抗性Nb 13A7处理的小鼠的Tregs抵抗NAD+-诱导的CD27脱落。
(D)将肾切片用PAS染色(顶部)。肾小管蛋白管型由星号标出。
(E)将肾切片用DNA-染色染料draq5(针对T细胞标志物CD3的荧光染料-缀合的mAb),和针对nephrin(在肾脏滤过屏障处的足细胞膜蛋白)的荧光染料-缀合的mAb染色(底部)。足细胞核由星号标出。与用Nb 13A7或对照Nb处理的小鼠相比，来自用Nb 14D5处理的小鼠的肾切片显示CD3+ T细胞更强的球旁浸润和对nephrin的扰乱的染色。
(F)在免疫荧光显微术之前，将肾切片用draq5和针对nephrin的荧光染料缀合的mAbs,补体因子3(C3),和IgG染色。来自用AP血清处理的小鼠(但不来自用PI血清处理的小鼠)的切片显示IgG和3的肾小球沉积。IgG沉积的模式在用Nb 13A7处理的小鼠中有规律,但在用对照Nb处理的小鼠中被部分打乱并且在用Nb 14D5处理的小鼠中被强烈打乱。
图13.Nbs 13A7和14D5的Nb-Fc融合蛋白检测来自淋巴节,脾和肝的淋巴细胞上的P2X7
将来自野生型和P2X7-/-小鼠的淋巴节,脾或肝的淋巴细胞与荧光染料-缀合的小鼠P2X7-特异的13A7-Fc,14D5-Fc或人P2X7-特异的3c23-Fc(阴性对照)和与针对CD4,CD25,和NK1.1的抗体共染色，之后进行流式细胞术。
图14.Nb 3c23阻止人RPMI 8226淋巴瘤细胞中ATP-诱导的钙流入
将RPMI 8226细胞加载以Ca2+指示剂Fluo-4。进行实时流式细胞术分析(BD FACSCanto)。在存在(溶剂)或缺少人P2X7-特异的Nb 3c23-3c23或小鼠P2X7-特异的Nb 13A7-13A7(阴性对照)的情况下将细胞清洗并重悬于补充有Ca2+和Mg2+的PBS(Invitrogen)并通过流式细胞术(BD FACS-Canto)分析。红外线灯用于维持37℃的恒定样品温度。平衡100sec之后,加入ATP至终浓度为2mM并持续孵育100sec，之后加入离子霉素至终浓度为5μM。
图15.Nb 3c23阻断ATP-诱导的IL-1β从人血细胞的释放。
在缺少或存在Nb 3c23-3c23的情况下将来自四个供体的肝素化全血等分试样与LPS(1μg/ml)孵育2h，之后加入ATP至终浓度为5mM并进一步在37℃孵育1h。通过离心样品制备血浆并且血浆中IL-1β水平由ELISA(R&D Systems)确定。***P<0.001(单因素ANOVA)。
图16.Nb 3c23阻断ATP-诱导的IL-1β从人血细胞的释放的剂量应答分析。
在缺少或存在所示浓度的Nb 3c23,3c23-3c23,和3c23Fc的情况下将肝素化全血等分试样与LPS(1μg/ml)孵育2h，之后加入ATP至终浓度为2mM并且在37℃进一步孵育1h。通过离心细胞制备血浆并且通过ELISA(R&D Systems)确定血浆中IL-1β水平。小鼠P2X7-特异的Nb 13A7用作阴性对照。
图17.Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强稳定转染有小鼠P2X7的HEK细胞中ATP-诱导的钙流入
加载有Ca2+指示剂Fluo-4的小鼠-P2X7转染的HEK细胞在以1μg/ml Nb的浓度存在小鼠P2X7-特异的Nb 14D5-14D5,Nb 13A7-13A7或人P2X7-特异的Nb 3c23-3c23(阴性对照)的情况下进行实时流式细胞术分析。平衡60sec之后,将细胞暴露于细胞外ATP至终浓度为250μM或1mM并且,两分钟之后,暴露于5μM浓度的Ca2+离子载体离子霉素。红外线灯用于维持37℃的恒定样品温度。
图18.Nb 13A7反转,Nb 14D5诱导和加强稳定转染有小鼠P2X7的HEK细胞中ATP-介导的钙流入
加载有Ca2+指示剂Fluo-4的小鼠-P2X7转染的HEK细胞的实时流式细胞术分析。平衡60sec之后,将细胞与所示浓度的ATP孵育两分钟，之后用小鼠P2X7-特异的Nb 14D5-14D5,Nb 13A7-13A7或人P2X7-特异的Nb 3c23-3c23处理至终浓度为2μg/ml Nb。红外线灯用于维持37℃的恒定样品温度.
图19.Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强小鼠腹膜巨噬细胞中ATP-诱导的钙流入
将小鼠腹膜巨噬细胞加载以Ca2+指示剂Fluo-4。进行实时流式细胞术分析(BDFACS Canto)。清洗细胞并在缺少(溶剂)或存在P2X7-加强Nb 14D5或P2X7-拮抗性Nb 13A7(1μg/500μl)的情况下重悬于补充以Ca2+和Mg2+的PBS(Invitrogen)。红外线灯用于维持37℃的恒定样品温度。平衡120sec之后,将细胞暴露于所示浓度的细胞外ATP并且两分钟之后暴露于Ca2+离子载体离子霉素至终浓度为1μM。
图20.Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强由腹膜巨噬细胞对IL-1β的加工和分泌
将来自野生型或P2X7-/-小鼠的肝素化血在存在单价Nbs(1μg/200μl)14D5,13A7,或溶剂的情况下与LPS(1μg/ml)孵育2h，之后加入ATP至所示终浓度并在37℃进一步孵育30min。
a)离心样品并通过ELISA(Biolegend)分析血浆中IL-1β水平。
b)裂解红细胞并且将血液白细胞以两个步骤染色,第一步骤用对CD11b,Ly-6C,和Ly-6G特异的荧光染料-缀合的mAbs。随后将细胞固定(2％PFA)并通透化(含有0.3％皂苷和0.1％BSA的PBS)，之后进一步对前-IL-1β(pro-IL-1β)染色(e-Bioscience)。进行流式细胞术分析(BD FACS Canto)并且对CD11b+Ly-6Chi单核细胞进行门控。
图21.Nb 13A7阻断,Nb14D5加强由Yac-1鼠淋巴瘤细胞响应细胞外ATP或NAD+导致的CD62L脱落
通过流式细胞术接着在存在13A7(a),14D5(b),或对照Nb的情况下在37℃以ATP或NAD+处理细胞20min，监测小鼠Yac-1淋巴瘤细胞上CD62L的细胞表面表达。使用的ATP和NAD+浓度高于(a)和低于(b)在这些细胞中活化P2X7的阈值(分别为在(a)中100μM和20μM和在(b)中30μM和1.5μM)。
图22.Nb 13A7阻断,Nb14D5加强由原代小鼠T细胞响应细胞外ATP或NAD+导致的CD62L脱落
在存在14D5,13A7,或对照Nb的情况下用200μM ATP或50μM NAD+在37℃处理20min的脾细胞进行流式细胞术分析，之后对CD3和CD62L染色。在溶剂(sol)中在4℃在缺少ATP或NAD的情况下孵育对照细胞。
发明详述
免疫球蛋白序列,诸如抗体和由此衍生的抗原结合片段(例如免疫球蛋白单可变结构域)用于特异地靶向研究和治疗应用中其各自的抗原。免疫球蛋白单可变结构域诸如例如,VHHs的产生可以包括免疫实验动物诸如美洲驼,从免疫组织构建噬菌体文库,选择噬菌体展示抗原结合免疫球蛋白单可变结构域和筛选所述结构域，并为了所需特异性改造其构建体(WO 94/04678)。备选地,类似的免疫球蛋白单可变结构域诸如例如dAbs可以通过直接从天然或合成的文库选择噬菌体展示的抗原结合免疫球蛋白单可变结构域和随后筛选所述结构域和为了所需的特异性改造其构建体而产生(Ward等人,Nature,1989,341：544-6；Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及例如WO 06/030220,WO 06/003388和Domantis Ltd.的其它公开的专利申请)。遗憾的是,与其它策略相比，单克隆和/或大量改造的抗体的使用还带有高的制造成本并且可以导致欠佳的肿瘤穿透。
本发明涉及特定多肽,也被称为"本发明的多肽"或"本发明的免疫球蛋白单可变结构域"或"本发明的ISV"，所述多肽包含以下或,更优选,基本上由以下组成：(i)基本上由一个免疫球蛋白单可变结构域组成的第一结构单元,其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对P2X7并且尤其是针对人P2X7；(ii)任选地基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成或包含免疫球蛋白单可变结构域的第二结构单元,其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对P2X7并且尤其是针对人P2X7；和(iii)任选地包含免疫球蛋白单可变结构域或基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成的第三结构单元,其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对血清白蛋白并且尤其是针对人血清白蛋白(并且甚至更优选其中所述免疫球蛋白单可变结构域是Alb8或Alb11(如本文中定义的))。此外,本发明还涉及编码此种多肽的核酸；制备此种多肽的方法；表达或能够表达此种多肽的宿主细胞；包含此种多肽,核酸和/或宿主细胞的组合物并且尤其是药物组合物；和此种多肽,核酸,宿主细胞和/或组合物用于预防,治疗或诊断目的的用途。从本文中的进一步描述，本发明的其它方面,实施方案,优势和应用将变得清楚的。
在此研究中,开发各种抗-P2X7纳米抗体并表征其在诊断和治疗炎性疾病(包括肾炎)中的可能。
定义
除非另有说明或定义,使用的所有术语具有其在本领域中的通常意义,其对于熟练技术人员将是清楚的。例如对标准手册,诸如Sambrook等人(Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版)第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),F.Ausubel等人(Current protocols in molecular biology,Green Publishing和WileyInterscience,New York,1987),Lewin(Genes II,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1985),Old等人(Principles of Gene Manipulation：An Introduction to GeneticEngineering(第2版)University of California Press,Berkeley,CA,1981)；Roitt等人(Immunology(第6版)Mosby/Elsevier,Edinburgh,2001),Roitt等人(Roitt’s EssentialImmunology(第10版)Blackwell Publishing,UK,2001),和Janeway等人(Immunobiology(第6版)Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York,2005),以及对一般背景技术的参考被引用在本文中。
除非另有说明,未具体详细描述的所有方法,步骤,技术和操作能够以本身已知的方式进行或已经以本身已知的方式进行,如对于熟练技术人员将清楚的。例如同样对本文中提到标准手册和一般背景技术及其中引用的进一步参考文献；以及对例如以下综述进行参考：Presta(Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6)：640-56,2006),Levin和Weiss(Mol.Biosyst.2(1)：49-57,2006),Irving等人(J.Immunol.Methods 248(1-2)：31-45,2001),Schmitz等人(Placenta 21 Suppl.A：S106-12,2000),Gonzales等人(TumourBiol.26(1)：31-43,2005),其描述了蛋白质工程技术,诸如亲和力成熟和改善蛋白诸如免疫球蛋白的特异性及其它所需性质的其它技术。
本文中使用的术语“序列”(例如以术语如“免疫球蛋白序列”,“抗体序列”,“可变结构域序列”,“VHH序列”或“蛋白序列”),应该通常被理解为包括相关氨基酸序列以及编码所述相关氨基酸序列的核酸或核苷酸序列,除非上下文需要更有限的解释。
氨基酸残基将根据标准三字母或单字母氨基酸密码子表示。对WO 08/020079第48页的表A-2进行参考。
当其从通常在所述来源或培养基中与其相关的至少一种其它组分,诸如另一种核酸,另一种蛋白/多肽,另一种生物组分或大分子或至少一种污染物,杂质或微量组分被分离时，核酸或氨基酸被认为是“(以)(基本上)分离的(形式)”-例如,与获自其的反应媒介或培养基相比。尤其是,当其被至少2-倍,尤其是至少10-倍,更特别是至少100-倍,和高达1000-倍或更多倍纯化时，核酸或氨基酸被认为“(基本上)被分离”。“(基本上)分离的形式”的核酸或氨基酸优选基本上均质的,如使用合适的技术,诸如合适的色谱技术,诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的。
当核苷酸序列或氨基酸序列被表示分别“包含”另一条核苷酸序列或氨基酸序列,或表示“基本上由”另一条核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时,这可以意为后一核苷酸序列或氨基酸序列分别被并入第一条提到的核苷酸序列或氨基酸序列,但更通常的是，这通常意为所述第一条提到的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含核苷酸或氨基酸残基片段,所述核苷酸或氨基酸残基片段分别具有与后一序列相同的核苷酸序列或氨基酸序列,不论第一条提到的序列实际上怎样被产生或获得(其可以例如通过本文中描述的任意合适的方法产生或获得)。通过非限制性实例,当本发明的多肽被表示包含免疫球蛋白单可变结构域时,这可以意为所述免疫球蛋白单可变结构域序列被并入本发明的多肽序列,但更通常的是，这通常意为本发明的多肽在其序列内含有免疫球蛋白单可变结构域的序列，不论本发明的所述多肽被怎样产生或获得。同样,当核酸或核苷酸序列被表示包含另一条核苷酸序列时,第一条提到的核酸或核苷酸序列优选为这样的序列,当其表达为表达产物(例如,多肽)时,由后一核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的部分(换句话说,后一核苷酸序列与第一条提到的更大的核酸或核苷酸序列在相同的阅读框内)。
通过“基本上由…组成”意为用于本发明方法的免疫球蛋白单可变结构域与本发明的多肽完全相同或对应于具有添加在所述免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基末端、或氨基末端和羧基末端的有限数量的氨基酸残基,诸如1-20个氨基酸残基,例如1-10个氨基酸残基和优选1-6个氨基酸残基,诸如1,2,3,4,5或6个氨基酸残基的本发明的多肽。
为了比较两条或多条核苷酸序列,第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比可以通过将[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数量]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并乘以[100％]计算,其中第二核苷酸序列中核苷酸的每个缺失、插入、置换或添加-与第一核苷酸序列相比较-被认为是在单个核苷酸(位置)的差异。备选地,两条或多条核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的序列比对的计算机算法诸如NCBI Blast v2.0,使用标准设置计算。用于确定序列同一性程度的一些其它技术,计算机算法和设置例如描述在WO 04/037999,EP 0967284,EP 1085089,WO 00/55318,WO 00/78972,WO 98/49185和GB 2357768中。通常,为了根据上文中概述的计算方法确定两条核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比,将具有最多数量核苷酸的核苷酸序列采用为“第一”核苷酸序列,并且另一条核苷酸序列将被采用为“第二”核苷酸序列。
为了比较两条或多条氨基酸序列,第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比(在本文中也称为“氨基酸同一性”)可以通过将[第一氨基酸序列与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并乘以[100％]计算,其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每个缺失,插入,置换或添加-与第一氨基酸序列相比–被认为是在单个氨基酸残基(位置)处的差异,即为如本文中定义的“氨基酸差异”。备选地,两条氨基酸序列之间序列同一性的程度可以使用诸如上文提到的那些已知计算机算法计算用于确定核苷酸序列的序列同一性程度,同样适用标准设置。通常,为了根据上文中概述的计算方法确定两条氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比,具有最多氨基酸残基数的氨基酸序列将被用作“第一”氨基酸序列,并且另一氨基酸序列将被用作“第二”氨基酸序列。
同样,在确定两条氨基酸序列间的序列同一性程度中,熟练技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸置换,其可以通常被描述为氨基酸置换，其中氨基酸残基被类似化学结构的另一种氨基酸残基替代并且，所述另一种氨基酸残基对多肽的功能,活性或其它生物学性质具有很少或基本上不具有影响。此种保守氨基酸置换是本领域公知的,例如从WO04/037999,GB 335768,WO 98/49185,WO 00/46383和WO 01/09300；并且可以基于来自WO04/037999以及WO 98/49185的有关教导和来自其中引用的进一步参考文献选择此种置换的(优选的)类型和/或组合。
此种保守置换优选地是这样的置换，其中以下组(a)–(e)中的一个氨基酸被相同组内的另一个氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族,非极性或微极性残基：Ala,Ser,Thr,Pro和Gly；(b)极性,带负电的残基及其(不带电)酰胺：Asp,Asn,Glu和Gln；(c)极性,带正电的残基：His,Arg和Lys；(d)大的脂肪族,非极性残基：Met,Leu,Ile,Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe,Tyr和Trp。特别优选的保守置换如下：Ala置换为Gly或置换为Ser；Arg置换为Lys；Asn置换为Gln或置换为His；Asp置换为Glu；Cys置换为Ser；Gln置换为Asn；Glu置换为Asp；Gly置换为Ala或置换为Pro；His置换为Asn或置换为Gln；Ile置换为Leu或置换为Val；Leu置换为Ile或置换为Val；Lys置换为Arg,置换为Gln或置换为Glu；Met置换为Leu,置换为Tyr或置换为Ile；Phe置换为Met,置换为Leu或置换为Tyr；Ser置换为Thr；Thr置换为Ser；Trp置换为Tyr；Tyr置换为Trp；和/或Phe置换为Val,置换为Ile或置换为Leu。
用于本文中描述的多肽的任意氨基酸置换还可以基于不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变化频率的分析(由Schulz等人(“Principles of Protein Structure”,Springer-Verlag,1978)开发),基于结构形成潜力的分析(由Chou和Fasman(Biochemistry13：211,1974；Adv.Enzymol.,47：45-149,1978)开发),和基于蛋白的疏水模式的分析(由Eisenberg等人(Proc.Natl.Acad Sci.USA 81：140-144,1984),Kyte和Doolittle(J.Molec.Biol.157：105-132,1981),和Goldman等人(Ann.Rev.Biophys.Chem.15：321-353,1986)开发),其所有都通过参考以其整体并入本文。纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息在本文说明书中和上文引用的一般背景技术给出。同样,为此,来自美洲驼的VHH结构域的晶体结构例如由Desmyter等人(Nature Structural Biology,3：803,1996),Spinelli等人(Natural Structural Biology,3：752-757,1996)和Decanniere等人(Structure,7(4)：361,1999)给出。在常规VH结构域中形成VH/VL界面和在这些位置可能的骆驼源化置换的一些氨基酸残基的进一步信息可以在上文引用的现有技术中找到。
如果它们在其整个长度具有100％序列同一性(如本文中定义的)，则氨基酸序列和核酸序列被表示为“完全相同”；
当比较两条氨基酸序列时,术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比单个氨基酸残基在第一序列上的插入,缺失或置换；其被理解为两条氨基酸序列可以含有一个,两个或多个此种氨基酸差异。更特别的,在本发明的氨基酸序列和/或多肽中,术语“氨基酸差异”是指分别与a),d)或g)的CDR序列相比，c),f)或i)中指定的CDR序列的位置上单个氨基酸残基的插入,缺失或置换；其被理解为分别与a),d)或g)的CDR序列(在前)相比，c),f)和i)的CDR序列可以含有一个,两个或最大三个此种氨基酸差异。
所述“氨基酸差异”可以是任意一个、两个或最大三个置换,缺失或插入,或其任意组合,其改善本发明多肽的性质或至少不从所需性质或从本发明多肽的所需性质的平衡或组合减损太多。在这方面,与包含一个或多个CDR序列而无一个、两个或最大三个置换,缺失或插入的多肽相比，产生的本发明的多肽应该至少以相同、不相上下、或更高的亲和力结合P2X7,所述亲和力由表面等离振子共振测量。
在这方面,根据c),f)和/或i)的氨基酸序列可以是分别通过使用一个或多个本身已知的亲和力成熟技术(在前)的亲和力成熟源自根据a),d)和/或g)的氨基酸序列的氨基酸序列。
例如,并且根据用于表达本发明多肽的宿主生物,此种缺失和/或置换能够以此种方式设计：一个或多个用于翻译后修饰的位点(诸如一个或多个糖基化位点)被去除,如将在本领域技术人员的能力内。
可以交替使用的术语"表位"和"抗原决定簇"是指大分子,诸如多肽或蛋白的部分,所述部分可以被抗原结合分子,诸如本发明的免疫球蛋白,常规抗体,免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽识别,并且更特别地被所述分子的抗原结合位点结合。表位限定用于免疫球蛋白的最小结合位点,并且因此代表免疫球蛋白的特异性的靶点。
抗原结合分子(诸如本发明的免疫球蛋白,常规抗体,免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)识别所述表位的部分被称为“互补位(paratope)”。
可以"结合"或"特异结合"某表位,抗原或蛋白(或其至少一个部分,片段或表位),对于某表位,抗原或蛋白(或其至少一个部分,片段或表位)"具有亲和力"和/或"具有特异性"的多肽(诸如本发明的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽,或通常抗原结合分子或其片段)被表示为"抗"或"针对"所述表位,抗原或蛋白或就此种表位,抗原或蛋白而言是"结合"分子,或被表示为“抗”-表位,“抗”-抗原或“抗”-蛋白(例如“抗”-P2X7)。
术语“特异性”具有在WO 08/020079的第53-56页上的第n)段中给出的意义；并且如在其中提及的，指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)分子能够结合的抗原或抗原决定簇的不同类型数。可以基于亲和力和/或亲合力确定抗原结合蛋白的特异性,如在WO 08/020079的第53-56页(通过引用并入本文)中描述的,其还描述了用于测量抗原结合分子(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)和相关抗原之间结合的一些优选的技术。典型地,抗原结合蛋白(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)将以10-5至10-12摩尔/升或更低,和优选10-7至10-12摩尔/升或更低并且更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即,以105至1012升/摩尔或更高,和优选107至1012升/摩尔或更高和更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合其抗原。任何大于104mol/升的KD值(或任何低于104M-1的KA值)升/mol通常被认为表示非特异性结合。优选地,本发明的单价多肽将以小于500nM,优选小于200nM,更优选小于10nM,诸如例如10和5nM之间或更少的亲和力结合所需抗原。抗原结合蛋白对抗原或抗原决定簇的特异结合能够以本身已知的任何合适方式确定,包括,例如,Scatchard分析和/或竞争性结合测定,诸如放射性免疫测定(RIA),酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定,和本领域中本身已知的其不同变化；以及本文中提到的其它技术。如对于熟练技术人员将清楚的,和如WO 08/020079第53-56页中描述的,所述解离常数可以是实际的或表观的解离常数。确定解离常数的方法对于熟练技术人员将清楚的,并且例如包括WO 08/020079的53-56页中提到的技术。
当其以比免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽结合第二靶点或抗原的亲和力高至少10倍,诸如至少100倍,和优选至少1000倍,和高达10000倍或更好的亲和力(如上文描述的,并且适当表达为KD值,KA值,Koff速率和/或Kon速率)结合第一抗原时，所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽被表示为与第二靶点或抗原相比“特异于”第一靶点或抗原。例如,所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽能够以比所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽结合第二靶点或抗原的KD至少10倍小,诸如至少100倍小,和优选至少1000倍小,诸如10.000倍小或比那更小的KD值结合第一靶点或抗原。优选地,当与第二靶点或抗原相比，免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽“特异于”第一靶点或抗原时,其针对(如本文中定义的)所述第一靶点或抗原,而不针对所述第二靶点或抗原。
术语“(交叉)-阻断(block)”,“(交叉)-阻断(blocked)”,“(交叉)-阻断(blocking)”,“竞争结合”,“(交叉)-竞争(compete)”,“(交叉)-竞争(competing)”和“(交叉)-竞争(competition)”在本文中交叉使用，意为免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂干扰其它免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或结合剂对给定靶点的结合的能力。免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂能够干扰另一个对靶点的结合的程度,和因此其是否可以被表示为根据本发明的交叉阻断,可以使用竞争结合测定来确定。一个特别合适的定量交叉阻断测定使用Biacore仪器，其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用程度。另一种合适的定量交叉阻断测定使用基于ELISA的方法以测量免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂之间就其对靶点的结合而言的竞争。
以下一般描述用于确定免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂是否交叉阻断或是否能够根据本发明交叉-阻断的合适的Biacore测定。将理解能够以本文中描述的任意免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂使用所述测定。Biacore仪器(例如Biacore 3000)按照制造商的建议操作。因此在一个交叉-阻断测定中,使用标准胺偶联化学，将靶蛋白(例如,P2X7)偶联于CM5 Biacore芯片产生用靶包被的表面。典型地200-800共振单位的靶将被偶联于芯片(产生可容易测量水平的结合但容易由使用的测试试剂的浓度导致饱和的量)。将要被评价其彼此交叉阻断的能力的两种结合剂(被称为A*和B*)以一比一的结合位点摩尔比在合适的缓冲液中混合从而产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，结合剂的分子量被假定为结合剂的总分子量除以在那个结合剂上的靶结合位点数量。测试混合物中各结合剂的浓度应该足够高以容易地使Biacore芯片上捕获的靶分子上对那个结合剂的结合位点饱和。混合物中的结合剂为相同的摩尔浓度(基于结合)并且该浓度将典型地在1.00和1.5微摩之间(基于结合位点)。还制备只含有A*和只含有B*的分开的溶液。这些溶液中的A*和B*应该在相同缓冲液中并且与测试混合物中浓度相同。将测试混合物通过靶包被的Biacore芯片并记录结合总量。随后将芯片以此种方式处理：取出结合的结合剂而不损坏芯片结合的靶。典型地，这通过以30mM HCl处理芯片60秒完成。随后将仅A*的溶液通过靶包被的表面并且记录结合量。再次处理芯片以去除所有结合的结合剂而不损坏芯片结合的靶。随后将单独B*溶液通过靶包被的表面并记录结合量。接着计算A*和B*混合物的最大理论结合,并且是各结合剂当单独通过靶表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物结合小于该理论最大值，则两种结合剂被表示为彼此交叉阻断。因此,通常,根据本发明的交叉-阻断免疫球蛋白,抗体免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂是将在上述Biacore交叉阻断测定的测定过程中结合靶的那个并且在存在第二免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂的情况下，记录的结合在最大理论结合的80％和0.1％之间(例如,80％至4％),具体在最大理论结合的75％和0.1％之间(例如,75％至4％),并且更具体在组合中两种免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或结合剂的最大理论结合(正如上文定义的)的70％和0.1％之间(例如,70％至4％)。上文描述的Biacore测定是用于确定免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂是否根据本发明交叉阻断的基本测定。偶尔特定免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂可以不结合通过胺化学偶联于CM5 Biacore芯片的靶(这通常在靶上相关结合位点由于偶联于芯片被掩盖或破坏时发生)。在此种情况下，可以使用靶的标记版本,例如N-末端His-标记的版本确定交叉-阻断。在该特定形式中,抗-His抗体将被偶联于Biacore芯片并随后His-标记的靶将通过芯片表面并被抗-His抗体捕获。交叉阻断分析将基本上如上文描述的进行,除了在每次芯片再生循环之后,新的His-标记的靶将被加载回抗-His抗体包被的表面。除了给定的使用N-末端His-标记的靶的实例之外,可以备选地使用C-末端His-标记的靶。此外,本领域已知的各种其它标签和标签结合蛋白组合可以用于此种交叉-阻断分析(例如HA标签与抗-HA抗体；FLAG标签与抗-FLAG抗体；生物素标签与链霉亲和素)。
以下一般描述用于确定针对靶(例如,P2X7)的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂是否如本文中定义的交叉阻断或能够交叉-阻断的ELISA测定。将理解能够以本文中描述的任意免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂使用所述测定。所述测定的一般原理是要具有针对包被在ELISA板孔上的靶的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或结合剂。将过量的第二,可能交叉阻断,抗-靶免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽加入溶液(即,未结合于ELISA板)。随后将有限量的靶加入孔。包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽和溶液中的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽竞争结合有限量的靶分子。清洗板以去除尚未被包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽结合的过量靶并且还去除第二,溶液相免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽以及在第二,溶液相免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽和靶之间形成的任意复合体。随后使用适于检测靶的试剂测量结合的靶的量。溶液中能够交叉阻断包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽将能够引起相对在缺少第二、溶液相,免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽的情况下包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够结合的靶分子数，包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够结合的靶分子数的减少。在第一免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽,例如Ab-X,被选择为固定化的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽的情况下,其被包被在ELISA板孔上,其后，将板用合适的封闭溶液封闭以最小化接着加入的试剂的非特异结合。随后将过量的第二免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽,即,Ab-Y,加入ELISA板，从而在包被ELISA的过程中，每孔中Ab-Y靶结合位点的摩尔/孔至少10倍高于使用的Ab-X靶结合位点的摩尔/孔。随后将靶加入，从而加入的靶的摩尔/孔至少25-倍低于用于包被各个孔的Ab-X靶结合位点的摩尔数。合适的孵育时期之后，清洗ELISA板并且加入用于检测靶的试剂以测量由包被的抗-靶免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽特异结合的靶的量(在Ab-X的情况下)。用于测定的背景信号被定义为在具有包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽(在该情况下Ab-X),第二溶液相免疫球蛋白单可变结构域或多肽(在该情况下Ab-Y),仅靶缓冲液(即,无靶)和靶检测试剂的孔中获得的信号。用于测定的阳性对照信号被定义为在具有包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽(在该情况下Ab-X),仅第二溶液相免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽缓冲液(即无第二溶液相免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽),靶和靶检测试剂的孔中获得的信号。ELISA测定能够以这样的方式运行以致使阳性对照信号至少6倍于背景信号。为了避免由于选择哪种免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽用作包被免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽和哪种用作第二(竞争剂)免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽导致的任何人为现象(例如Ab-X和Ab-Y之间对靶显著不同的亲和力),交叉阻断测定能够以两种方式进行：1)方式1是其中Ab-X是包被在ELISA板上的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽并且Ab-Y是溶液中的竞争免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽以及2)方式2是其中Ab-Y是包被在ELISA板上的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽并且Ab-X是溶液中的竞争免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽。如果与在缺少溶液相抗-靶免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽(即,阳性对照孔)的情况下获得的靶检测信号相比，在方式1或方式2中，溶液相抗-靶免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够引起靶检测信号{即由包被的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域或多肽结合的靶的量)的60％和100％之间,具体在70％和100％之间,和更具体在80％和100％之间的减少，则Ab-X和Ab-Y被定义为交叉-阻断。
“表位分箱(binning)”是指使用竞争结合测定或交叉-阻断测定以鉴定不能够或能够同时结合靶(例如,P2X7)的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽,或其它结合剂对从而鉴定结合靶上相同,或重叠表位的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂。
用于本说明书的“表位箱”因此是具有相同或重叠结合特异性的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽,或其它结合剂家族。如上文描述的,将免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽,或其它结合剂分选入表位箱是基于免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽,或其它结合剂对抗原结合的交叉-竞争(交叉阻断)。交叉-竞争(交叉阻断)测定分析免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂对抗原和免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽,或其它结合剂一起的具有类似的配对属性(profile)的基团的同时结合(配对)。具有类似的属性(即,属于相同表位箱)的免疫球蛋白,抗体,免疫球蛋白单可变结构域,多肽或其它结合剂能够结合相同、密切相关和/或重叠的表位。
如果其对(如本文中定义的)这些不同抗原或抗原决定簇都特异，则氨基酸序列被表示对两种不同抗原或抗原决定簇(诸如例如来自哺乳动物的不同物种的血清白蛋白,诸如例如人血清白蛋白和食蟹猴(cyno)血清白蛋白,诸如例如来自不同哺乳动物的P2X7)“交叉反应”。
注意的是，本文中使用的‘能够特异结合’和‘特异结合’同义使用并且是指特异结合分别指出的实体的能力。
本文中使用的术语"P2X7"是指形成(同源-)三聚体细胞外ATP-门控阳离子通道"P2X7受体"的蛋白,特别是由SEQ ID NOs：1-5,以及其所有同种型,特别是SEQ ID NOs：1-3及其同种型表示的蛋白。(人)同种型包括所有拼接变体,例如,P2X7(b)-P2X7(k),以及在人P2X7受体中鉴定的所有单核苷酸多态性,并且包括具有改变的N末端和跨膜结构域1的形式(所有都为本领域已知的,参见例如Cheewatrakoolpong等人(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.332,17–27和Feng等人(2006)J.Biol.Chem.281,17228–17237)。P2X7受体的门控诱导炎症小体和细胞表面金属蛋白酶的活化。
本文中使用的术语本发明多肽的“效力”，是其特异效果发生所需量的本发明的多肽的功能。其被简单测量为该多肽的IC50的倒数。它是指本发明所述多肽中和P2X7活性的能力；诸如调节,抑制和/或预防P2X7活性,调节,抑制和/或预防由P2X7活性诱导的组织损伤炎症的引发。
所述效力可以由本领域中已知的或本文中描述的任意合适测定测量,诸如例如在实施例部分描述的。
相比之下,本发明多肽的“功效”测量在饱和多肽浓度下效果本身的最大强度。功效表明可从本发明的多肽获得的最大响应。其是指多肽产生所需(治疗)效果的能力。
在本发明的情况下,“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”通常意为降低或抑制以及增加,加强或增强P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)及其同种型的活性,如使用合适的体外,细胞或体内测定(诸如本文中提到的那些)测量的。尤其,与在相同条件下但不存在本发明多肽的相同测定中，P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)及其同种型的活性相比，以至少1％,优选至少5％,诸如至少10％或至少25％,例如以至少50％,至少60％,至少70％,至少80％,或90％或更多降低或抑制以及增加或增强P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)及其同种型的活性(如使用合适的体外,细胞或体内测定(诸如本文中提到的那些)测量)。
调节可以例如包括降低或抑制细胞外ATP对P2X7受体的结合或降低或抑制在P2X7受体的Arg 125处NAD-依赖性ADP-核糖基化。调节可以例如包括降低或抑制由P2X7受体导致的门控。P2X7受体的门控诱导炎症小体的活化,细胞表面金属蛋白酶的活化,TACE导致的外-结构域脱落,磷脂酰丝氨酸(PS)的外化和/或凋亡。
备选地,调节可以包括增加,加强或增强由P2X7受体导致的门控。
本发明多肽的“半衰期”可以通常如WO 08/020079中第57页o)段中描述的和在本文中提到的来定义，是指例如由于由天然机制导致的多肽降解和/或多肽清除或隔离导致的多肽在体内的血清浓度被降低50％所用的时间。本发明多肽的体内半衰期能够以任意本身已知的方式确定,诸如通过药代动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员将是清楚的,并且可以例如通常如在WO 08/020079第57页o)段描述的。还如在WO 08/020079第57页o)段提到的,半衰期可以使用参数诸如t1/2-α,t1/2-β和曲线下面积(AUC)表达。例如对标准手册,诸如Kenneth等人(Chemical Stablity of Pharmaceuticals：A Handbook forPharmacists,John Wiley&Sons Inc,1986)和M Gibaldi和D Perron("Pharmacokinetics",Marcel Dekker,2nd修改版,1982)进行参考。术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也在WO 08/020079第57页o)段定义并且尤其是指t1/2-β的增加,有或没有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
除非另有说明,术语“免疫球蛋白”–不论在本文中用于指重链抗体或常规4-链抗体–用作一般术语以包括全尺寸抗体,其单个链,以及其所有部分,结构域或片段(分别包括但不限于抗原结合结构域或片段诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。
本文中使用的术语(多肽或蛋白)的"结构域"是指具有独立于蛋白的其余部分保留其三级结构的能力的折叠的蛋白结构。通常,结构域负责蛋白的单独的功能性质,并且在很多情况下可以被添加、去除或转移至其它蛋白而不损失蛋白和/或结构域的其余部分的功能。
本文中使用的术语"免疫球蛋白结构域"是指抗体链(诸如例如,常规4-链抗体或重链抗体的链)的球状区域,或指基本上由此种球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域特征为，它们保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特性,所述抗体分子由以两个β-折叠排列的约七条反平行β-链的双层夹心组成,任选地由保守二硫键稳定。
本文中使用的术语"免疫球蛋白可变结构域"意为免疫球蛋白结构域，其基本上由四个"构架区"组成，所述四个"构架区"在本领域中和在本文下文中分别被称为"构架区1"或"FR1"；"构架区2"或"FR2"；"构架区3"或"FR3"；和"构架区4"或"FR4"；所述构架区由三个"互补决定区"或"CDRs"打断,所述三个"互补决定区"或"CDRs"在本领域中和在本文下文中分别被称为"互补决定区1"或"CDR1"；"互补决定区2"或"CDR2"；和"互补决定区3"或"CDR3"。因此,免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性的是免疫球蛋白可变结构域。
与“单可变结构域”交替使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”限定了这样的分子，其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上,和由单个免疫球蛋白结构域形成。这使得免疫球蛋白单可变结构域脱离“常规”免疫球蛋白或其片段,其中，两个免疫球蛋白结构域,尤其是两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点。典型地,在常规免疫球蛋白中,重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在此种情况下,VH和VL的互补决定区(CDRs)都将促成抗原结合位点,即总共6个CDRs将包括在抗原结合位点的形成中。
鉴于上述定义,常规4-链抗体(诸如IgG,IgM,IgA,IgD或IgE分子；本领域已知的)或源自此种常规4-链抗体的Fab片段,F(ab')2片段,Fv片段诸如二硫化物连接的Fv或scFv片段,或双抗体(diabody)(全部是本领域已知的)的抗原结合结构域将通常不被认为是免疫球蛋白单可变结构域,因为在这些情况中,由一个(单个)免疫球蛋白结构域对各个抗原表位的结合将通常不发生，而由(缔合的)免疫球蛋白结构域诸如轻和重链可变结构域对,即,通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对,其共同结合各个抗原的表位。
相比之下,免疫球蛋白单可变结构域能够特异结合抗原表位而无需与另外的免疫球蛋白可变结构域配对。由单个VH/VHH或VL结构域形成免疫球蛋白单可变结构域的结合位点。因此,免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不多于三个CDRs形成。
由此,单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如,VL-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如,VH-序列或VHH序列)或其合适的片段；只要其能够形成单个抗原结合单元(即功能性抗原结合单元,其基本上由单可变结构域组成、从而所述单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元)。
在本发明的一个实施方案中,所述免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序列(例如,VH-序列)；更具体地,所述免疫球蛋白单可变结构域可以是源自常规四-链抗体的重链可变结构域序列或源自重链抗体的重链可变结构域序列。
例如,所述免疫球蛋白单可变结构域可以是(单)结构域抗体(或适于用作(单)结构域抗体的氨基酸),"dAb"或dAb(或适于用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如本文中定义的,并且包括但不限于VHH)；其它单可变结构域,或其任一个的任意合适片段。
尤其是,所述免疫球蛋白单可变结构域可以是
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(如本文中定义的)或其合适的片段。[注意：
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和纳米克隆
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是AblynxN.V.的注册商标]。对于纳米抗体的一般描述,对下文进一步描述,以及对本文中引用的现有技术,诸如例如在WO 08/020079中描述的(第16页)进行参考。
"VHH结构域",也称为VHHs,VHH结构域,VHH抗体片段,和VHH抗体,最初被描述为"重链抗体"(即"缺少轻链的抗体"；Hamers-Casterman等人Nature 363：446-448,1993)的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域。选择术语"VHH结构域"以将这些可变结构域与存在于常规4-链抗体中的重链可变结构域(其在本文被称为"VH结构域"或"VH结构域")和与存在于常规4-链抗体中的轻链可变结构域(其在本文被称为"VL结构域"或"VL结构域")相区别。为了进一步描述VHH’s和纳米抗体,对Muyldermans的综述文章(Reviews in MolecularBiotechnology 74：277-302,2001),以及以下作为一般背景技术被提及的专利申请进行引用：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678,WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591,WO 99/37681,WO 00/40968,WO 00/43507,WO 00/65057,WO 01/40310,WO01/44301,EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805,WO 01/21817,WO 03/035694,WO 03/054016和WO 03/055527；AlgonomicsN.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(National ResearchCouncil of Canada)的WO 01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(＝EP 1433 793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867,WO 04/041862,WO 04/041865,WO 04/041863,WO 04/062551,WO 05/044858,WO 06/40153,WO 06/079372,WO 06/122786,WO 06/122787和WO 06/122825和Ablynx N.V.的进一步公开的专利申请。还对在这些申请中提到的进一步现有技术进行引用,并且尤其是对在国际申请WO 06/040153的第41-43页上提到的参考文献表进行引用,所述表和参考文献通过引用并入本文。如在这些参考文献中描述的,纳米抗体(尤其是VHH序列和部分人源化纳米抗体)可以尤其是特征为在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。纳米抗体的进一步描述,包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化,以及其它修饰,部分或片段,衍生物或“纳米抗体融合体”,多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体及其制剂的半衰期的不同修饰可以例如在WO08/101985和WO 08/142164中找到。为了进一步一般描述纳米抗体,对本文中引用的现有技术,诸如例如在WO 08/020079中描述的(第16页)进行引用。
"结构域抗体",也称为"Dab","结构域抗体",和"dAbs"(由GlaxoSmithKline集团公司用作商标的术语"结构域抗体(Domain Antibodies)"和"dAbs")已经在例如EP0368684,Ward等人(Nature 341：544-546,1989),Holt等人(Tends in Biotechnology 21：484-490,2003)和WO 03/002609以及例如WO 04/068820,WO 06/030220,WO 06/003388和Domantis Ltd的其它公开的专利申请中描述。结构域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物,尤其是人4-链抗体的VH或VL结构域。为了以单个抗原结合结构域结合表位,即无需分别与VL或VH结构域配对,需要对此种抗原结合性质的特定选择,例如通过使用人单VH或VL结构域序列的文库。如VHHs，结构域抗体具有大约13至大约16kDa的分子量,并且如果源自全人序列,则不需要人源化用于例如人中的治疗用途。
应该注意,尽管由于它们不是哺乳动物来源的而在本发明的情形中欠佳，但单可变结构域可以源自鲨鱼的某些物种(例如,所谓的“IgNAR结构域”,参见例如WO 05/18629)。
因此,在本发明的意义中,术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包含源自非人来源,优选骆驼科,优选骆驼科重链抗体的多肽。它们可以如之前描述的被人源化。此外,术语包含源自非骆驼科来源,例如小鼠或人的多肽,所述多肽被“骆驼源化”,例如在Davies和Riechman(FEBS 339：285-290,1994；Biotechonol.13：475-479,1995；Prot.Eng.9：531-537,1996)以及Riechman和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231：25-38,1999)中描述的。
根据由Kabat等人("Sequence of proteins of immunological interest",USPublic Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91)给出的对VH结构域的一般编号方式对VHH结构域的氨基酸残基编号,如例如在Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231：25-38,1999)的图2中显示应用于来自骆驼科的VHH结构域。用于给VH结构域的氨基酸残基编号的替代方法(所述方法还能够以与VHH结构域类似的方式应用)是本领域已知的。然而,在本说明书,权利要求和附图中,将按照如上文描述的根据Kabat应用于VHH结构域的编号方式,除非另有说明。
应该注意–如本领域对于VH结构域和VHH结构域公知的–各个CDRs中氨基酸残基总数可以变化并且可以不对应于由Kabat编号方法指出的氨基酸残基总数(即,根据Kabat编号方法的一个或多个位置在实际序列中可以不被占据,或实际序列可以含有比Kabat编号方法允许的数量更多的氨基酸残基)。这意为,通常,根据Kabat的编号方法可以对应或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基总数将通常在110至120,常在112和115之间的范围内。然而应该注意，更小或更长的序列也可以适于本文中描述的目的。
CDR区的确定也可以根据不同方法完成。在根据Kabat的CDR确定中,VHH的FR1包含位置1-30的氨基酸残基,VHH的CDR1包含位置31-35的氨基酸残基,VHH的FR2包含位置36-49的氨基酸,VHH的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基,VHH的FR3包含位置66-94的氨基酸残基,VHH的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基,并且VHH的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
可以根据Kontermann和Dübel(编辑,Antibody Engineering,第2卷,SpringerVerlag Heidelberg Berlin,Martin,第3章,pp.33-51,2010)确定CDR序列。根据该方法,FR1包含位置1-25的氨基酸残基,CDR1包含位置26-35的氨基酸残基,FR2包含位置36-49的氨基酸,CDR2包含位置50-58的氨基酸残基,FR3包含位置59-94的氨基酸残基,CDR3包含位置95-102的氨基酸残基,和FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
免疫球蛋白单可变结构域诸如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域)可以进行人源化。尤其是,人源化免疫球蛋白单可变结构域,诸如纳米抗体(包括VHH结构域)可以为如在之前段落中通常定义的免疫球蛋白单可变结构域,但其中是和/或对应于人源化置换(如本文中定义的)的至少一个氨基酸残基存在(并且尤其是,在至少一个构架残基中)。可能有用的人源化置换可以通过比较天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个密切相关的人VH序列的相应构架序列来确定,这之后因此确定的一个或多个可能有用的人源化置换(或其组合)可以被引入所述VHH序列(以本身已知的任意方式,如本文中进一步描述的)并且可以测试产生的人源化VHH序列对靶的亲和力,稳定性,表达的容易度和水平,和/或其它所需性质。这样,通过有限程度的试错试验,其它合适的人源化置换(或其合适的组合)可以由熟练技术人员基于本文中公开的内容确定。同样,基于在前描述,免疫球蛋白单可变结构域，诸如纳米抗体(包括VHH结构域)(的构架区),可以部分人源化或完全人源化。
免疫球蛋白单可变结构域诸如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化VHH结构域),还可以通过在一个或多个CDRs的氨基酸序列中引入一个或多个改变进行亲和力成熟,所述改变导致产生的免疫球蛋白单可变结构域与各自的亲本分子相比对其各自的抗原的改善的亲和力。本发明的亲和力-成熟的免疫球蛋白单可变结构域分子可以通过本领域已知的方法制备,所述方法例如由Marks等人(Biotechnology 10：779-783,1992),Barbas,等人(Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813,1994),Shier等人(Gene 169：147-155,1995),Yelton等人(Immunol.155：1994-2004,1995),Jackson等人(J.Immunol.154：3310-9,1995),Hawkins等人(J.MoI.Biol.226：889896,1992),Johnson和Hawkins(Affinity of antibodies using phage display,Oxford University Press,1996)描述的。
从免疫球蛋白单可变结构域诸如结构域抗体或纳米抗体开始的设计/选择和/或制备多肽的过程在本文中也称为“格式化(formatting)”所述免疫球蛋白单可变结构域；并且组成多肽的部分的免疫球蛋白单可变结构域被表示为“格式化的”或为所述多肽的“形式(format)”。基于本文中的公开内容，免疫球蛋白单可变结构域可以被格式化的方式的实例和此种格式的实例对于熟练技术人员将是清楚的；并且此种格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发明的进一步方面。
例如,并且不受限制,一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以用作用于制备多肽的“结合单元”,“结合结构域”或“结构单元”(这些术语可交替使用),其可以任选地含有一个或多个可以用作结合单元的进一步免疫球蛋白单可变结构域(即针对P2X7的相同或其它表位和/或针对一个或多个P2X7之外的其它抗原,蛋白或靶)。
单价多肽仅包含一个结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)或基本上仅由一个结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)组成。包含两个或多个结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)的多肽将在本文中也被称为“多价的”多肽,并且存在于此种多肽中的结合单元/免疫球蛋白单可变结构域在本文中也将被称为为“多价形式”。例如“双价的”多肽可以包含任选地通过接头序列连接的两个免疫球蛋白单可变结构域,然而“三价”多肽可以包含任选地通过两个接头序列连接的三个免疫球蛋白单可变结构域；等等。
在多价多肽中,所述两个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以相同或不同,并且可以针对相同抗原或抗原决定簇(例如针对相同部分或表位或针对不同部分或表位)或可以备选地针对不同抗原或抗原决定簇；或其任意合适组合。含有至少两个结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)的多肽(其中至少一个结合单元针对第一抗原(即P2X7)且至少一个结合单元针对第二抗原(即不同于P2X7))也将被称为“多特异性”多肽,并且存在于此种多肽中的结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)将在本文中也被称为为“多特异性形式”。因此,例如,本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即P2X7)的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对第二抗原(即不同于P2X7)的进一步免疫球蛋白单可变结构域的多肽,然而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即P2X7)的免疫球蛋白单可变结构域,至少一个针对第二抗原(即不同于P2X7)的进一步免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对第三抗原(即不同于P2X7和第二抗原二者)的进一步的免疫球蛋白单可变结构域的多肽；等等。
“多互补位多肽”,诸如例如”双互补位多肽”或“三互补位(triparatopic)多肽”,包含各具有不同互补位的两个或多个结合单元或基本上由各自具有不同互补位的两个或多个结合单元组成(如将进一步在本文中描述的；参见本发明关于多价多肽的章节)。
P2X7
本发明的ISVs和多肽可以通常用于调节,并且尤其是抑制和/或预防,ATP对P2X7的结合或细胞外ATP介导的P2X7并且尤其是人P2X7的活化(参见表B-2),并且因此用于调节,并且尤其是抑制或预防,由P2X7并且尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)导致的门控和/或调节与此种门控(P2X7结构单元)相关的生物机制,响应和效果。优选地,本发明的ISVs选自由以下组成的组：1c81-样序列,3c23-样序列,1c113-样序列,13a7-样序列和14d5-样序列。
本发明提供的氨基酸序列优选地为基本上分离的形式(如本文中定义的),或形成本发明的蛋白或多肽的部分(如本文中定义的),其可以包含本发明的一个或多个氨基酸序列或基本上由本发明的一个或多个氨基酸序列组成并且其可以任选地进一步包含一个或多个进一步的氨基酸序列(所有都任选地通过一个或多个合适的接头连接)。例如,并且不受限制,本发明的一个或多个氨基酸序列可以用作此种蛋白或多肽中的结合单元,其可以任选地含有一个或多个可以用作结合单元(即针对一个或多个P2X7之外的其它靶)的进一步的氨基酸序列,从而分别提供本发明的单价,多价的或多特异性多肽,全部如本文中描述的。此种蛋白或多肽也可以是基本上分离的形式(如本文中定义的)。
本发明的氨基酸序列和多肽本身优选基本上由不通过二硫化物桥连接于其它氨基酸序列或链的单个氨基酸链组成(但可以含有或可以不含有一个或多个分子内二硫化物桥，例如,已知纳米抗体–如本文中描述的–有时可以在CDR3和CDR1或FR2之间含有二硫化物桥)。然而,应该注意本发明的一个或多个氨基酸序列可以彼此连接和/或连接于其它氨基酸序列(例如,通过二硫化物桥)以提供也可以用于本发明的肽构建体(例如Fab’片段,F(ab’)2片段,ScFv构建体,“双抗体”及其它多特异性构建体。例如对Holliger和Hudson的综述,Nat Biotechnol.2005 Sep；23(9)：1126-36)进行参考。
通常,当本发明的氨基酸序列(或包含本发明的氨基酸序列的化合物,构建体或多肽)要施用于受试者(例如用于本文中描述的治疗和/或诊断目的),其优选为不天然存在于所述受试者中的氨基酸序列；或当其的确天然存在于所述受试者中时为基本上分离的形式(如本文中定义的)。
此外,除了至少一个用于结合P2X7的结合位点之外，本发明的氨基酸序列可以任选地含有一个或多个结合其它抗原,蛋白或靶的进一步的结合位点。
在本说明书和权利要求中,以下术语定义如下：
A)1C81-样序列：“1C81-样序列”,“1C81-样ISV”或“1C81-样结构单元”被定义为包含以下的ISV(如本文中描述的)：
a)CDR1，所述CDR1包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)或(ii)与氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，所述CDR2包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列AIDWSDFN(SEQID NO：62)或(ii)与氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ IDNO：62)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，所述CDR3包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)或(ii)与氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ IDNO：90)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以由本领域技术人员已知的任意合适的测定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(如本领域已知的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)确定。
优选地,调节活性由基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
优选地,在此种1C81-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的。更优选地,在此种1C81-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在a),b)和c)下定义的。同样,在此种1C81-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定或通过基于细胞的测定(例如,诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
例如,在此种1C81-样序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)(CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)(CDR1和CDR3如在a)和c)下定义的,分别)；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的)。特别是,当1C81-样序列根据此方面时：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)(CDR3如在上述c)下定义的)；和/或CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(CDR2如在上述b)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(CDR1如在上述a)下定义的)。同样,在此种1C81-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如,诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在特别优选的方面,“1C81-样序列”,“1C81-样ISV”或“1C81-样结构单元”是包含以下的ISV：
d)CDR1，所述CDR1是(i)氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)或(ii)与氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，所述CDR2是(i)氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)或(ii)与氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，所述CDR 3是(i)氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)或(ii)与氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如,诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
优选地,在根据该具体优选的方面的1C81-样序列中,CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的。更优选,在此种1C81-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在d),e)和f)下定义的。同样,在此种1C81-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如,诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
例如,在根据该具体优选方面的1C81-样序列中：CDR1是氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)(其中CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)(其中CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的)；和/或CDR3为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(其中CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的)。特别是,当1C81-样序列根据该方面时：CDR1是氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)并且CDR2是氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)(其中CDR3如在上述f)下定义的)；和/或CDR1是氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)并且CDR3是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(其中CDR2如在上述e)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)并且CDR3是HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(其中CDR1如在上述d)下定义的)。同样,在此种1C81-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如,诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如,诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在特别优选的1C81-样序列中：CDR1是氨基酸序列RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34),CDR2是氨基酸序列AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)；并且CDR3是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)。
在该部分A)中描述的所有1C81-样序列中,构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地,所述构架序列是这样：所述构架序列与1C81的构架序列具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％,诸如至少95％序列同一性(其例如可以通过确定给定序列与1C81序列的序列同一性的整体程度同时在计算中忽略CDR’s来确定)。同样,存在于给定序列中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在一个特定的方面,1C81-样序列是与SEQ ID NO：6具有至少70％,诸如至少80％,例如至少85％,诸如至少90％或大于95％序列同一性的ISV。例如,在根据此方面的1C81-样序列中,CDR’s可以根据上文描述具体优选的方面,并且可以尤其(但不受限制)是RTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：34)(CDR1)；AIDWSDFN(SEQ ID NO：62)(CDR2)；和HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：90)(CDR3)。同样，优选地,存在于此种1C81-样ISV中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的1C81-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述1C81-样ISV具有小于250nM,更优选,小于200nM,175nM或甚至更小,诸如小于150nM或125nM或甚至更优选小于110nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在一个特定的方面,任意1C81-样序列可以是人源化和/或序列优化的序列,如本文中进一步描述的。
B)3C23-样序列：“3C23-样序列”,“3C23-样ISV”或“3C23-样结构单元”被定义为包含以下的ISV(如本文中描述的)：
a)CDR1，所述CDR1包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQID NO：40)或(ii)与氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，所述CDR2包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列AISSYGST(SEQID NO：68)或(ii)与氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AISSYGST(SEQ IDNO：68)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，所述CDR3包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)或(ii)与氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQID NO：96)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(如本领域中已知的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
优选地,在此种3C23-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的。更优选地,在此种3C23-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在a),b)和c)下定义的。同样，在此种3C23-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
例如,在此种3C23-样序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)(其中CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)(其中CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的)；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)(其中CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的)。特别是,当3C23-样序列根据该方面时：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)(其中CDR3如在上述c)下定义的)；和/或CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)(其中CDR2如在上述b)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQID NO：96)(其中CDR1如在上述a)下定义的)。同样，在此种3C23-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在特别优选的方面,“3C23-样序列”,“3C23-样ISV”或“3C23-样结构单元”是包含以下的ISV：
d)CDR1，所述CDR1是(i)氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)或(ii)与氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，所述CDR2是(i)氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)或(ii)与氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，所述CDR 3是(i)氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)或(ii)与氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
优选地,在根据该具体优选方面的3C23-样序列中,CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的。更优选,在此种3C23-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在d),e)和f)下定义的。同样，在此种3C23-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
例如,在根据该具体优选方面的3C23-样序列中：CDR1是氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)(其中CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)(其中CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的)；和/或CDR3是氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)(其中CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的)。特别是,当3C23-样序列根据此方面时：CDR1是氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)并且CDR2是氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)(其中CDR3如在f)下定义的)；和/或CDR1是氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)并且CDR3是氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)(其中CDR2如在上述e)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列AISSYGST并且CDR3是DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)(其中CDR1如在上述d)下定义的)。同样，在此种3C23-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在特别优选的3C23-样序列中：CDR1是氨基酸序列RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40),CDR2是氨基酸序列AISSYGST(SEQ ID NO：68)；并且CDR3是氨基酸序列DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)。
在该部分B)描述的所有3C23-样序列中,构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地,所述构架序列是这样：所述构架序列与3C23的构架序列具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％,诸如至少95％的序列同一性(所述序列同一性例如,可以通过确定给定序列与3C23序列的序列同一性的整体程度而在计算中忽略CDR’s来确定)。同样，存在于给定序列中的CDR’s和构架的组合优选地为这样：产生的3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在一个特定的方面,3C23-样序列是与SEQ ID NO：6具有至少70％,诸如至少80％,例如至少85％,诸如至少90％或大于95％序列同一性的ISV。例如,在根据这方面的3C23-样序列中,CDR’s可以根据上文描述的具体优选的方面,并且可以尤其(但不受限制)为RTFRHYAMG(SEQ ID NO：40)(CDR1)；AISSYGST(SEQ ID NO：68)(CDR2)；和DETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：96)(CDR3)。同样，优选地,存在于此种3C23-样ISV中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的3C23-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定,例如,诸如在实施例1.7或1.8中描述的。优选地,所述3C23-样ISV具有小于100nM,更优选,小于50nM,25nM或甚至更小,诸如小于20nM或15nM,10nM,8nM或甚至更优选小于5nM的IC50的调节活性；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定,例如,诸如在实施例1.11中描述的；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定,例如,诸如在实施例1.10中描述的。
在一个特定的方面,任何3C23-样序列可以是人源化和/或序列优化的序列,如本文中进一步描述的。
C)1C113-样序列：“1C113-样序列”,“1C113-样ISV”或“1C113-样结构单元”被限定为包含以下的ISV(如本文中描述的)：
a)CDR1，所述CDR1包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQID NO：35)或(ii)与氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，所述CDR2包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列DISPGGHT(SEQID NO：63)或(ii)与氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DISPGGHT(SEQ IDNO：63)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，所述CDR3包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQID NO：91)或(ii)与氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(如本领域中已知的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
优选地,在此种1C113-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的。更优选,在此种1C113-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在a),b)和c)下定义的。同样，在此种1C113-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
例如,在此种1C113-样序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)(其中CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)(其中CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的)；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)(其中CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的)。特别是,当1C113-样序列根据此方面时：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)(其中CDR3如在上述c)下定义的)；和/或CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)(其中CDR2如在上述b)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)(其中CDR1如在上述a)下定义的)。同样，在此种1C113-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
在特别优选的方面,“1C113-样序列”,“1C113-样ISV”或“1C113-样结构单元”是包含以下的ISV：
d)CDR1，所述CDR1是(i)氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)或(ii)与氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，所述CDR2是(i)氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)或(ii)与氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DISPGGHT仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，所述CDR 3是(i)氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)或(ii)与氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
优选地,在根据该具体优选方面的1C113-样序列中,CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的。更优选,在此种1C113-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在d),e)和f)下定义的。同样，在此种1C113-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
例如,在根据该具体优选方面的1C113-样序列中：CDR1是氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)(其中CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)(其中CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的)；和/或CDR3是氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)(其中CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的)。特别是,当1C113-样序列根据此方面时：CDR1是氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)并且CDR2是氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)(其中CDR3如在上述f)下定义的)；和/或CDR1是氨基酸序列IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)并且CDR3是氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)(其中CDR2如在上述e)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)并且CDR3是RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)(其中CDR1如在上述d)下定义的)。同样，在此种1C113-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
在特别优选的1C113-样序列中：CDR1是氨基酸序列IAFNYYSMS,CDR2是氨基酸序列DISPGGHT(SEQ ID NO：63)；并且CDR3是氨基酸序列RLRFEVSSNY(SEQ ID NO：91)。
在该部分C)中描述的所有1C113-样序列中,构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地,所述构架序列是这样：所述构架序列与1C113的构架序列具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％,诸如至少95％序列同一性(所述序列同一性,例如,可以通过确定给定序列与1C113的序列的序列同一性的整体程度同时在计算中忽略CDR’s来确定)。同样，存在于给定序列中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
在一个特定的方面,1C113-样序列是与SEQ ID NO：6具有至少70％,诸如至少80％,例如至少85％,诸如至少90％或大于95％序列同一性的ISV。例如,在根据此方面的1C113-样序列中,CDR’s可以根据上文描述的具体优选的方面,并且可以尤其(但不受限制)是IAFNYYSMS(SEQ ID NO：35)(CDR1)；DISPGGHT(SEQ ID NO：63)(CDR2)；和RLRFEVSSNY(SEQID NO：91)(CDR3)。同样，优选地,存在于此种1C113-样ISV的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的1C113-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,调节活性通过基于转染的HEK细胞的测定中ATP-诱导的CD62L脱落确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外化确定；或通过由人T细胞产生的ATP-诱导的CD62L脱落(PS)确定；或通过阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡确定。
在一个特定的方面,任意1C113-样序列可以是人源化和/或序列优化的序列,如本文中进一步描述的。
D)13A7-样序列：“13A7-样序列”,“13A7-样ISV”或“13A7-样结构单元”被定义为包含以下的ISV(如本文中描述的)：
a)CDR1，所述CDR1包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列YYDIG(SEQ IDNO：47)或(ii)与氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，所述CDR2包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)或(ii)与氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，所述CDR3包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)或(ii)与氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ IDNO：103)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(如本领域中已知的),通过基于细胞的测定(如本领域中已知的),通过体内测定。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
优选地,在此种13A7-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的。更优选地,在此种13A7-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在a),b)和c)下定义的。同样，在此种13A7-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
例如,在此种13A7-样序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)(其中CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)(其中CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的)；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)(其中CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的)。特别是,当13A7-样序列根据此方面时：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)(其中CDR3如在上述c)下定义的)；和/或CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)(其中CDR2如在上述b)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)(其中CDR1如在上述a)下定义的)。同样，在此种13A7-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在特别优选的方面,“13A7-样序列”,“13A7-样ISV”或“13A7-样结构单元”是包含以下的ISV：
d)CDR1，所述CDR1是(i)氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)或(ii)与氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，所述CDR 2是(i)氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)或(ii)与氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQID NO：75)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，所述CDR 3是(i)氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)或(ii)与氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
优选地,在根据该具体优选方面的13A7-样序列中,CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的。更优选,在此种13A7-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在d),e)和f)下定义的。同样，在此种13A7-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
例如,在根据该具体优选方面的13A7-样序列中：CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQ IDNO：47)(其中CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)(其中CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的)；和/或CDR3是氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)(其中CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的)。特别是,当13A7-样序列根据此方面时：CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)并且CDR2是氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(其中CDR3如在上述f)下定义的)；和/或CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47)并且CDR3是氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQID NO：103)(其中CDR2如在上述e)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)并且CDR3是GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)(其中CDR1如在上述d)下定义的)。同样，在此种13A7-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在特别优选的13A7-样序列中：CDR1是氨基酸序列YYDIG(SEQ ID NO：47),CDR2是氨基酸序列CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)；并且CDR3是氨基酸序列GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)。
在该部分D)中描述的所有13A7-样序列中,所述构架序列可以是如本文中进一步描述的。优选地,所述构架序列是这样，所述构架序列与13A7的构架序列具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％,诸如至少95％序列同一性(所述序列同一性,例如,可以通过确定给定序列与13A7的序列的序列同一性的整体程度同时在计算中忽略CDR’s来确定)。同样，存在于给定序列中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在一个特定的方面,13A7-样序列是与SEQ ID NO：6具有至少70％,诸如至少80％,例如至少85％,诸如至少90％或大于95％序列同一性的ISV。例如,在根据此方面的13A7-样序列中,CDR’s可以根据上文描述的具体优选的方面,并且可以尤其(但不受限制)是YYDIG(SEQ ID NO：47)(CDR1)；
CRFTNDGSTAYADSVKG(SEQ ID NO：75)(CDR2)；和
GPLTKRRQCVPGDFSMDF(SEQ ID NO：103)(CDR3)。同样，优选地,存在于此种13A7-样ISV中的CDR’s和构架的组合优选是这样：产生的13A7-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性由来自用13A7-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.3中描述的。优选地,所述13A7-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在一个特定的方面,任何13A7-样序列可以是人源化和/或序列优化的序列,如本文中进一步描述的。
E)14D5-样序列：“14D5-样序列”,“14D5-样ISV”或“14D5-样结构单元”被定义为包含以下的ISV(如本文中描述的)：
a)CDR1，所述CDR1包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列SYAMG(SEQ IDNO：46)或(ii)与氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，所述CDR2包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)或(ii)与氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，所述CDR3包含以下或基本上由以下组成：(i)氨基酸序列RVRYDY(SEQ IDNO：102)或(ii)与氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列RVRYDY仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(如本领域中已知的),通过基于细胞的测定(如本领域中已知的),通过体内测定。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
优选地,在此种14D5-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的。更优选地,在此种14D5-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在a),b)和c)下定义的。同样，在此种14D5-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
例如,在此种14D5-样序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)(其中CDR2和CDR3分别如在b)和c)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)(其中CDR1和CDR3分别如在a)和c)下定义的)；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RVRYDY(其中CDR1和CDR2分别如在a)和b)下定义的)。特别是,当14D5-样序列根据此方面时：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)并且CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)(其中CDR3如在上述c)下定义的)；和/或CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)(其中CDR2如在上述b)下定义的)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)(其中CDR1如在上述a)下定义的)。同样，在此种14D5-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在特别优选的方面,“14D5-样序列”,“14D5-样ISV”或“14D5-样结构单元”是包含以下的ISV：
d)CDR1，所述CDR1是(i)氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)或(ii)与氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)仅具有3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，所述CDR2是(i)氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)或(ii)与氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQID NO：74)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，所述CDR3是(i)氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)或(ii)与氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％或大于95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)仅具有7,6,5,4,3,2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于此种ISV中的构架序列如本文中进一步描述,并且其中CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
优选地,在根据该具体优选方面的14D5-样序列中,CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的。更优选,在此种14D5-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3分别全部如在d),e)和f)下定义的。同样，在此种14D5-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3，优选为这样：所述14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
例如,在根据该具体优选方面的14D5-样序列中：CDR1是氨基酸序列SYAMG(SEQ IDNO：46)(其中CDR2和CDR3分别如在e)和f)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)(其中CDR1和CDR3分别如在d)和f)下定义的)；和/或CDR3是氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)(其中CDR1和CDR2分别如在d)和e)下定义的).特别是,当14D5-样序列根据此方面时：CDR1是氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)并且CDR2是氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)(其中CDR3如在上述f)下定义的)；和/或CDR1是氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46)并且CDR3是氨基酸序列RVRYDY(SEQ ID NO：102)(其中CDR2如在上述e)下定义的)；和/或CDR2是氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)并且CDR3是RVRYDY(其中CDR1如在上述d)下定义的)。同样，在此种14D5-样序列中,CDR1,CDR2和CDR3优选为这样：所述14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在特别优选的14D5-样序列中：CDR1是氨基酸序列SYAMG(SEQ ID NO：46),CDR2是氨基酸序列RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)；并且CDR3是氨基酸序列RVRYDY(SEQ IDNO：102)。
在此部分E)中描述的所有14D5-样序列中,所述构架序列可以是如本文中进一步描述的。优选地,所述构架序列是这样：所述构架序列与14D5的构架序列具有至少80％,诸如至少85％,例如至少90％,诸如至少95％的序列同一性(所述序列同一性,例如,可以通过确定给定序列与14D5的序列的序列同一性整体程度同时在计算中忽略CDR’s确定)。同样，存在于给定序列中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在一个特定的方面,14D5-样序列是与SEQ ID NO：6具有至少70％,诸如至少80％,例如至少85％,诸如至少90％或大于95％序列同一性的ISV。例如,在根据此方面的14D5-样序列中,CDR’s可以根据上文描述的具体优选的方面,并且可以尤其(但不受限制)是SYAMG(SEQ ID NO：46)(CDR1)；RIYTGGTAWYEDSVKG(SEQ ID NO：74)(CDR2)；和RVRYDY(SEQ ID NO：102)(CDR3)。同样，优选地,存在于此种14D5-样ISV中的CDR’s和构架的组合优选为这样：产生的14D5-样ISV具有调节活性,所述调节活性可以通过本领域技术人员已知的任意合适的测定确定,诸如,例如,通过Αlphascreen测定(例如诸如本文中描述的)或通过基于细胞的测定(例如诸如本文中描述的)。
优选地,所述调节活性通过来自用14D5-样ISVs注射的小鼠的脾和肝细胞中ATP-诱导的CD27脱落或PS外化的调节来确定,例如,诸如在实施例2.2中描述的。优选地,所述14D5-样ISV具有调节活性，所述调节活性在实施例3中描述的抗-足细胞诱导的肾炎模型中确定。
在一个特定的方面,任何14D5-样序列可以是人源化和/或序列优化的序列,如本文中进一步描述的。
如在实施例1.5中描述的,本发明的ISVs可以通过如本文中描述的交叉-阻断分析被分为不同表位箱或家族。组A ISVs以1c81-样ISVs和1c113-样ISVs为代表,而组B ISVs以3c23-样ISVs为代表。
如在实施例1.4中描述的,本发明的ISVs可以基于交叉反应性的存在或缺失被分类。"人特异的"ISVs以3c23-样ISVs和1c113-样ISVs为代表；"人/大鼠/小鼠-特异的"ISVs以1c81-样ISVs为代表；"小鼠-特异的"ISVs以13A7-样ISVs和14D5-样ISVs为代表。
通常,免疫球蛋白单可变结构域(尤其是VHH序列和序列优化的免疫球蛋白单可变结构域)可以尤其特征在于在一个或多个构架序列(同样如本文中进一步描述的)中存在一个或多个“特征残基”(如本文中描述的)。
因此,通常,疫球蛋白单可变结构域可以被定义为具有以下(通用)结构的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4,并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3。
在优选的方面,本发明提供包含至少一个具有以下(通用)结构的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4,并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3,并且其中：
i)至少一个根据Kabat编号方法在位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基选自在以下表A-1中提到的特征残基；并且其中：
ii)所述氨基酸序列与在WO 2009/138519显示的免疫球蛋白单可变结构域(参见WO 2009/138519中SEQ ID NOs：1至125)中的至少一个具有至少80％,更优选90％,甚至更优选95％的氨基酸同一性,其中为了确定氨基酸同一性程度,忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列中以X表示)；并且其中：
iii)CDR序列通常如本文中进一步限定的(例如在表(B-2)中提供的组合中的CDR1,CDR2和CDR3,注意：CDR定义根据Kabat编号系统计算)。
表A-1：VHHs中的特征残基
Figure BDA0000663918210000791
Figure BDA0000663918210000801
同样,此种免疫球蛋白单可变结构域能够以任何合适的方式和从任何合适的来源衍生,并且可以例如是天然存在的VHH序列(即来自骆驼科的合适物种,例如美洲驼)或合成的或半合成的VHs或VLs(例如来自人)。此种免疫球蛋白单可变结构域可以包括“人源化”或另外“序列优化的”VHHs,“骆驼源化的”免疫球蛋白序列(并且尤其是骆驼源化的重链可变结构域序列,即骆驼源化VHs),以及通过技术诸如亲和力成熟(例如,从合成的,随机或天然存在的免疫球蛋白序列开始),源自不同免疫球蛋白序列的CDR接枝(grafting)、镶盖(veneering)、组合片段,使用重叠引物的PCR组装,和熟练技术人员公知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术来改变的人VHs,人VLs,骆驼科VHHs；或如本文中任意在前进一步描述的任意合适组合。
本发明提供特别适于结合P2X7的氨基酸残基区段(SEQ ID NO:s 34-47,SEQ IDNOs：62-75和SEQ ID NOs：90-103；表B-1)。这些氨基酸残基区段可以存在于,和/或可以并入本发明的多肽,尤其是以这种方式：它们形成本发明多肽的抗原结合位点(的部分)。这些氨基酸残基区段以针对P2X7产生的重链抗体或VHH序列的CDR序列产生。这些氨基酸残基区段在本文中也称为“本发明的CDR序列”(即分别为“本发明的CDR1序列”,“本发明的CDR2序列”和“本发明的CDR3序列”)。
然而应该注意：本发明在其最广的意义上不限于这些氨基酸残基区段在本发明多肽中可以具有的特定结构作用或功能,只要这些氨基酸残基区段让本发明的多肽以某种亲和力和效力(如本文中定义的)结合P2X7。因此,通常,本发明在其最广的意义上提供单价多肽(在本文中也称为“本发明的单价多肽”)，所述单价多肽能够以某指定的亲和力,亲合力,功效和/或效力结合P2X7并且包含一个或多个本文中描述的CDR序列并且,尤其是两个或多个此种CDR序列的合适组合,所述两个或多个此种CDR序列通过一个或多个另外的氨基酸序列彼此适当连接,从而整个多肽形成能够结合P2X7的结合结构域和/或结合单元。然而还应该注意，仅一个此种CDR序列存在于本发明的单价多肽可以由其自身已经足以为本发明的单价多肽提供结合P2X7的能力；例如同样对WO 03/050531中描述的所谓的“促进(Expedite)片段“进行引用。
因此,在特定的,但非限制性方面,本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基区段：
CDR1序列：
a)SEQ ID NO:s 34-47；
b)与氨基酸序列SEQ ID NOs：34-47中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
c)与氨基酸序列SEQ ID NOs：34-47中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段；
和/或
CDR2序列：
d)SEQ ID NOs：62-75；
e)与氨基酸序列SEQ ID NOs：62-75中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
f)与氨基酸序列SEQ ID NOs：62-75中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段；
和/或
CDR3序列：
g)SEQ ID NOs：90-103；
h)与氨基酸序列SEQ ID NOs：90-103中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
i)与氨基酸序列SEQ ID NOs：90-103中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段。
包含一个或多个上文指定的氨基酸残基区段的单价多肽显示改善的性质诸如例如改善的结合特性(适当测量和/或表达为KD-值(实际的或表观的),KA-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地为IC50值,如本文中进一步描述的),对P2X7改善的亲和力和/或改善的亲合力和/或对调节P2X7改善的功效和/或效力。
更特别是,包含一个或多个上文指定的氨基酸残基区段的本发明的单价多肽能够以亲和力(适当测量和/或表达为KD-值(实际的或表观的),KA-值(实际的或表观的),kon-速率和/或koff-速率,或备选地为IC50值,如本文中进一步描述的)结合蛋白P2X7，所述亲和力优选为这样，以致于它们：
-以1000nM至1nM或更小,优选地100nM至1nM或更小,更优选15nM至1nM或甚至10nM至1nM或更小的解离常数(KD)结合P2X7；
和/或所述亲和力优选为这样，以致于它们：
-以在104M-1s-1至约107M-1s-1之间,优选在105M-1s-1和107M-1s-1之间,更优选约106M- 1s-1或更大的kon-速率结合P2X7；
和/或所述亲和力优选为这样，以致于它们：
-以10-2s-1(t1/2＝0.69s)和10-4s-1之间(以多日的t1/2提供几乎不可逆的复合体),优选10-3s-1和10-4s-1之间,或更低的koff速率结合P2X7。
从本文中进一步描述和实施例，本发明的单价多肽对P2X7的结合的一些优选的IC50值将变得清楚。确定IC50的测定包括ELISA中的结合。
尤其是,本发明的单价多肽可以是包含一个抗原结合位点的单价多肽,其中所述抗原结合位点包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基区段：如上文描述的CDR1序列,CDR2序列和CDR3序列(或其任意合适组合)。然而,在优选的方面,本发明的单价多肽包含大于一个,诸如两个或多个选自由以下组成的组的氨基酸残基区段：本发明的CDR1序列,本发明的CDR2序列和/或本发明的CDR3序列。优选地,本发明的单价多肽包含三个选自由以下组成的组的氨基酸残基区段：分别是本发明的CDR1序列,本发明的CDR2序列和本发明的CDR3序列。在本文中作为对于本发明单价多肽优选的而被提及的CDR’s组合列于表B-1中。
应该注意本发明不限于关于本发明单价多肽的来源(或用于表达它的本发明的核酸来源),也不限于关于本发明单价多肽或核酸(或已经)产生或获得的方式。因此,本发明的单价多肽可以是天然存在的单价多肽(来自任何合适的物种)或合成的或半合成的单价多肽。
此外,对于熟练技术人员还将清楚的是，可能将一个或多个上文提到的CDR's"接枝"在其它"支架"上,包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。合适的支架和用于此种CDR接枝的技术对于熟练技术人员将是清楚的并且是本领域中公知的,参见例如US 7,180,370,WO 01/27160,EP 0605522,EP 0460167,US 7,054,297,Nicaise等人(ProteinScience 13：1882-1891,2004),Ewert等人(Methods 34：184-199,2004),Kettleborough等人(Protein Eng.4：773-783,1991),O’Brien和Jones(Methods Mol.Biol.207：81-100,2003),Skerra(J.Mol.Recognit.13：167-187,2000)和Saerens等人(J.Mol.Biol.352：597-607,2005)及其中引用的进一步参考文献。例如,本身已知的用于将小鼠或大鼠CDR’s接枝在人构架和支架上的技术能够以类似的方式使用以提供嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含一个或多个本文中对于本发明的单价多肽定义的CDR序列和一个或多个人构架区或序列。用于呈递氨基酸序列的合适的支架对于熟练技术人员将是清楚的,并且例如包含,不限于,基于或源自免疫球蛋白(即除了在本文中已经描述的免疫球蛋白序列之外)的结合支架,源自蛋白A结构域(诸如AffibodiesTM)的蛋白支架,淀粉酶抑肽(tendamistat),纤连蛋白(fibronectin),脂笼蛋白(lipocalin),CTLA-4,T-细胞受体,设计的锚蛋白重复,avimers和PDZ结构域(Binz等人Nat.Biotech.,23：1257,2005),和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等人Comb.Chem.High Throughput Screen 9：619-32,2006)。
在本发明的所述单价多肽中,CDR’s可以通过氨基酸序列连接于另外的氨基酸序列和/或可以彼此连接,其中所述氨基酸序列优选为构架序列或是用作构架序列的氨基酸序列,或一起形成支架用于呈递CDR’s。
根据优选的,但非限制性实施方案,本发明的单价多肽包含连接于至少两个构架序列的至少三个CDR序列,其中优选三个CDR序列中至少一个是CDR3序列,其它两个CDR序列是CDR1或CDR2序列,并且优选地为一个CDR1序列和一个CDR2序列。根据一个特别优选的,但非限制性实施方案,本发明的单价多肽具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中CDR1,CDR2和CDR3为如本文中对于本发明单价多肽定义的,并且FR1,FR2,FR3和FR4是构架序列。在本发明的此种单价多肽中,所述构架序列可以是任何合适的构架序列,并且例如基于标准手册和本文中提到的进一步公开和现有技术，合适的构架序列的实例对于熟练技术人员将是清楚的。
因此,本发明还涉及针对P2X7的单价多肽，所述单价多肽基本上由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成,其中：
CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs：34-47；
b)与氨基酸序列SEQ ID NOs：34-47中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
c)与氨基酸序列SEQ ID NOs：34-47中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段；
和/或
CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs：62-75；
e)与氨基酸序列SEQ ID NOs：62-75中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
f)与氨基酸序列SEQ ID NOs：62-75中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段；
和/或
CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs：90-103；
h)与氨基酸序列SEQ ID NOs：90-103中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
i)与氨基酸序列SEQ ID NOs：90-103中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段。
尤其是,根据该优选的但非限制性方面,本发明涉及针对P2X7的单价多肽，所述单价多肽由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成,其中：
CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQ ID NOs：34-47；
b)与氨基酸序列SEQ ID NOs：34-47中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
c)与氨基酸序列SEQ ID NOs：34-47中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段；
和
CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQ ID NOs：62-75；
e)与氨基酸序列SEQ ID NOs：62-75中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
f)与氨基酸序列SEQ ID NOs：62-75中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段；
和
CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQ ID NOs：90-103；
h)与氨基酸序列SEQ ID NOs：90-103中至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列区段；
i)与氨基酸序列SEQ ID NOs：90-103中至少一个具有3,2,或1个氨基酸差异的氨基酸序列区段。
本发明还涉及单价多肽，其中CDR序列与氨基酸序列SEQ ID NOs：6-19中至少一个的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性,优选至少80％氨基酸同一性,更优选至少90％氨基酸同一性,诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至(基本上)100％氨基酸同一性。
在一个特定的,但非限制性方面,本发明的单价多肽可以是包含免疫球蛋白折叠单价多肽或在合适条件下(诸如生理条件)能够形成免疫球蛋白折叠(即通过折叠)的单价多肽。除其他外，对Halaby等人的综述(J.Protein Eng.12：563-71,1999)进行引用。优选地,当正确折叠从而形成免疫球蛋白折叠时,氨基酸残基区段可以能够正确形成结合P2X7的抗原结合位点。
因此,所述构架序列优选为免疫球蛋白构架序列或已经源自免疫球蛋白构架序列的构架序列(和合适组合)(例如,通过序列优化诸如人源化或骆驼源化)。例如,所述构架序列可以是源自免疫球蛋白单可变结构域诸如轻链可变结构域(例如VL-序列)和/或源自重链可变结构域(例如VH-序列)的构架序列。在一个特别优选的方面,所述构架序列是已经源自VHH-序列的构架序列(其中所述构架序列可以任选地被部分或完全人源化)或是已经被骆驼源化(如本文中定义的)的常规VH序列。
所述构架序列可以优选地是这样：本发明的单价多肽是免疫球蛋白单可变结构域诸如结构域抗体(或适于用作结构域抗体的氨基酸序列)；是单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的氨基酸)；是"dAb"(或适于用作dAb的氨基酸)；或是
Figure BDA0000663918210000871
(包括但不限于VHH)。同样，例如基于标准手册和本文中提到的进一步公开和现有技术，合适的构架序列对于熟练技术人员将是清楚的。
尤其是,存在于本发明单价多肽中的构架序列可以含有一个或多个特征残基(如在WO 08/020079(表A-3至A-8)中定义的),从而本发明的单价多肽是纳米抗体。从本文中进一步的公开，此种构架序列(的合适组合)的一些优选的,但非限制性实例将变得清楚(参见例如表B-1)。通常,纳米抗体(尤其是VHH序列和部分人源化纳米抗体)可以尤其是特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“特征残基”(如在例如在WO 08/020079,第61页,第24行至第98页,第3行中进一步描述的)。
更特别是,纳米抗体可以是具有以下(通用)结构的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4,并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3,并且其：
i)与氨基酸序列SEQ ID NO:s 6-19(参见表B-3)中至少一个具有至少80％氨基酸同一性,其中为了确定氨基酸同一性的程度,形成CDR序列的氨基酸残基被忽略。在这方面,也对表B-1进行参考,所述表B-1列出SEQ ID NOs：6-19的免疫球蛋白单可变结构域(参见表B-3)的构架1序列(SEQ ID NOs：20-33),构架2序列(SEQ ID NOs：48-61),构架3序列(SEQID NOs：76-89)和构架4序列(SEQ ID NOs：104-117)；或
ii)表B-1中描述的构架序列的组合；
并且其中：
iii)优选根据Kabat编号方法在位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自WO 08/020079的表A-3至表A-8中提到的特征残基。
在优选的方面,本发明提供选自SEQ ID NO’s：6-19任一项的免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽。
本发明还提供属于如SEQ ID NO’s：6-19的免疫球蛋白单可变结构域中任一个的相同表位箱的单价多肽。因此,本发明还涉及针对P2X7的单价多肽,所述单价多肽交叉阻断SEQ ID NO’s：6-19的免疫球蛋白单可变结构域中至少一个对P2X7的结合和/或所述单价多肽与P2X7的结合被SEQ ID NO’s：6-19的免疫球蛋白单可变结构域中至少一个交叉阻断。
同样,此种单价多肽可以是以任意合适的方式和从任意合适的来源衍生的免疫球蛋白单可变结构域,并且可以例如是天然存在的VHH序列(即来自骆驼科的合适物种)或合成的或半合成的氨基酸序列,包括但不限于“人源化”(如本文中定义的)纳米抗体或VHH序列,“骆驼源化的”(如本文中定义的)免疫球蛋白序列(和尤其是骆驼源化的重链可变结构域序列),以及已经通过技术诸如亲和力成熟(例如,从合成的,随机或天然存在的免疫球蛋白序列开始),CDR接枝、镶盖、组合源自不同免疫球蛋白序列的片段,使用重叠引物的PCR组装,和熟练技术人员公知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术获得的纳米抗体；或如本文中之前任意进一步描述的任意合适组合。同样,当免疫球蛋白单可变结构域包含VHH序列时,所述免疫球蛋白单可变结构域可以被适当人源化,如本文中进一步描述的,从而提供一个或多个本发明的进一步(部分或完全)人源化免疫球蛋白单可变结构域。类似地,当免疫球蛋白单可变结构域包含合成的或半合成的序列(诸如部分人源化序列)时,所述免疫球蛋白单可变结构域可以任选地被进一步适当人源化,同样如本文中描述的,同样从而提供一个或多个本发明的进一步(部分或完全)人源化免疫球蛋白单可变结构域。
本发明的这些单价多肽,并且尤其是包含本发明CDR序列的免疫球蛋白单可变结构域特别适于用作用于制备多价多肽的结构单元或结合单元。
因此,结合P2X7的本发明的单价多肽可以是基本上分离的形式(如本文中定义的),或它们可以形成蛋白或多肽的部分,所述蛋白或多肽可以包含一个或多个结合P2X7的单价多肽或基本上由一个或多个结合P2X7的单价多肽组成并且其可以任选地进一步包含一个或多个进一步的氨基酸序列(全部任选地通过一个或多个合适的接头连接)。本发明还涉及包含一个或多个本发明的单价多肽(或其合适的片段)或基本上由一个或多个本发明的单价多肽(或其合适的片段)组成的蛋白或多肽。
一个或多个本发明的单价多肽因此在此种蛋白或多肽用作结合单元或结构单元,从而分别提供本发明的单价,多价或多互补位多肽,全部如本文中描述的。本发明因此还涉及多肽，所述多肽是是包含一个本发明单价多肽或基本上由一个本发明单价多肽组成的单价构建体。本发明因此还涉及多肽，所述多肽是多价多肽,诸如例如包含两个或多个本发明的单价多肽或基本上由两个或多个本发明的单价多肽组成的双价或三价多肽(对于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备,还对Conrath等人,J.Biol.Chem.276：7346-7350,2001,以及例如WO 96/34103,WO 99/23221和WO 2010/115998进行参考)。
如从上文和本文中进一步的描述将清楚的,本发明的氨基酸序列(或ISV’s)可以用作“结构单元”以形成本发明的多肽,即通过将它们彼此适当组合，将一个或多个与本发明的其它氨基酸序列和/或与一个或多个其它基团,残基,部分或结合单元适当组合,从而形成如本文中描述的化合物或构建体(诸如,不受限制,本文中描述的本发明的双互补位,双/多价和双/多特异性多肽)，所述化合物或构建体将一个或多个所需性质或生物功能合并在一个分子内。
本发明提供的阻断性多肽或ISVs优先减少炎症,诸如MS或肾炎。
因此,本发明提供多肽，所述多肽包含两个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由两个或多个免疫球蛋白单可变结构域组成，其每个特异结合P2X7,优选人P2X7(本文中被称为“P2X7”)。此种多肽在本文中也称为“本发明的多价的多肽”。两个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以任选地通过一个或多个肽接头连接。
优选地,所述多价多肽包含两个或多个针对P2X7免疫球蛋白单可变结构域,其中针对P2X7的“第一”免疫球蛋白单可变结构域并且针对P2X7的“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有相同或不同的互补位。后一多肽在本文中也被称为“本发明的多互补位多肽”。因此,本发明涉及多肽，所述多肽包含两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域或由两个或多个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域组成,其中针对P2X7的“第一”免疫球蛋白单可变结构域和针对P2X7的“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同互补位。此种多肽包含两个或多个针对P2X7上不同表位的免疫球蛋白单可变结构域或由两个或多个针对P2X7上不同表位的免疫球蛋白单可变结构域组成。更具体地,此种多肽包含至少一个针对P2X7上第一表位的“第一”免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对不同于P2X7上第一表位的P2X7上第二表位的“第二”免疫球蛋白单可变结构域。优选地,本发明的这些多互补位多肽是双互补位或三互补位多肽(在本文中也称为“本发明的双互补位多肽”和“本发明的三互补位多肽”),如在本文中进一步定义的。特别是根据本发明的优选的双互补位多肽是本文中描述的实施例和表B-4中显示的那些。
含有至少两种纳米抗体的本发明的多肽(其中至少一种纳米抗体针对第一抗原(即针对P2X7)并且至少一种纳米抗体针对第二抗原(即不同于P2X7))将也被称为本发明的“多特异性”多肽,并且存在于此种多肽中的纳米抗体将在本文中被称为为“多特异性形式”。因此,例如,本发明的“双特异性”多肽是包含至少一种针对第一抗原(即P2X7)的纳米抗体和至少一种针对第二抗原(即不同于P2X7)的进一步的纳米抗体的多肽,然而本发明的“三特异性”多肽包含至少一种针对第一抗原(即P2X7)的纳米抗体,至少一种针对第二抗原(即不同于P2X7)的进一步纳米抗体和至少一种针对第三抗原(即不同于P2X7,和第二抗原二者)的进一步纳米抗体的多肽；等等。
因此,在其最简单的形式中,本发明的双特异性多肽是本发明的双价多肽(如本文中定义的),所述双价多肽包含针对P2X7的第一纳米抗体,和针对第二抗原的第二纳米抗体,其中所述第一和第二纳米抗体可以任选地通过接头序列连接(如本文中定义的)；然而其最简单形式的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文中定义的),所述三价多肽包含针对P2X7的第一纳米抗体,针对第二抗原的第二纳米抗体和针对第三抗原的第三纳米抗体,其中所述第一,第二和第三纳米抗体可以任选地通过一个或多个,并且尤其是一个和多个,尤其是两个,接头序列连接。
含有至少两种针对P2X7的纳米抗体的本发明的多肽(其中至少一个“第一”纳米抗体针对P2X7(例如hP2X7)的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象；并且其中至少一种“第二”纳米抗体针对所述P2X7(例如hP2X74)不同于第一个的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象,将也被称为本发明的“多互补位”多肽,并且存在于此种多肽中的纳米抗体在本文中也将被称为为“多互补位形式”。因此,例如,本发明的“双互补位”多肽是这样的多肽，所述多肽包含至少一种针对抗原(即P2X7)的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的纳米抗体和至少一种针对所述抗原(即相同P2X7)不同于第一个的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的进一步纳米抗体,而本发明的“三互补位”多肽是这样的多肽，所述多肽包含至少一种针对抗原(即P2X7)的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的纳米抗体,至少一种针对所述抗原(即相同P2X7)不同于第一个的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的进一步纳米抗体,和至少中针对抗原(即相同P2X7)但不同于所述第一和所述第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的抗原的第三抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的进一步纳米抗体；等等。
因此,在其最简单的形式中,本发明的双互补位多肽是本发明的双价多肽(如本文中定义的),所述双价多肽包含针对P2X7的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的第一纳米抗体,和针对所述P2X7不同于第一个的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的第二纳米抗体,其中所述第一和所述第二纳米抗体可以任选地通过接头序列连接(如本文中定义的)；而其最简单形式的本发明的三互补位多肽是本发明的三价多肽(如本文中定义的),所述三价多肽包含针对P2X7的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的第一纳米抗体,针对所述P2X7不同于第一个的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的第二纳米抗体,和针对相同P2X7但不同于所述第一和所述第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的第三抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象的第三纳米抗体,其中所述第一,第二和第三纳米抗体可以任选地通过一个或多个,并且尤其是一个和多个,尤其是两个,接头序列连接。
然而,如从上文描述将清楚的,在本发明的多特异性多肽可以包含至少一种针对P2X7的纳米抗体,和任意数量的针对一个或多个不同于P2X7的抗原的纳米抗体的意义上，本发明不限于其中。
此外,尽管包括在本发明的范围内的是本发明的多肽中各种纳米抗体的特定顺序和排列可以对本发明最终多肽的性质有一些影响(包括但不限于对P2X7,或针对一个或多个其它抗原的亲和力,特异性或亲合力),但所述顺序或排列通常不是决定性的并且可以由熟练技术人员任选地在有限的常规实验之后基于本文中公开的内容适当选择。因此,当对本发明的特定多价或多特异性多肽进行参考时,应该注意这包括相关纳米抗体的任意顺序或排列,除非另有明确说明。
最后,还在本发明范围内的是，本发明的多肽含有两个或多个纳米抗体和一个或多个另外的氨基酸序列(如本文中提到的)。
对于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备,还对Conrath等人,J.Biol.Chem.,第276卷,10.7346-7350,2001；Muyldermans,Reviews in MolecularBiotechnology 74(2001),277-302；以及对例如WO 96/34103和WO 99/23221进行参考。本发明的一些特定多特异性和/或多价多肽的一些其它实例可以在本文中提到的AblynxN.V.的申请中找到。
本发明的化合物或多肽可以通常通过这样的方法制备，所述方法包括至少一个任选地通过一个或多个合适的接头适当将一个或多个本发明的氨基酸序列(或ISV’s)连接于一个或多个进一步基团,残基,部分或结合单元的步骤,从而提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法制备，所述方法通常包括至少提供编码本发明的多肽的核酸,以合适的方式表达所述核酸,和回收表达的本发明多肽的步骤。此种方法能够以对于熟练技术人员将清楚的本身已知的方式进行,例如基于本文中进一步描述的方法和技术。
对于熟练技术人员将清楚的是，本文中以“优选的”(或“更优选的”,“甚至更优选的”等)提到的纳米抗体(或ISV’s)也优选的(或更优选的,或甚至优选的,等)用于本文中描述的多肽。因此,包含一个或多个本发明“优选的”纳米抗体(或ISV’s)或基本上由一个或多个本发明“优选的”纳米抗体(或ISV’s)组成的多肽将通常是优选的,并且包含一个或多个本发明“更优选的”纳米抗体(或ISV’s)或基本上由一个或多个本发明“更优选的”纳米抗体(或ISV’s)组成的多肽将通常是更优选的等。
在本发明一个特定的方面,与本发明的相应氨基酸序列相比，包含至少一种本发明纳米抗体(或ISV)的本发明的纳米抗体(或ISV)或本发明的化合物,构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文中的进一步公开，此种纳米抗体(或ISV’s),化合物和多肽的一些优选的,但非限制性实例对于熟练技术人员将变得清楚,并且例如包括被化学修饰以增加其半衰期的本发明的纳米抗体(或ISV’s)序列或多肽(例如,通过peg化)；包含至少一个用于结合血清蛋白(诸如血清白蛋白,参见例如EP 0 368 684 B1,第4页)的另外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包含至少一种连接于至少一个增加本发明纳米抗体(或ISV)的半衰期的部分(并且尤其是至少一个氨基酸序列)的本发明纳米抗体(或ISV)的本发明的多肽。基于本文中的进一步公开，包含此种半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例对于熟练技术人员将是清楚的；并且例如包括,不限于，其中本发明的一个或多个纳米抗体(或ISV’s)合适连接于一个或多个血清蛋白或其片段(诸如血清白蛋白或其合适的片段)或连接于一个或多个能够结合血清蛋白的结合单元(诸如,例如,能够结合血清蛋白诸如血清白蛋白,血清免疫球蛋白诸如IgG,或转铁蛋白(transferrine)的纳米抗体(或ISV’s)或(单)结构域抗体)的多肽；其中本发明的纳米抗体(或ISV)连接于Fc部分(诸如人Fc)或其合适的部分或片段的多肽；或其中一个或多个本发明的纳米抗体(或ISV’s)合适连接于一个或多个能够结合血清蛋白的小蛋白或肽的多肽(诸如,不限于在WO 91/01743,WO01/45746,WO 02/076489和2006年12月5日提交的命名为"Peptides capable of bindingto serum proteins"的Ablynx N.V.的美国临时申请(还参见PCT/EP/2007/063348)中描述的蛋白和肽)。
同样,如对于熟练技术人员将清楚的,此种纳米抗体(或ISV’s),化合物,构建体或多肽可以含有一个或多个另外的基团,残基,部分或结合单元,诸如一个或多个另外的氨基酸序列并且尤其是一个或多个另外的纳米抗体(或ISV’s)(即不针对P2X7),从而提供三或多特异性纳米抗体(或ISV)构建体。
通常,具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或ISV’s)(或包含所述纳米抗体(或ISV’s)的化合物,构建体或多肽)优选地具有至少1.5倍,优选至少2倍,诸如至少5倍,例如至少10倍或大于20倍于本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期的半衰期。例如,具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或ISV’s),化合物,构建体或多肽可以具有与本发明的相应氨基酸序列本身相比增加大于1小时,优选大于2小时,更优选大于6小时,诸如大于12小时,或甚至大于24,48或72小时的半衰期。
在本发明的优选的,但非限制性方面,本发明的此种纳米抗体(或ISV’s),化合物,构建体或多肽呈现至少约12小时,优选至少24小时,更优选至少48小时,甚至更优选至少72小时或更多的人中血清半衰期。例如,本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5至10天),优选至少9天(诸如约9至14天),更优选至少约10天(诸如约10至15天),或至少约11天(诸如约11至16天),更优选至少约12天(诸如约12至18天或更多),或大于14天(诸如约14至19天)的半衰期。
在本发明的另一个方面,本发明的多肽包含一个或多个(诸如两个或优选一个)本发明的纳米抗体(或ISV’s)，所述本发明的纳米抗体(或ISV’s)(任选地通过一个或多个合适的接头序列)连接于一个或多个(诸如两个并且优选一个)允许产生的本发明的多肽跨血脑屏障的氨基酸序列。尤其是,所述一个或多个允许产生的本发明的多肽跨血脑屏障的氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个并且优选一个)纳米抗体(或ISV’s),诸如在WO 02/057445(其中FC44(WO 06/040153的SEQ ID NO：189)和FC5(WO 06/040154的SEQ ID NO：190)是优选的实例)中描述的纳米抗体(或ISV’s)。
通常，为制药的目的，本发明的多肽可以配制成包含至少一个本发明的多肽和至少一种药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，以及任选的一种或多种其它的药学活性多肽和/或化合物的药物制剂或组合物。通过非限制性的实例，这种制剂可以是适合于口服给药，肠胃外给药(例如通过静脉、肌肉内或皮下注射或静脉输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴、植入物、栓剂给药等的形式，其中优选肠胃外给药。这种合适的给药形式-其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式-以及用于制备它的方法和载体，对本领域技术人员来说是清楚的，并且在本文中进一步描述。这种药物制剂或组合物通常在本文中被称为“药物组合物”。用于非人生物体中的药物制剂或组合物通常在本文中被称为“兽药组合物”。
因此，在另一个方面，本发明涉及包含至少一个本发明的氨基酸，至少一个本发明的多肽或至少一个本发明的多肽和至少一种适合的载体、稀释剂或赋形剂(即适合于制药用途的)，以及任选的一种或多种其它活性物质的药物组合物。
通常，本发明的多肽能够以本身已知的任何适合的方式配制和给药。例如参考上文引用的一般背景技术(特别是WO 04/041862,WO 04/041863,WO 04/041865,WO 04/041867和WO 08/020079)以及标准手册，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,USA(1990)，Remington,the Science&Practice ofPharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins(2005)；或Handbook of TherapeuticAntibodies(S.Dubel,Ed.),Wiley,Weinheim,2007(例如参考第252-255页)。
本发明的多肽能够以用于常规抗体和抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)及其它药物活性蛋白的本身已知的任何适合的方式配制和给药。这些配方和制备它的方法对本领域技术人员来说是清楚的，例如包括适合于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、腔内、动脉内或鞘内给药)或适合于局部(即透皮或皮内)给药的制剂。
用于肠胃外给药的制剂可以是例如适合于输注或注射的无菌溶液剂、混悬剂、分散液或乳剂。用于这种制剂的适合的载体或稀释剂例如包括但不限于WO 08/020079第143页提及的那些。在一个实施方案中，所述制剂是水溶液或混悬剂。
本发明的多肽可以用从基因治疗已知的递送方法给药，参见例如美国专利No.5,399,346，其基因治疗递送方法通过引用的方式被合并。通过使用基因治疗递送方法，用编码本发明的氨基酸序列、多肽的基因转染的原代细胞可以另外用组织特异性启动子转染以靶向特定器官、组织、移植物、肿瘤、或细胞，且可以另外用于亚细胞局部表达的信号和稳定化序列转染。
因此，本发明的多肽可以与药学可接受的载体例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体组合进行系统性给药，例如口服。它们可以被包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以被压缩成片剂，或者可以直接掺入患者饮食的食物中。对于口服治疗剂给药，本发明的多肽可以与一种或多种赋形剂组合，以可摄取的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等的形式使用。这种组合物和制剂应当包含至少0.1％的本发明的多肽。它们在组合物和制剂中的百分比，当然，可以不同且可以方便地为给定单位剂型重量的约2至约60％之间。在这种有治疗作用的组合物中本发明的多肽的量使得能够获得有效的剂量水平。
对于肿瘤切除位点的局部给药，本发明的多肽可以用在生物可降解的聚合物药物递送系统、缓慢释放的聚乳酸乙醇酸共聚物制剂等中(Hart等,Cochrane Database SystRev.2008 Jul 16；(3):CD007294)。
在本发明的另一个优选方面，本发明的多肽，例如基本上由一个单价抗人P2X7免疫球蛋白单可变结构域和一个单价抗人血清白蛋白单可变结构域通过GS接头连接组成的多肽，与常规的抗体例如IgG相比可以在实体瘤中具有有利的分布和动力学特性。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂和甜味剂或矫味剂，例如WO 08/020079第143-144页提及的那些。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的物质之外，其还可以包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在或者以另外方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含本发明的多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和矫味剂例如樱桃或橙子香精。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质应当是药学可接受的并且在其使用量上是基本上无毒的。此外，本发明的多肽能够结合到持续释放制剂和装置中。
口服给药的制剂和剂型还可以具有肠溶包衣，其使得本发明的构建体能够抵抗胃部环境，并进入肠道。更通常地，口服给药的制剂和剂型可以适当地配制为递送到胃肠道的任何希望的部分。此外，可以使用适合的栓剂递送至胃肠道。
本发明的多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内给药。特定的实例在WO08/020079第144和145页或在PCT/EP2010/062975(整个文档)中进一步描述。
对于局部给药，本发明的多肽能够以纯的形式应用，即当其是液体时。但是，通常希望将它们与皮肤可接受的载体组合，以组合物或制剂的形式向皮肤施用，所述组合物或制剂可以是固体或液体。特定的实例在WO 08/020079第145页进一步描述。
通常，本发明的多肽在液体组合物，例如洗液中的浓度为约0.1-25wt-％，优选约0.5-10wt-％。在半固体或固体组合物例如凝胶或粉末中的浓度为约0.1-5wt-％，优选约0.5-2.5wt-％。
用于治疗的本发明的多肽的所需要量不仅随所选择的特定多肽有所不同，而且随给药途径，要治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况有所不同，最终由监护医师或临床医生决定。而且本发明的多肽的剂量根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物、或器官而不同。
所希望的剂量可以方便地制成单剂量或以适当间隔给药，例如每天两次、三次、四次或更多次亚剂量的分剂量。这种亚剂量本身可以进一步分为例如多个不连续的松散间隔的给药。
给药方案可以包括长期的、每天的治疗。“长期”指至少两周且优选持续数周、数月、或数年。在此剂量范围内必要的改变可以由本领域技术人员仅使用本文中给出教导的常规实验确定。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),MackPublishing Co.,Easton,PA。剂量还可以由医生个人在发生任何并发症的时候调整。
在另一方面，本发明涉及预防和/或治疗与P2X7相关的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用药学活性量的本发明的多肽，和/或包含它的药物组合物。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，通常还包括预防疾病的发生，减慢或逆转疾病的发展，预防或减慢与疾病相关的一种或多种症状的发生，减少和/或减轻与疾病相关的一种或多种症状，减少疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防，减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及一般地对要治疗的患者有益的任何药理作用。
要治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，更特别是人。如本领域技术人员清楚的，要治疗的受试者特别是患有本文提及的疾病和病症或者具有其患病风险的人。
本发明涉及预防和/或治疗至少一种与P2X7相关、与其生物学活性或药学活性相关和/或与其中涉及P2X7的生物学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用药学活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的多肽、和/或包含其的本发明的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗可以通过调节P2X7、其生物学活性或药学活性、和/或其中涉及P2X7的生物学途径或信号传导来治疗的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用药学活性量的本发明的多肽、和/或包含其的本发明的药物组合物。在一个实施方案中，所述药学有效量可以是足以调节P2X7、其生物学活性或药学活性、和/或其中涉及P2X7的生物学途径或信号传导的量；和/或使得循环中的本发明的多肽的水平足以调节P2X7、其生物学活性或药学活性和/或其中涉及P2X7的生物学途径或信号传导的量。
在一个实施方案中，本发明的涉及预防和/或治疗能够通过将本发明的多肽，或编码它的本发明的核苷酸构建体，和/或包含它的药物组合物给患者施用从而预防和/或治疗的至少一种疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给有需要的受试者施用药学活性量的本发明的多肽，或编码它的本发明的核苷酸构建体，和/或包含它的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种可以通过抑制要治疗的受试者的特定细胞或特定组织中ATP对P2X7的结合(并且尤其是,通过抑制MS患者中ATP对P2X7的结合)预防和/或治疗的疾病或病症的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用药学活性量的本发明的多肽,或编码所述多肽的本发明的核苷酸构建体,和/或包含所述多肽的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文所列出的疾病和病症组成的组的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用本发明的多肽，或编码所述多肽的本发明的核苷酸构建体，和/或包含所述多肽的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于免疫治疗，并且特别是用于被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有本文提及的疾病和病症或具有其患病风险的受试者施用药学活性量的本发明的多肽，或编码所述多肽的本发明的核苷酸构建体，和/或包含所述多肽的药物组合物。
在上述方法中，本发明的氨基酸序列、多肽和/或包含其的组合物能够以任何适当的方式给药，这取决于所使用的特定的药物制剂或组合物。因此，本发明的多肽和/或包含所述多肽的组合物例如可以口服，腹膜内(例如静脉内、皮下、肌肉内、或者通过任何其它避开胃肠道的给药途径)，鼻内，透皮，局部，以栓剂的方式，通过吸入给药，这也依赖于所使用的特定药物制剂或组合物。临床医生将能够选择适合的给药途径和这种给药中所使用的适合的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生熟知的其它因素。
根据适合于预防和/或治疗要预防或治疗的疾病或病症的治疗方案，施用本发明的多肽和/或包含所述多肽的组合物。临床医生通常能够确定适合的治疗方案，这依赖于下述因素：例如要预防或治疗的疾病或病症，要治疗的疾病的严重程度和/或其症状的严重程度，要使用的本发明的多肽，要使用的特定的给药途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、一般状况，以及临床医生熟知的类似因素。
通常，治疗方案包括以一种或多种药学有效量或剂量施用一种或多种本发明的多肽，或一种或多种包含所述多肽的组合物。待施用的特定的量或剂量可以由临床医生确定，这也是基于上述举出的因素。
通常，为了预防和/或治疗本发明提及的疾病和病症且依赖于要治疗的特定疾病或病症，要使用的本发明的特定多肽的功效，所使用的特定给药途径和特定药物制剂或组合物，本发明的多肽通常以每天每kg体重1克至0.01微克之间的量给药，优选每天每kg体重0.1克至0.1微克，例如每天每kg体重约1,10,100或1000微克，或者以每日单次剂量连续给药(例如通过输注)，或者在一天之中以多个分剂量给药。临床医生通常能够确定适合的日剂量，这取决于本文提及的因素。还将清楚的是，在特定的情况下，临床医生会选择偏离这些量，例如基于上述举出的因素以及他的专业判断。通常，可以从以基本相同的途径给药的针对相同靶的可比较的常规抗体或抗体片段的通常给药量获得对于给药量的一些指导，但是应考虑亲和力/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期和本领域技术人员熟知的类似因素。
在一个实施方案中，使用单个本发明的连续多肽。在一个实施方案中，组合使用两个以上本发明的多肽。
本发明的多肽可以与一种或多种其它药学活性化合物或成分组合使用，即作为组合治疗方案，其可以不导致或导致协同效果。而且，临床医生能够根据上述举出的因素和他的专业判断选择这种其它的化合物或成分，以及适合的组合治疗方案。
特别地，本发明的多肽可与其它用于或能够用于预防和/或治疗本文举出的疾病和病症的药学活性化合物或成分组合使用，其结果是不获得或获得协同效果。这种化合物和成分，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物的实例对临床医生来说将是清楚的。
能够以用于所涉及的疾病或失调的任何本身已知的方式确定和/或跟踪根据本发明使用的治疗方案的效果，如临床医生所清楚的。临床医生还能够，在合适时且根据具体病例，改变或修改特定的治疗方案，以获得所希望的治疗效果，以避免、限制或减少不希望的副作用，和/或在一方面获得所希望的治疗效果和另一方面避免、限制或减少不希望的副作用之间获得适度的平衡。
通常，跟踪治疗方案直至获得所希望的治疗效果和/或达到维持所希望的治疗效果之时。而且，这可以由临床医生确定。
在另一方面，本发明涉及本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗与P2X7相关的至少一种疾病和病症；和/或用于在一种或多种本文提及的治疗方法中使用的药物组合物中的用途。
要治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，更特别是人。在兽药应用中，要治疗的受试者包括为商业目的饲养的或作为宠物的任何动物。如本领域技术人员清楚的，要治疗的受试者特别是患有本文提及的疾病和病症或者具有其患病风险的人。
本发明涉及本发明的多肽，或编码所述多肽的核苷酸在制备用于预防和/或治疗至少一种能通过给患者施用本发明的多肽，或编码所述多肽的核苷酸，和/或所述多肽的药物组合物预防和/或治疗的疾病或病症的药物组合物中的用途。
更特别地，本发明涉及本发明的多肽或编码所述多肽的核苷酸在制备用于预防和/或治疗与P2X7相关的疾病和病症，特别是用于预防和治疗一种或多种本文列出的疾病和病症的药物组合物中的用途。
而且，在这种药物组合物中，一种或多种本发明的多肽，或编码所述多肽的核苷酸，和/或所述多肽的药物组合物还可以适当地与一种或多种其它有效成分(例如本文提及的那些)组合。
本发明还涉及组合物(诸如,不限于如本文中进一步描述的药物组合物或制剂)，所述组合物用于体外(例如在体外或细胞检测中)或体内(例如在单细胞或多细胞生物中，并且特别是在哺乳动物中，并且更特别是在人中，例如在患有本发明的疾病或病症或具有其患病风险的人类中)。
本发明的ISVs减轻相关肾小球性肾炎(glomerulonephritis)实验模型中的炎症影响。基于其作用模式,本发明的ISVs和构建体可以用于治疗其它P2X7相关疾病,包括但不限于MS,IBD,神经病性疼痛(neuropathic pain),癫痫(epilepsy),卒中(stroke),糖尿病(diabetes),高血压(hypertension)和癌症。
人们相信,因为本发明的ISVs调节P2X7受体功能并且能够拮抗ATP在P2X7受体处的效果,因此这些化合物还可以用于治疗P2X7相关疾病,包括神经变性疾病。神经变性疾病包括痴呆(dementia),特别是退行性痴呆(degenerative dementia)(诸如老年性痴呆(senile dementia),路易体痴呆(dementia with Lewy bodies),阿尔茨海默病,皮克病(Pick's disease),亨廷顿舞蹈症(Huntingdon's chorea),帕金森病和克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease),ALS,或运动神经元病；尤其是阿尔茨海默病)；血管性痴呆(vascular dementia)(包括多发性脑梗死性痴呆(multi-infarct dementia))；以及与颅内占位性病变相关的痴呆；外伤；感染和相关病症(包括HIV感染,脑膜炎(meningitis)和带状疱疹(shingles))；代谢；毒素；缺氧症和维生素缺乏症；和例如与衰老相关的轻度认知障碍(mild cognitive impairment),特别是年龄相关的记忆损伤。例如要由本发明的ISVS或构建体治疗的神经变性疾病,可以例如是退行性痴呆(尤其是阿尔茨海默病),血管性痴呆(尤其是多发性脑梗死性痴呆),或轻度认知障碍(MCI)，例如与衰老相关的MCI诸如年龄相关的记忆损伤。
本发明的组合也可以用作神经保护剂并用于治疗创伤诸如卒中(stroke),心脏停搏,肺旁路(pulmonary bypass),外伤性脑损伤,脊髓损伤等之后的神经变性。
人们相信,因为本发明的ISVs调节P2X7受体功能并且能够拮抗ATP在P2X7受体的效果,因此这些化合物可以用于治疗疼痛,包括急性疼痛,慢性疼痛,慢性关节疼痛,肌肉骨骼痛,神经病性疼痛,炎性疼痛,内脏痛(visceral pain),癌症相关疼痛,偏头痛(migraine)相关疼痛,紧张性头痛(tension headache)和丛集性头痛(clusterheadaches),机能性肠紊乱(functional bowel disorder)相关疼痛,下背部和颈部疼痛,与扭伤和拉伤相关的疼痛,交感神经维持的疼痛(sympathetically maintained pain)；肌炎(myositis),与流感或其它病毒感染诸如普通感冒相关的疼痛,与风湿热(rheumaticfever)相关的疼痛,与心肌缺血(myocardial ischemia)相关的疼痛,术后疼痛(post-operative pain),癌症化疗,头痛,牙痛和痛经(dysmenorrhea)。
要理解关于治疗的提及包括治疗产生的症状和预防性治疗,除非另有明确说明。
根据本发明的进一步方面,我们因此提供如本文中定义的ISV构建体用于人或兽药和/或用于治疗。
根据本发明的其它方面,我们提供如本文中定义的组合，所述组合用于治疗或预防(例如治疗)P2X7介导的病症。所述组合可以用于治疗或预防(例如治疗)疼痛,炎症(例如MS,类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)或骨关节炎(osteoarthritis))或神经变性疾病,尤其是用于治疗炎性疼痛,神经病性疼痛,内脏痛,类风湿性关节炎或骨关节炎；例如在哺乳动物诸如人中。
根据本发明的进一步方面,我们提供治疗患有P2X7介导的病症(例如本文中公开的病症或疾病(尤其是疼痛,炎症,MS,类风湿性关节炎,骨关节炎或神经变性疾病))的人或动物(例如啮齿动物例如大鼠)受试者,例如人受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文中定义的组合。
根据本发明的进一步方面，我们提供治疗患有疼痛,炎症(例如MS,类风湿性关节炎或骨关节炎),或神经变性疾病(更特别是类风湿性关节炎或骨关节炎,和/或疼痛诸如炎性疼痛,神经病性疼痛或内脏痛)的人或动物(例如啮齿动物例如大鼠)受试者,例如人受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文中定义的构建体或ISV。
根据本发明另一方面,我们提供如本文中定义的构建体或ISV用于制造治疗或预防(例如治疗)例如在哺乳动物诸如人或啮齿动物例如人或大鼠例如人中由P2X7受体的作用介导的病症,例如本文中公开的病症或疾病的药物的用途。根据本发明的另一方面，我们提供如本文中定义的组合用于制造例如在哺乳动物诸如人或啮齿动物例如人或大鼠例如人中治疗或预防(例如治疗)疼痛(例如炎性疼痛,神经病性疼痛或内脏痛),炎症(例如MS,类风湿性关节炎或骨关节炎),或神经变性疾病的药物的用途。
为了将如本文中定义的组合物用于治疗人及其它哺乳动物，其可以任选地根据药学实践配制为药物组合物。因此在本发明的另一方面，提供药物组合物，所述药物组合物包含如本文中定义的组合,所述组合被改为用于人或兽药。
为了将如本文中定义的组合物用于治疗,其可以任选地根据药学实践配制为药物组合物。本发明还提供药物组合物,所述药物组合物包含如本文中定义的组合,或其药用盐,和任选地药用载体。
现在将通过以下非限制性的优选方面,实施例和附图进一步描述本发明。
方面
A1.一种用于治疗P2X7相关疾病的包含至少一个能够以小于50nM的Kd结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域的多肽,其中所述免疫球蛋白单可变结构域对所述P2X7的结合抑制P2X7的活性。
A 2.根据方面A1所述的多肽,其中所述P2X7相关疾病选自由以下组成的组：MS,IBD,神经病性疼痛,癫痫,卒中,糖尿病,高血压和癌症。
A 3.根据方面A1或A 2所述的多肽,其中所述P2X7是人P2X7。
A 4.根据方面A1至A 3任一项所述的多肽,其中所述免疫球蛋白单可变结构域结合SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3。
A 5.根据方面A1至A 4任一项所述的多肽,其中至少一个免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区(FRs)；并且
-其中CDR1选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：34-47,
-与SEQ ID NOs：34-47具有至少80％氨基酸同一性的多肽,和
-与SEQ ID NOs：34-47具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽；并且
-其中CDR2选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：62-75；
-与SEQ ID NOs：62-75具有至少80％氨基酸同一性的多肽；和
-与SEQ ID NOs：62-75具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽；并且
-其中CDR3选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：90-103；
-与SEQ ID NOs：90-103具有至少80％氨基酸同一性的多肽；和
-与SEQ ID NOs：90-103具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽。
A 6.根据方面A5所述的多肽,其中所述构架区(FRs)与SEQ ID NOs：6-19的FRs具有大于80％的序列同一性。
A 7.根据方面A5或A6所述的多肽,其中至少一个免疫球蛋白单可变结构域选自免疫球蛋白单可变结构域的组,其中：
-CDR1是SEQ ID NO：34,CDR2是SEQ ID NO：62；并且CDR3是SEQ ID NO：90；
-CDR1是SEQ ID NO：35,CDR2是SEQ ID NO：63；并且CDR3是SEQ ID NO：91；
-CDR1是SEQ ID NO：40,CDR2是SEQ ID NO：68；并且CDR3是SEQ ID NO：96；
-CDR1是SEQ ID NO：36,CDR2是SEQ ID NO：64；并且CDR3是SEQ ID NO：92；
-CDR1是SEQ ID NO：37,CDR2是SEQ ID NO：65；并且CDR3是SEQ ID NO：93；
-CDR1是SEQ ID NO：38,CDR2是SEQ ID NO：66；并且CDR3是SEQ ID NO：94；
-CDR1是SEQ ID NO：39,CDR2是SEQ ID NO：67；并且CDR3是SEQ ID NO：95；
-CDR1是SEQ ID NO：41,CDR2是SEQ ID NO：69；并且CDR3是SEQ ID NO：97；
-CDR1是SEQ ID NO：42,CDR2是SEQ ID NO：70；并且CDR3是SEQ ID NO：98；
-CDR1是SEQ ID NO：43,CDR2是SEQ ID NO：71；并且CDR3是SEQ ID NO：99；
-CDR1是SEQ ID NO：44,CDR2是SEQ ID NO：72；并且CDR3是SEQ ID NO：100；
-CDR1是SEQ ID NO：45,CDR2是SEQ ID NO：73；并且CDR3是SEQ ID NO：101；
-CDR1是SEQ ID NO：46,CDR2是SEQ ID NO：74；并且CDR3是SEQ ID NO：102；并且
-CDR1是SEQ ID NO：47,CDR2是SEQ ID NO：75；并且CDR3是SEQ ID NO：103。
A 8.根据方面A5至A 7任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由包含具有与SEQID NOs：6-19有大于80％序列同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽组成的组。
A 9.根据方面A5至A 7任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由包含具有与SEQID NOs：6-19有大于90％序列同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽组成的组。
A 10.根据方面A1至A 9任一项所述的多肽,所述多肽包含至少两个能够结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域。
A 11.根据方面A10所述的多肽,其中至少两个免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区(FRs)；并且
-其中CDR1选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：34-47,
-与SEQ ID NOs：34-47具有至少80％氨基酸同一性的多肽,和
-与SEQ ID NOs：34-47具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽；并且
-其中CDR2选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：62-75；
-与SEQ ID NOs：62-75具有至少80％氨基酸同一性的多肽；和
-与SEQ ID NOs：62-75具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽；并且
-其中CDR3选自由以下组成的组：
-SEQ ID NOs：90-103；
-与SEQ ID NOs：90-103具有至少80％氨基酸同一性的多肽；和
-与SEQ ID NOs：90-103具有3,2,或1个氨基酸差异的多肽。
A 12.根据方面A11所述的多肽,其中所述构架区(FRs)具有与SEQ ID NOs：6-19的FRs大于80％的序列同一性。
A 13.根据方面A11或A 12所述的多肽,其中至少两个免疫球蛋白单可变结构域选自免疫球蛋白单可变结构域的组,其中：
-CDR1是SEQ ID NO：34,CDR2是SEQ ID NO：62；并且CDR3是SEQ ID NO：90；
-CDR1是SEQ ID NO：35,CDR2是SEQ ID NO：63；并且CDR3是SEQ ID NO：91；
-CDR1是SEQ ID NO：40,CDR2是SEQ ID NO：68；并且CDR3是SEQ ID NO：96；
-CDR1是SEQ ID NO：36,CDR2是SEQ ID NO：64；并且CDR3是SEQ ID NO：92；
-CDR1是SEQ ID NO：37,CDR2是SEQ ID NO：65；并且CDR3是SEQ ID NO：93；
-CDR1是SEQ ID NO：38,CDR2是SEQ ID NO：66；并且CDR3是SEQ ID NO：94；
-CDR1是SEQ ID NO：39,CDR2是SEQ ID NO：67；并且CDR3是SEQ ID NO：95；
-CDR1是SEQ ID NO：41,CDR2是SEQ ID NO：69；并且CDR3是SEQ ID NO：97；
-CDR1是SEQ ID NO：42,CDR2是SEQ ID NO：70；并且CDR3是SEQ ID NO：98；
-CDR1是SEQ ID NO：43,CDR2是SEQ ID NO：71；并且CDR3是SEQ ID NO：99；
-CDR1是SEQ ID NO：44,CDR2是SEQ ID NO：72；并且CDR3是SEQ ID NO：100；
-CDR1是SEQ ID NO：45,CDR2是SEQ ID NO：73；并且CDR3是SEQ ID NO：101；
-CDR1是SEQ ID NO：46,CDR2是SEQ ID NO：74；并且CDR3是SEQ ID NO：102；并且
-CDR1是SEQ ID NO：47,CDR2是SEQ ID NO：75；并且CDR3是SEQ ID NO：103。
A 14.根据方面A10至A 13任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由包含各自具有与SEQ ID NOs：6-19有大于80％序列同一性的氨基酸序列的至少两个免疫球蛋白单可变结构域的多肽组成的组。
A 15.根据方面A10至A 13任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由包含各自具有与SEQ ID NOs：6-19有大于90％序列同一性的氨基酸序列的至少两个免疫球蛋白单可变结构域的多肽组成的组。
A 16.根据方面A10至A 15任一项所述的多肽,所述多肽包含至少两个能够结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述至少两个能够结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域可以相同或不同。
A 17.根据方面A1至A 16任一项所述的多肽，所述多肽还包含结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，诸如例如Alb8(SEQ ID NO：126)或Alb11(SEQ ID NO：125)。
A 18.根据方面A1至A 17任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由具有与SEQ IDNOs：118-124有大于80％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组。
A 19.根据方面A1至A 18任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由具有与SEQ IDNOs：118-124有大于90％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组。
A 20.根据方面A1至A 19任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由SEQ ID NOs：118-124组成的组。
A 21.一种多肽，所述多肽包含至少两个针对P2X7的免疫球蛋白单可变结构域,其中分别地
a)至少一个第一免疫球蛋白单可变结构域针对P2X7的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象；并且其中,
b)至少一个第二免疫球蛋白单可变结构域针对所述P2X7的不同于第一抗原决定簇表位,部分,结构域,亚单位或构象的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象。
A 22.根据方面A1至A 21任一项所述的多肽,其中所述免疫球蛋白单可变结构域由以下组成：结构域抗体,适于用作结构域抗体的氨基酸序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的氨基酸序列,dAb,适于用作dAb的氨基酸序列,纳米抗体(Nanobody),VHH序列,人源化VHH序列或骆驼源化(camelized)VH序列。
A 23.根据方面A1至A 22任一项所述的多肽,其中Alphascreen测定中的IC50是30nM或更低。
A 24.根据方面A1至A 23任一项所述的多肽,其中Alphascreen测定中的IC50是3nM或更低。
A 25.根据方面A1至A 24任一项所述的多肽,所述多肽还包含药用赋形剂。
A 26.一种生产根据方面A1至A 25任一项所述的多肽的方法,所述方法至少包含以下步骤：
a)在合适的宿主细胞或宿主生物中或在另一个合适的表达系统中表达编码根据方面A1至A25任一项所述的多肽的核酸或核苷酸序列；任选地接着：
b)分离和/或纯化所述免疫球蛋白单可变结构域或所述多肽。
A 27.筛选针对P2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID NOs：1-3)的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)提供免疫球蛋白单可变结构域的组(set)、集合(collection)或文库；并且
b)从所述免疫球蛋白单可变结构域的组(set)、集合(collection)或文库筛选能够结合P2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID NOs：1-3)和/或对P2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID NOs：1-3)具有亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；并且
c)分离能够结合P2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)和/或对P2X7和尤其是人P2X7(SEQ ID NO：1-3)具有亲和力的氨基酸序列。
A 28.一种能够以小于50nM的Kd结合P2X7的免疫球蛋白单可变结构域,其中所述免疫球蛋白单可变结构域对所述P2X7的结合抑制P2X7的活性。
贯穿本申请引用的所有参考文献的整体内容(包括文献参考,发布的专利,公开的专利申请,和共同待决的专利申请)在此明确通过引用并入,尤其对于上文参考的那些教导。
Figure BDA0000663918210001111
Figure BDA0000663918210001121
Figure BDA0000663918210001131
Figure BDA0000663918210001141
Figure BDA0000663918210001151
Figure BDA0000663918210001161
实施例
实施例1.1：美洲驼405和418的免疫和噬菌体展示文库的构建
通过DNA-引发>蛋白加强策略免疫美洲驼(Koch-Nolte等人2007 Faseb J 21：3490-3499)。用基因枪(Biorad)以吸附在金颗粒上的针对小鼠P2X7(mP2X7)和人P2X7(hP2X7)的cDNA构建体(1μm,12次注射，每次1μg DNA/mg金)在剃去毛的左右两侧免疫美洲驼，并以相同材料以2-周的间隔加强3次(图1)。最后一次DNA免疫后三和9天,每只收集100ml外周血。从血液淋巴细胞制备总RNA,通过RT-PCR扩增VHH组库(repertoire)并克隆入pAX50噬菌粒,产生噬菌体文库PBL1和PBL2。用转染以稳定表达mP2X7或hP2X7的HEK细胞进一步加强免疫美洲驼一次(Adriouch等人,2008 FASEB J.22,861–869)(用1mM ATP将2x107HEK_mP2X7和3x107HEK_hP2X7细胞预处理15min并随后在2％多聚甲醛中于冰上固定10min)。四和8天后,收集外周血并产生噬菌体文库PBL3和PBL4。最后的加强免疫以纯化的珠子结合的用琼脂糖-偶联的mAbs HANO43和HANO44(Adriouch等人2005,
Figure BDA0000663918210001171
等人2007)从HEK_mP2X7细胞裂解产物中免疫沉淀的重组mP2X7(5μg/50μl珠子)进行。四和10天之后，产生噬菌体文库PBL5和PBL6。将RNA反转录为cDNA,通过PCR扩增VHH组库并克隆入pAX50噬菌粒载体。在TG1大肠杆菌(E.coli)中扩增噬菌体。
实施例1.2：人P2X7-特异Nbs的选择,测序和初步表征
抗-hP2X7纳米抗体(Nbs)的选择以组合的噬菌体文库PBL5和PBL6进行。进行两次选择,每次包含两轮在表达hP2X7的细胞上的淘选。在选择1中,将噬菌体文库PBL5+6(200μl)在转染以稳定表达人P2X7的小鼠Yac-1淋巴瘤细胞(2.5x107细胞)上淘选。通过胰蛋白酶消化(15min RT)将细胞结合的噬菌体洗脱并且经TG1大肠杆菌中的再感染将上清用于扩增噬菌体。将从第一轮选择拯救(Rescued)的噬菌体(200μl)进一步在稳定转染以表达hP2X7的HEK细胞(2x107细胞)上淘选。对于每只美洲驼,仅从第2轮(R2)挑取克隆。从各个克隆制备噬菌粒并用pAX50测序引物测序。为了将Nbs表达为单个结构域抗体,将pAX50噬菌粒载体单独地转化入HB2151大肠杆菌中。将单价Nbs表达为可溶的His6x标记的蛋白并通过固定化金属亲和层析从周质裂解产物纯化。
测序结果显示来自美洲驼405的文库PBL5+6的R2选择的34个相同克隆(家族a)(表1)。从美洲驼418的文库PBL5+6的R2选择中测序41个克隆,由3个不同家族组成(表1)，其中39个相同(家族b,1c113)。对HEK_hP2X7细胞的测试表达和结合分析显示，1c81(家族a)和1c113(家族b)特异结合hP2X7,然而2个其它的选择的克隆(1c121和1c126)不是结合物(binder)(图2A)。
因此,鉴定的克隆是美洲驼特异的。尽管如此,甚至在两轮复杂的淘选之后，未选择到结合物。此外,明显占优势的噬菌体的存在严重影响结果的准确性。
表1：将个体克隆分类为家族
Figure BDA0000663918210001181
为了增加选择的克隆的数量和多样性,使用与上述相同的细胞进行第二选择：R1中用Yac-1_hP2X7,并且R2中用HEK_hP2X7。为了防止明显占优势的噬菌体的再选择,在淘选之前，通过将R1中的Yac-1细胞与过量的纯化的1c81和1c113Nbs(0.7μg/2x107个细胞)预孵育，将结合位点饱和。
尽管将占优势的噬菌体反向选择,第二选择步骤未显示任何其它中等到强的结合物。尤其是,对来自美洲驼418文库的R2的8个克隆测序显示，属于2个不同家族的克隆,每个家族具有4个相同序列的克隆。对HEK_hP2X7细胞的测试表达和结合分析不显示(3c34)或仅显示非常弱的(3c39)对HEK_hP2X7细胞的结合。
测序来自美洲驼405文库的R2的10个克隆显示属于3个不同家族的克隆。10个克隆中的5个属于家族a,即,与1c81相同的家族,尽管有稍微不同的氨基酸序列。这些中的四个具有相同的氨基酸序列。另外3个由2条不同序列组成的克隆属于新家族(家族c,3c23和3c28)。对HEK_hP2X7细胞的测试表达和结合分析显示3c23(家族c)特异结合hP2X7,然而一个其它被选择的克隆(3c31)不是结合物(图2B)。
这些结果证实了之前的研究结果，即鉴定任何P2X7结合物不是简单的(straightforward)。
实施例1.3：将Nbs重构为双价分子和生产重组蛋白
通过PCR构建Nbs 1c81,1c113和3c23的同质和异质的二聚体,从而使用长的侧翼引物插入35-GS接头(SfiI-Nb1-20GS-BamHI-15GS-Nb2-NotI)。通过以合适的限制性酶位点(5'BamH1,和3'XhoI)为侧翼的引物的PCR扩增，也将VHH结构域作为与小鼠IgG1的Fc-结构域的融合蛋白再克隆入真核表达载体pME(Scheuplein等人,2010)。
将单价和双价Nbs在HB2151大肠杆菌中表达为可溶的His6x标记的蛋白并通过固定化金属亲和层析从大肠杆菌周质裂解产物中纯化。在瞬时转染的HEK细胞中，将双价Nbs表达为N-末端FLAG-标记的Nb-Fc融合蛋白。转染后五天,通过固定在琼脂糖珠子上的M2-抗-FLAG上的亲和层析从细胞上清纯化Nb-Fc融合蛋白。根据制造商使用说明(Pierce,Invitrogen)，将Nbs和Nb-Fc融合蛋白缀合于Alexa647。
实施例1.4：转染的HEK细胞的FACS分析证实P2X7 Nbs的特异性
为了证明选择的Nbs的特异性和确定Nbs是否也会结合小鼠P2X7或大鼠P2X7,将HEK细胞与hP2X7,mP2X7,或rP2X7之一和GFP的表达构建体共转染。转染后二十四小时，将细胞用Nb-Fc融合蛋白或mAb L4染色，之后FACS分析(图3)。结果显示，Nbs 3c23(在图中被称为WD3c23Fc)和1c113(在图中被称为WD1c113Fc)识别hP2X7,但不识别rP2X7或mP2X7,然而Nb 1c81(在图中被称为WD1c81Fc)与转染有hP2X7,rP2X7,和mP2X7的细胞特异反应。通过比较,之前描述的Nbs 13A7和14D5(WO 2010/070145)识别mP2X7,但不识别hP2X7或rP2X7,mAbL4识别hP2X7和rP2X7,但不识别mP2X7。
令人意外地,尽管源自使用小鼠和人P2X7DNA和P2X7细胞的相同免疫和加强策略，但鉴定和选择了具有不同物种特异性和交叉反应性的克隆。
实施例1.5：交叉阻断结合分析显示Nbs 1c81(家族a)和1c113(家族b)与抗-hP2X7mAb L4共享重叠结合位点
原代淋巴细胞表达低水平的P2X7。组合识别不同表位的抗体或使用构象独立的抗体对于嘌呤受体的可视化是有利的。为了研究选择的Nbs是否识别重叠表位,以未缀合的Nb-Fc融合蛋白和Alexa647-缀合的mAb L4和Nbs 1c113-Fc和3c23-Fc进行交叉-阻断分析(图4)。将转染以稳定表达高水平hP2X7的HEK细胞与饱和水平的未缀合的mAb L4,Nb 1c81-Fc,Nb 1c113-Fc,Nb 3c23-Fc,对照Nb(1067-Fc,抗-hCD38),或仅培养基(载体)之一预孵育。不经清洗,将细胞用指示的缀合抗体以是未缀合抗体10倍小的量染色。
在所有情况中，对照Nb,1067-Fc,不影响Alexa647-缀合的P2X7 mAb/Nbs的染色。Alexa647-缀合的1c113-Fc的染色被未标记的1c113-Fc,1c81-Fc和mAb L4完全阻断，但不被3c23-Fc完全阻断。同时,3c23-Fc Alexa647染色被未缀合的3c23-Fc完全消除，但不受其它抗体影响。然而最后,mAb L4 AF647的结合不受3c23-Fc影响,在未缀合的L4和1c113-Fc的存在下，染色被消除。1c81-Fc也阻断L4 AF647染色,尽管不完全。
为了进一步评价Nbs 13A7和14D5的Nb-Fc融合蛋白的效用,将来自野生型和P2X7-/-小鼠的淋巴节,脾或肝的淋巴细胞用荧光染料-缀合的小鼠P2X7-特异的13A7-Fc,14D5-Fc或人P2X7-特异的3c23-Fc(阴性对照)以及用针对CD4,CD25,和NK1.1的抗体共染色，之后进行流式细胞术。图13表明，Nbs 13A7和14D5的Nb-Fc融合蛋白在来自淋巴节,脾和肝的淋巴细胞上检测出P2X7。
因此,这些Nbs是用于监测来自淋巴节,脾和肝的原代细胞上P2X7的表达的有用工具。
实施例1.6：不依赖表位的Nbs的组合允许P2X7在人外周血淋巴细胞和单核细胞的可视化
P2X7在原代淋巴细胞上的表面表达的检测受合适工具的可利用性和嘌呤受体在淋巴细胞亚类上内在的低表达限制(Buell等人1998)。已经显示3c23-Fc独立于1c81-Fc和1c113-Fc结合,我们测试荧光染料-标记的Nb-Fc融合蛋白的组合是否会改善人外周血中淋巴细胞和单核群体上P2X7的检测(图5)。为此,以mAb L4相对于(vs.)1c113-Fc,3c23-Fc,或后两种Nb-Fc融合蛋白的组合进行来自单个供体的PBL的比较染色。结果表明，与单独用mAbL4染色比较，Nb-Fc融合蛋白的组合获得改善的检测灵敏度(对于CD4+细胞，MFI 21相对于11，并且对于CD4-细胞，MFI 17相对于10)(图5A)。为了证明观察到的染色的特异性,用10倍过量的相同未标记的用于染色或对照的Nb-Fc融合蛋白的组合进行阻断分析。
为了证实组合1c113-Fc和3c23-Fc用于检测不同供体中P2X7的效用,将来自三个分开的供体的全血的等分试样通过相同步骤染色(图5B)。单核细胞,粒细胞,和淋巴细胞通过FSC相对于SSC门控。将CD4+T细胞,CD8+T细胞和CD4-/CD8-淋巴细胞(主要对应于B细胞)基于CD4和CD8表达进行门控。以连锁表示显示结果。特异染色的程度被计算为未阻断的(-)相对于阻断的(+)染色的MFI的增加倍数(表1.2)。结果显示单核细胞和所有淋巴细胞亚类中细胞表面P2X7的特异染色,但在粒细胞中没有。P2X7表达水平可以定量排序为单核细胞>CD4>CD8>CD4–/CD8–。
表1.2.P2X7在人外周血白细胞上表达的信号背景比。对图5中显示的各细胞群确定平均荧光强度。各个未阻断的(–)相对于阻断的(+)的商被计算为信号对背景的增加倍数。
Figure BDA0000663918210001221
实施例1.7：Nbs 1c81和3c23阻断转染的HEK细胞中ATP-诱导的CD62L脱落
我们之前展示，用ATP处理共转染有P2X7和CD62L(L-选择蛋白)的HEK细胞导致P2X7-依赖性的CD62L脱落(通过P2X7-依赖的内源性金属蛋白酶的活化)。为了确定选择的Nbs是否能够阻断P2X7功能,以转染的HEK细胞进行CD62L脱落分析(图6)。将细胞仅用CD62L的cDNA表达构建体转染,或用CD62L和hP2X7(Y155_T348)的构建体共转染。转染后24h,收获细胞并且通过与ATP孵育诱导CD62L的脱落。
在仅以CD62L转染的HEK细胞中,与4mM ATP孵育对细胞表面CD62L水平未显示影响(图6A)。在用CD62L和hP2X7共转染的HEK细胞中,相比之下,用ATP处理以剂量依赖的方式诱导CD62L脱落(EC-50 1.5mM；图6B)。在用2mM或4mM ATP处理之前，将细胞与Nbs 1c81或3c23的Fc-融合构建体预孵育，消除了CD62L的脱落。对照Fc融合蛋白,1067-Fc(抗-hCD38),不影响脱落(图6B)。
实施例1.8：Nbs 1c81和3c23阻断转染的HEK细胞中CD62L的脱落
小鼠mAb L4已经被报道阻断人单核细胞上P2X7活化(Buell等人1998)。为了比较选择的Nbs,Nb-Fc融合蛋白,和mAb L4的阻断效力,用转染的HEK细胞进行比较剂量应答测定(图7)。为此,将HEK细胞用GFP,CD62L和hP2X7共转染。转染后24h,通过温和的胰蛋白酶消化收获细胞并在RT用指示量的Nb,Nb-Fc融合蛋白,或mAb L4孵育15min。在37℃在缺少或存在4mM ATP的情况下将细胞进一步孵育60min，之后对细胞表面CD62L染色并FACS分析。
结果显示饱和剂量的Nbs 1c81和3c23对CD62L脱落的完全阻断,饱和剂量的Nb1c113和mAb L4对CD62L脱落的部分阻断,并且对照Nb和Nb-Fc融合蛋白对CD62L脱落无阻断。滴定分析显示，相对其单结构域对等物，双价的Nb-Fc融合蛋白具有改善的摩尔抑制效力：3c23-Fc显示相对3c23的4-倍增加，而1c81-Fc比1c81更有效20-倍。因此,基于阻断或加强ATP-诱导的CD62L脱落的效力,抗-hP2X7抗体能够以递减的效力顺序被排序为3c23-Fc>3c23>1c81-Fc>1c81>1c113-Fc>1c113,mAb
L4(表1.3)。
表1.3.计算的抗-hP2X7抗体在阻断转染的HEK细胞中L-选择蛋白脱落的IC50值。从图7中标记为半数最大阻断的点的700荧光单位的抗-CD62L的曲线(虚红线)计算IC50值。对于具有阈值以下的最大抑制的曲线，不可能评估IC50值。考虑各自的平均分子量计算以nM表示的IC50值。n/a＝不适用。
Figure BDA0000663918210001231
实施例1.9：Nbs 3c23和1c81阻断RPMI 8226淋巴瘤细胞产生的ATP-介导的磷脂酰丝氨酸外化和细胞死亡
RPMI 8226是人B-细胞骨髓瘤细胞系，其内源表达P2X7(图8A)。该细胞系以磷脂酰丝氨酸(PS)外化和细胞死亡响应ATP处理(不可逆地摄取碘化丙锭)(Farrell等人2010Biochimica et Biophysica Acta 1800pp 1173–1182)。FACS分析证实RPMI 8226细胞产生的ATP-剂量依赖性的PS外化(EC50 1.8mM)(图8B)。为了测试选择的Nbs是否能够阻断ATP-诱导的内源表达的P2X7的活化,研究Nbs阻断RPMI 8226细胞产生的ATP-介导的PS-外化的能力(图8C)。为此,将RPMI 8226细胞与mAb L4,抗-hP2X7 Nb-Fc融合蛋白1c113-Fc,1c81-Fc,3c23-Fc或与对照Nb-Fc融合蛋白1067-Fc在RT预孵育15min，并随后在37℃与4mM ATP进一步孵育60min。通过以荧光染料-标记的膜联蛋白V可视化外化的磷脂酰丝氨酸，测定P2X7活化的程度(图8C)。结果显示1c81-Fc和3c23-Fc几乎完全阻断ATP-诱导的PS-外化,然而mAbL4和1c113-Fc二者都仅部分阻止PS-外化,并且对照Nb-Fc融合蛋白1067-Fc完全缺少阻断。
实施例1.10：Nbs 1c81和3c23阻止RPMI 8226细胞的P2X7-介导的细胞死亡
之前已经证实，ATP导致的RPMI 8226细胞上延长的P2X7活化导致细胞死亡,如通过不可逆摄取碘化丙锭检测的(Farrell等人2010)。之后研究P2X7特异的Nbs是否能够阻止细胞死亡。为此,将RPMI 8226细胞与各个抗体预孵育，之后用ATP处理60min或24h。随后清洗细胞并用膜联蛋白V和碘化丙锭染色以评价磷脂酰丝氨酸外化和细胞死亡(图9)。
在与2mM ATP的60-min孵育过程中,与对照相比，mAb L4和Nb 1c113-Fc二者都部分防止磷脂酰丝氨酸的暴露(图9,上图)。在与ATP的过夜孵育过程中，该部分阻断不足以阻止细胞死亡(图9,下图)。相比之下,Nb-Fc融合蛋白1c81-Fc和3c23-Fc二者都完全阻断P2X7-介导的磷脂酰丝氨酸暴露和细胞死亡(与ATP处理的持续时间无关)(图9上和下图)。
实施例1.11：Nbs 1c81和3c23阻断人T细胞产生的ATP-诱导的PS外化和CD62L脱落
已经证明，Nbs 1c81和3c23有效阻断内源表达P2X7的RPMI8226淋巴瘤细胞产生的ATP-诱导的PS外化,我们接着研究这些Nbs是否也能够阻断CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的ATP-诱导的PS外化和CD62L脱落(图10)。为此,将全血的等分试样与各个Nb-Fc融合蛋白或与各个mAb L4在RT预孵育30min，之后在37℃用4mM ATP处理30min。随后,将细胞关于CD62L表达和PS外化(膜联蛋白V)染色，作为P2X7活化的读出值。
来自三个供体的T细胞通过CD62L脱落和膜联蛋白V染色至不同程度来响应ATP(图10)。然而来自供体1和2的T细胞显示更弱的对ATP的响应,来自供体3的细胞强烈响应P2X7活化。在P2X7灵敏度的幅度方面,供体可以被排序为供体3>供体2>供体1。在各个供体中，CD4+T细胞对ATP的响应与CD8+T细胞相当。mAb L4和1c113-Fc二者都显示对CD62L脱落和PS暴露的部分阻断；对照抗体1067-Fc不影响ATP-介导的P2X7活化。Nb-Fc蛋白1c81-Fc和3c23-Fc完全阻止ATP-介导的P2X7活化。
实施例1.12：Nb 3c23阻断人RPMI 8226淋巴瘤细胞中ATP-诱导的钙流入
将RPMI 8226细胞加载以Ca2+指示剂Fluo-4。进行实时流式细胞术分析(BD FACSCanto)。清洗细胞并在缺少(溶剂)或存在人P2X7-特异的Nb 3c23-3c23或小鼠P2X7-特异的Nb 13A7-13A7(阴性对照)的情况下重悬于补充以Ca2+和Mg2+的PBS(Invitrogen)并通过流式细胞术(BD FACS-Canto)分析。红外线灯用于维持37℃的恒定样品温度。平衡100sec之后,加入ATP至终浓度为2mM并持续孵育100sec，之后加入离子霉素至终浓度为5μM。图14表明Nb 3c23阻断人RPMI 8226淋巴瘤细胞中ATP-诱导的钙流入。
实施例1.13：Nb 3c23阻断ATP-诱导的IL-1β从人血细胞的释放.
在缺少或存在Nb 3c23-3c23的情况下，将来自四个供体的肝素化全血的等分试样与LPS(1μg/ml)孵育2h，之后加入ATP至终浓度为5mM并在37℃进一步孵育1h。通过离心细胞制备血浆并通过ELISA(R&D Systems)确定血浆中的IL-1β水平。***P<0.001(单因素ANOVA)。图15表明，Nb 3c23阻断ATP-诱导的IL-1β从人血细胞的释放。
实施例1.14：Nb 3c23阻断ATP-诱导的IL-1β从人血细胞释放的剂量应答分析
在缺少或存在所示浓度的Nb 3c23,3c23-3c23,和3c23Fc的情况下，将肝素化全血等分试样与LPS(1μg/ml)孵育2h，之后加入ATP至终浓度为2mM并在37℃进一步孵育1h。通过离心细胞制备血浆并通过ELISA(R&D Systems)确定血浆中IL-1β水平。小鼠P2X7-特异的Nb13A7用作阴性对照。图16描绘了Nb 3c23阻断ATP-诱导的IL-1β从人血细胞释放的剂量应答分析。
实施例1.15：小鼠Nb 13A7阻断和Nb 14D5加强NAD+和ATP-诱导的由淋巴瘤细胞系Yac-1产生的CD62L脱落
使用表达P2X7的鼠细胞进一步评价小鼠P2X7-特异性Nbs的功能效果。淋巴瘤细胞系Yac-1内源表达小鼠P2X7和毒素相关的外-ADP-核糖基转移酶ART2.2。在这些细胞上,P2X7可以被细胞外ATP以及由ART2.2催化的R125的NAD+-依赖性ADP-核糖基化活化(Adriouch等人,2008)。Nb 13A7阻断这些细胞产生的NAD+-诱导的和ATP-诱导的CD62L脱落；转变为双价形式显著增强该Nb的阻断效力(图21)。相比之下,Nb 14D5加强ATP-和NAD+-诱导的Yac-1细胞产生的CD62L脱落。同样，转变为双价形式显著增强该Nb的效力(图1000b)。尽管Nb 14D5的结合自身不诱导小鼠P2X7的门控,但其降低了ATP和NAD+二者门控的阈值(WO 2010/070145)。类似地,Nb 13A7有效阻断并且Nb 14D5加强NAD+和ATP-诱导的CD62L从原代T细胞的脱落(图22)。Nb 13A7还有效阻断ATP诱导的Ca2+流入以及ATP-诱导的由腹膜巨噬细胞进行的IL-1β加工和分泌(参见下文实施例1.18和1.19)。
实施例1.16：Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强稳定转染有小鼠P2X7的HEK细胞中ATP-诱导的钙流入
在存在小鼠P2X7-特异的Nb 14D5-14D5,Nb 13A7-13A7或人P2X7-特异的Nb 3c23-3c23(阴性对照)的情况下，加载以Ca2+指示剂Fluo-4的小鼠-P2X7转染的HEK细胞的实时流式细胞术分析。将细胞暴露于细胞外ATP至终浓度为250μM或1mM并且两分钟后,暴露于5μM浓度的Ca2+离子载体离子霉素。如在图17中证明的,Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强稳定转染有小鼠P2X7的HEK细胞中ATP-诱导的钙流入。
实施例1.17：Nb 13A7反转,Nb 14D5诱导和加强稳定转染有小鼠P2X7的HEK细胞中ATP-介导的钙流入
加载有Ca2+指示剂Fluo-4的小鼠-P2X7转染的HEK细胞的实时流式细胞术分析。将细胞与所示浓度的ATP孵育两分钟，之后用小鼠P2X7-特异的Nb 14D5-14D5,Nb 13A7-13A7或人P2X7-特异的Nb 3c23-3c23处理。如在图18中标明的,Nb 13A7反转,Nb 14D5诱导和加强稳定转染有小鼠P2X7的HEK细胞中ATP-介导的钙流入。
实施例1.18：Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强小鼠腹膜巨噬细胞中ATP-诱导的钙流入
将小鼠腹膜巨噬细胞加载以Ca2+指示剂Fluo-4。进行实时流式细胞术分析(BDFACS Canto)。清洗细胞并在缺少(溶剂)或存在P2X7-加强Nb 14D5或P2X7-拮抗性Nb 13A7(1μg/500μl)的情况下重悬于补充以Ca2+和Mg2+的PBS(Invitrogen)。红外线灯用于维持37℃的恒定样品温度。平衡120sec之后,将细胞暴露于所示浓度的细胞外ATP并且两分钟之后，暴露于Ca2+离子载体离子霉素至终浓度为1μM。如在图19中显示的,Nb 13A7阻断,Nb14D5加强小鼠腹膜巨噬细胞中ATP-诱导的钙流入。
实施例1.19：Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强由腹膜巨噬细胞进行的IL-1β加工和分泌
在单价Nbs(1μg/200μl)14D5,13A7,或溶剂的存在下，将来自野生型或P2X7-/-小鼠的肝素化血液与LPS(1μg/ml)孵育2h，之后加入ATP至所示终浓度并在37℃进一步孵育30min。a)离心样品并且通过ELISA(Biolegend)分析血浆中IL-1β水平。b)裂解红细胞并且以两个步骤将血液白细胞染色,第一步骤用荧光染料-缀合的特异于CD11b,Ly-6C,和Ly-6G的mAbs。随后将细胞固定(2％PFA)和通透化(含有0.3％皂苷和0.1％BSA的PBS)，之后对前(pro)-IL-1β染色(e-Bioscience)。进行流式细胞术分析(BD FACS Canto)并对CD11b+Ly-6Chi单核细胞进行门控。如图20中表明的,Nb 13A7阻断,Nb 14D5加强由腹膜巨噬细胞进行的IL-1β加工和分泌。
实施例1.20：结论
通过在表达人P2X7(hP2X7)的细胞上淘选从两只美洲驼选择三个不同家族的Nbs并确认hP2X7特异性。家族a(1c81,美洲驼418)和b(1c113,美洲驼405)通过对hP2X7-转染的Yac-1和HEK细胞顺序淘选噬菌体文库来选择。家族c(3c23,美洲驼405)通过用纯化的Nbs掩蔽1c81和1c113表位并重复淘选来选择。将Nbs重构为双价构建体和Nb-Fc融合蛋白。将单价和双价的His-标记的Nbs在大肠杆菌中表达并且通过固定化金属亲和层析从周质裂解产物纯化。将FLAG-标记的Nb-Fc融合蛋白在HEK细胞中表达并通过固定的抗-FLAG mAb M2上的亲和层析从HEK细胞上清纯化。在转染有人P2X7,小鼠P2X7,或大鼠P2X7的HEK细胞上验证Nbs的特异性。通过用选择的Nbs和抗-hP2X7 mAb L4的交叉-阻断分析测试表位-特异性。Nbs 1c81和1c113识别与L4共有的表位,Nb 3c23识别独特的,非重复表位。组合具有不同表位的Nbs允许人外周血淋巴细胞和单核细胞上细胞表面P2X7的改善的染色。尤其是,Nbs1c113-Fc和3c23-Fc用于监测原代人血细胞上P2X7的表达。在转染的HEK细胞,人RPMI-8226淋巴瘤细胞,和原代人外周血白细胞上测试Nbs阻断P2X7-依赖性的,ATP-诱导的L-选择蛋白(CD62L)脱落和磷脂酰丝氨酸(PS)外化的效力。Nbs 1c81和3c23比mAb L4更有效阻断ATP-诱导的P2X7活化。1c81和3c23的重构的双价Nb-Fc融合蛋白比其单价对等物显示5-20倍增强的阻断P2X7活化的效力。实施例1.15–至1.19显示小鼠特异的Nbs对ATP-诱导的钙流入和ATP-诱导的IL-1β释放的功能效果,其反映人P2X7-特异的Nbs的结果(实施例1.12至1.14)。实施例1.20显示，Nbs 13A7和14D5是监测来自淋巴节,脾和肝的原代细胞上P2X7表达的有用工具。
实施例2：抗-小鼠P2X7纳米抗体的离体和体内阻断和活化
为了评价纳米抗体在体内系统注射后调节P2X7的能力,将两种之前显示为展示对NAD+-和ATP-介导的P2X7门控高灵敏度的调节T细胞亚类：CD4+CD25+Tregs和iNKT细胞进一步详细说明(Hubert等人2010J.Exp.Med.207pp 2561-2568；Scheuplein等人,2010)。
实施例2.1：方法学
通过小鼠尾静脉将纳米抗体静脉内注射。1.5h和24h之后处死小鼠并分析体内和活体外P2X7活化的阻断或增强。
方案设置：通过静脉注射于尾静脉，将野生型C57bl/6小鼠用各自量的纳米抗体注射。注射后(p.i.)1.5h或24h,处死小鼠并如之前实验中描述地制备脾细胞和肝淋巴细胞。通过离心沉淀200μl脾细胞或肝白细胞悬浮液。将沉淀重悬于仅100μl RPMI,RPMI中的25μMNAD或250μM ATP中并在37℃孵育15min以诱导P2X7活化，并与保持在冰上而无活体外P2X7活化的样品(4℃)相比较。孵育之后,在膜联蛋白V结合缓冲液中清洗细胞并在膜联蛋白结合缓冲液中染色。
用荧光染料-缀合的Nb 13A7染色来自脾和肝的原代细胞证实Tregs和iNKT细胞产生的显著的P2X7表达(参见实施例1.5,图13)。将这些Nbs静脉内注射入小鼠导致注射后30分钟内淋巴节,脾和肝中这些调节T细胞的有效染色(数据未显示)。
实施例2.2：通过增强HLE-纳米抗体14D5(14D5-14D5-Alb8)体内活化P2X7
注射14D5-14D5-Alb8Nb,显著导致注射后2h从脾回收的Tregs级分的两倍的降低和从肝回收的iNKT细胞的甚至更急剧的降低(图11a)。相对于在用13A7-13A7-Alb8(n＝3)注射的小鼠中的9％和在用Dummy-Nb(n＝1)注射的小鼠中的12％，在用14D5-14D5-Alb8(n＝3)注射的小鼠中，Tregs数量(作为CD4+细胞的百分比)降至4％。相对于用13A7-13A7-Alb8和14D5-14D5-Alb8处理的小鼠中分别为45％,和在用Dummy-Nb处理的小鼠中的55％，iNKT细胞数量(作为CD3阳性细胞的百分比)降至10％。注射后24h,在用14D5-14D5-Alb8注射的小鼠中，Tregs和iNKT细胞的数量显示部分恢复,但仍然低于用13A7-13A7-Alb8或Dum-Alb8-Dum(Dummy-Nb)注射的小鼠的那些。在分开的实验中,用8G11-8G11-Alb8注射的小鼠显示与Dummy-Nb注射的小鼠的那些相当的Tregs和iNKT细胞数量(图11c)。与用Dummy-Nb注射的小鼠相比，从14D5-14D5-Alb8注射的小鼠的脾回收的T细胞响应于在37℃与外源性NAD的15min孵育显示增强的CD27脱落(图11b)。
因此,14D5-14D5-Alb8 Nb加强小鼠P2X7。
实施例2.3：通过拮抗性HLE-纳米抗体8G11和13A7(分别为8G11-8G11-Alb8和13A7-13A7-Alb8)体内阻断P2X7
在腹膜内注射HLE-Nbs后2h制备的脾和肝细胞上进行的功能测定的结果表明8G11-8G11-Alb8和13A7-13A7-Alb8二者对P2X7的阻断效果(图11c)。
注射13A7-13A7-Alb8完全阻止了响应于活体外添加的外源性NAD的脾Tregs导致的CD27的脱落并且部分阻断了肝iNKT细胞产生的CD27脱落(图11b)。注射13A7-13A7-Alb8也有效阻断了响应于活体外添加的外源性NAD的脾Tregs和肝iNKT细胞产生的磷脂酰丝氨酸外化(图11c)。与Yac-1淋巴瘤细胞上的体外结果(参见实施例1.15)一致,13A7-13A7-Alb8在阻断P2X7方面比8G11-8G11-Alb8更有效,尽管用抗-myc对于13A7比对于8G11观察到更低的染色水平。结果表明，在注射后2h,最低剂量的13A7-13A7-Alb8(15μg)仍然比最高剂量的8G11-8G11-Alb8(200μg)更有效并且比最高剂量的13A7-13A7-Alb8(200μg)效果略差。动力学分析结果表明与注射后2h相比，在注射后24h有阻断HLE-Nbs的类似功能效果(图11b)。
实施例3.在炎性模型中评价抗-P2X7纳米抗体
实施例3.1：方法学
测试重构的Nbs在实验诱导的炎症：抗-足细胞抗体诱导的肾小球性肾炎(glomerulonephritis)的小鼠模型中的治疗潜力。之前的研究已经显示，P2X7-缺陷小鼠发展为这些疾病的轻度形式,产生这样的假想：野生型小鼠中P2X7的药学抑制可能模拟P2X7基因缺失的有益效果。相反,P2X7的药学活化可能加强这些炎性反应。
实施例3.2：抗体-诱导的肾炎
全身注射用小鼠足细胞免疫的动物血清引起缓慢进展的肾炎。尿中白蛋白的出现(蛋白尿)可以用作肾小球滤过器官损伤的读出。因为尿的体积可以主要根据液体摄入量而大大不同,所以常常将尿中白蛋白浓度标准化为肌酸酐浓度。疾病进展比ConA-诱导的肝炎缓慢得多。在野生型小鼠中,蛋白尿通常从血清注射后第7-9天可检测。动物通常屈服于疾病并且必须在血清注射后14-15天处死。
为了评价抗-P2X7 HLE-Nbs在肾炎模型中的可能治疗和/或促炎症效果,数组6周龄C57BL6小鼠(n＝6)接受5次HLE-Nbs注射(在注射抗-足细胞血清(APN)之前2h引发剂量50μg和在第3,6,9,和12天分别25μg)。对照小鼠接受免疫前血清注射(PI)。数组5-6只小鼠接受Dummy-Nb,13A7-13A7-ALB8,或14D5-14D5-ALB8注射。在代谢笼中于第3,6,9,12,15和21天收集24h尿。在第15或21天处死动物,收集肾和血液样品并进行进一步分析，包括确定血清胆固醇,甘油三酯,和肌酸酐。
实施例3.3：Nb 14D5增强,Nb 13D7降低肾炎模型中的疾病参数
通过ELISA定量尿中白蛋白,通过自动测量确定肌酸酐水平(图12A)。处死当天,通过自动测量确定血液尿素氮,血清甘油三酯和血清胆固醇水平；血清中IL-6和尿中MCP-1通过ELISA定量。以Mann Whitney U检验评价显著性(图12B)。尿分析的结果显示用抗足细胞血清处理的动物中可检测的蛋白尿和在第9天开始的Dummy-Nb伴有稳定增加的尿白蛋白水平，直到在第15或21天实验结束(图12A)。在处死时，用P2X7拮抗性13A7-13A7-ALB8处理的小鼠显示比用Dummy-Nb处理的小鼠低得多的尿白蛋白水平(图12)。这些差异是统计学显著的(p<0.05)。相比之下,用P2X7增强性14D5-14D5-ALB8处理的小鼠在血清注射后第3天已经发展为可检测蛋白尿并且在整个实验过程中持续显示比Dummy-Nb或13A7-13A7-ALB8处理小鼠显著更高的尿白蛋白水平。与接受增强性14D5-14D5-ALB8的小鼠中更严重的肾炎综合征一致,这些小鼠在第15和21天还显示显著更高水平的血清甘油三酯,胆固醇和肌酸酐,而用13A7-13A7-ALB8处理的小鼠显示这些血清参数的正常水平。
实施例3.4：Nb 13A7抵抗,Nb 14D5诱导和加强NAD+诱导的CD27+T细胞的脱落。
处死当天(注射抗-足细胞抗体后21d,最后注射纳米抗体后3d),在缺少(PBS)或存在NAD+的情况下将脾细胞孵育30min并随后对CD4,CD25,和CD27染色，之后FACS分析。对CD4+CD25+Tregs进行门控。来自用P2X7激动性Nb 14D5处理的小鼠的Tregs含有更低比例的CD27+T细胞,其全部对NAD+-诱导的CD27损失敏感；来自用P2X7拮抗性Nb 13A7处理的小鼠的Tregs阻止NAD+-诱导的CD27脱落。这些结果表明，在处死当天，脾Tregs仍然覆盖有P2X7-特异的Nbs。
实施例3.5：：Nb 14D5增强,Nb 13D7降低炎性肾损伤
在处死当天(注射抗-足细胞抗体之后21d)，将肾切片用高碘酸希夫染料(Periodic Acid Schiff stain)(PAS)染色(图12D上图)。肾小管蛋白管型用星号标出。将肾切片用DNA-染色染料draq5，荧光染料-缀合的针对T细胞标志物CD3的mAb,和荧光染料-缀合的针对nephrin的mAb,肾脏滤过屏障处的足细胞膜蛋白染色(图12E,底部)。用星号标记足细胞核。来自用Nb 14D5处理的小鼠的肾切片比用Nb 13A7或对照Nb处理的小鼠的肾切片显示更强的CD3+T细胞球旁浸润和对nephrin染色的破坏。
将肾切片用draq5和荧光染料缀合的针对nephrin的mAbs,补体因子3(C3),和IgG染色，之后免疫荧光显微术(图12F)。来自用AP血清处理的小鼠的(但来自用PI血清处理的小鼠则没有)切片显示IgG和3的肾小球沉积。IgG沉积的模式在用Nb 13A7处理的小鼠中是规则的,但在用对照Nb处理的小鼠中被部分破坏并且在用Nb 14D5处理的小鼠中被强烈破坏。
因此,用P2X7-阻断性Nb 13A7处理的动物显示很少的(如果有的话)肾损伤或炎症的征兆,然而用P2X7-加强性Nb 14D5处理的动物显示加重的炎症和肾损伤：在用Nb 14D5或对照Nb处理的动物中蛋白尿显著增强，但在用Nb 13A7处理的动物中仍然低。此外,前者而不是后者显示与肾炎综合征一致的明显的肾损伤病理学征兆,即肾小管蛋白管型,肾小球毛细血管阻塞,足细胞肿胀,滤过屏障处被破坏的nephrin染色和炎性细胞的管周和球旁浸润。一致地,用对照Nb或用P2X7-加强性Nb 14D5处理的动物显示升高的血液尿素氮,血清甘油三酯,和胆固醇浓度。相反,用P2X7-阻断性Nb 13A7处理的动物显示比用P2X7-加强性Nb14D5处理的动物更低水平的血清中促炎细胞因子IL-6和尿中MCP-1。这些结果表明，P2X7-阻断性Nbs可以减轻炎性肾损伤而P2X7-加强性Nbs可以加重炎性肾损伤。
实施例3.4：讨论和结论
Yac-1淋巴瘤细胞系上核苷酸-诱导的P2X7活化的体外分析结果表明双价和HLE-Nbs的类似功能效力。两种P2X7-拮抗性HLE-Nbs 13A7和8G11都显示与ATP-诱导的活化相比，对NAD(ADP-核糖基化)-诱导的P2X7活化的更有效的阻断,13A7一致地显示比8G11更好的阻断效果。在P2X7-增强14D5Nb的情况下,将价从单价增加到双价伴随以显著增强的效力,同时进一步的价增加仅显示微小的进一步效力增加。
以高剂量(100μg/小鼠,对应于5mg/kg)系统注射HLE-Nbs之后,三个P2X7-特异的HLE-Nbs显示对脾和肝T细胞上P2X7功能的明显可检测效果,确切地重演在淋巴瘤细胞的体外处理时所观察到的效果,即,13A7比8G11导致更有效的阻断和14D5导致的P2X7功能的显著增强。使用抗-myc抗体,脾和肝T细胞表面上可检测Nbs,具有脾中已知表达最高水平P2X7的两个亚群(Tregs(CD4+CD25+))的最显著染色。
在脾中,对CD4+辅助T细胞的两个亚群：高度敏感的Tregs的CD25+群体以及较不敏感的CD25-阴性,稚CD4+T细胞亚群，13A7完全阻断P2X7-诱导的响应于在细胞制备过程中释放的低水平的NAD的CD27脱落(图11)。13A7还完全保护两个亚群免受P2X7-诱导的响应添加更高浓度的外源性NAD的CD27脱落。13A7进一步完全保护稚T细胞,但仅部分保护Tregs免受P2X7-诱导的响应添加高浓度外源性ATP的CD27脱落。时间过程分析显示注射13A7之后24h后相对于在注射13A7之后1.5h的类似的阻断活性。当剂量从200μg/小鼠降低到15μg/小鼠时，滴定分析显示13A7阻断活性降低很少(如果有的话)。
体内实验表明P2X7-特异的HLE-Nbs还对P2X7功能和实验诱导的肾炎小鼠模型中的疾病进程的可检测效果。在此肾炎模型中，效果是非常明显的。在该模型中，有效的P2X7-拮抗性13A7 HLE-Nb显示有益效果,获得统计学显著性。P2X7-增强性14D5 HLE-Nb显著促进肾炎模型中的疾病进程。在肾炎模型中,在处死时(注射抗-足细胞血清后第15天)，用有效拮抗剂13A7 HLE-Nb处理的小鼠比用Dummy-Nb处理的小鼠在尿中显示更低水平的白蛋白,其中白蛋白用作肾小球滤过器官损伤的指示剂。这些差异在统计学上显著(p<0.05)。显著相反,用P2X7-增强性14D5 HLE Nb处理的小鼠比用Dummy-Nb处理的小鼠具有远远更高的蛋白尿水平,和更高的血清胆固醇和肌酸酐水平,这与更严重的肾炎综合征一致。这些差异也是统计学显著的(p<0.05)。
因此,全身施用拮抗性ISVs诸如Nb 13A7缓解抗体-诱导的肾小球性肾炎(glomerulonephritis)中的疾病参数,而全身施用激动性ISVs诸如Nb 14D5加强抗体-诱导的肾小球性肾炎(glomerulonephritis)中的疾病参数。
实施例3.5：观点
综上,该项目推广的结果强调了使用HLE Nbs体内调节T细胞的P2X7离子通道功能的可行性。小鼠肾炎模型的实验显示，P2X7-阻断性Nbs在这个及其它疾病中抑制过度炎性反应方面具有治疗有益效果。
P2X7增强性14D5 HLE-Nb加剧肾炎模型中的炎性反应的研究结果显示，Nbs可以用于增强所需的炎性反应,例如,在细胞内寄生物诸如衣原体(Chlamydia)和弓形虫(Toxoplasma)慢性感染中增强需要的炎性反应,其中已经显示，P2X7的活化具有有益效果。
相对小分子抑制剂，Nbs通常提供很多好处,并且这些还与针对P2X7离子通道的Nbs相关：对更大蛋白家族的个体成员的低毒性,生物可降解性,高特异性,和各种各样的重构选项。
实施例4：在MS模型中评价抗-P2X7纳米抗体
MS动物模型,使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽残基35–55在野生型C57BL6小鼠中诱导实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。患病小鼠接受抗-P2X7 Nbs或Dummy-Nb。通过临床体征的出现,评价脑炎症和神经元损伤的免疫细胞化学染色,和通过测量T细胞细胞因子产生来监测疾病进程。
实施例4.1：诱导EAE
如描述的(Matute等人,2007)，在C57BL/6小鼠中使用合成的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35–55(MOG35–55)主动诱导EAE。给小鼠皮下注射(两次100μL注射入一个后肢的临近区域)溶解在100μL PBS中的300μg MOG35–55乳液(混合有100μL含有500μg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的CFA)。MOG35–55注射后,动物立即接受百日咳毒素(PT,200μL PBS中200ng)的腹膜内注射。两天后，小鼠接受第二次PT注射,并且1周后，它们接受MOG35–55的加强注射。以5点量表(point scale)对临床体征评分：第0级,无临床体征；1,无力的尾巴和/或受损的站直(righting)；2；一个后肢麻痹；3；两个后肢麻痹；4；垂死的；5,死亡。由不知情研究者每日在相同时间进行评分。
实施例4.2：注射抗-P2X7纳米抗体
与MOG35–55免疫方案同时，通过尾静脉静脉内注射纳米抗体。数组的5-6只小鼠接受Dummy-Nb,13A7-13A7-ALB8,或14D5-14D5-ALB8注射，如在实施例2中描述的。
实施例4.3：T-细胞分离和细胞因子测量
在加强MOG注射/Nb-注射后4天或21天，从MOG35–55免疫的EAE小鼠分离脾细胞。裂解红血细胞之后,以400μl RPMI培养基中2×105细胞/孔的密度将脾细胞铺平板于24孔板中,并与免疫原(0或25μg/ml MOG 35–55肽)孵育。1天之后,按照建议的步骤通过ELISA测定等分试样的培养基的IL-17或IFNγ水平。至少一式三份测定各个样品,从标准曲线确定ng/ml细胞因子的计算,并且确定由于MOG肽的存在导致的增加。根据制造商的方案，使用小鼠细胞因子抗体阵列III(例如RayBiotech)进行由活化的脾细胞产生的64种炎性分子的半定量分析。
实施例4.4：对浸润细胞的分析
将小鼠脑用盐水灌注，之后在4％多聚甲醛中固定过夜。半球脱水、清洗、干燥和固定化是根据标准方案进行。将组织切成8μm厚。从中线开始切径向(sagital)切片(8或10μM),并封固。根据标准方案进一步制备切片。分析来自各个动物的四个连续切片的从嗅球延伸至背部第三室的区域中存在的浸润细胞的数量。以10×物镜使用相同曝光时间获得所有染色的切片的黑白图像。限定含有小的圆形亲苏木精(hematoxylinophyllic)核的特定区域,并调整对比度从而不计算更大的圆形细胞(可能是少突胶质细胞)。提供的数据为每mm2的细胞数量。
使用免疫组化检测T-细胞。对于此,使用抗-CD8抗体将冷冻切片染色。在4℃，将切片在PBS中的3％BSA加上抗体中孵育过夜，清洗,并随后用标记有FITC的二抗显色。
等同物
之前的书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明不限于提供的实施例的范围,因为所述实施例意在作为本发明的某些方面和实施方案的说明。其它功能相当的实施方案也在本发明范围内。从之前的描述，除了本文中展示和描述的那些之外的本发明的各种改进对于本领域技术人员而言将变得显而易见并且落入所附权利要求的范围内。本发明的优势和目的不必被本发明的每个实施方案包括。
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Claims (15)

1.一种用于治疗P2X7相关疾病的包含至少一个能够以小于50nM的Kd结合由SEQ IDNO:1，2或3表示的人P2X7的免疫球蛋白单可变结构域的多肽,其中所述免疫球蛋白单可变结构域对所述人P2X7的结合抑制所述人P2X7的活性，其中所述P2X7相关疾病选自由以下组成的组：MS,IBD,神经病性疼痛,癫痫,卒中,糖尿病,高血压和癌症,其中至少一个免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区(FRs)；并且
-其中CDR1是SEQ ID NO:34所示的序列，CDR2是SEQ ID NO:62所示的序列和CDR3是SEQID NO:90所示的序列；或
-其中CDR1是SEQ ID NO:35所示的序列，CDR2是SEQ ID NO:63所示的序列和CDR3是SEQID NO:91所示的序列；或
-其中CDR1是SEQ ID NO:38所示的序列，CDR2是SEQ ID NO:66所示的序列和CDR3是SEQID NO:94所示的序列。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽选自由以下多肽组成的组，所述多肽包含SEQ ID NOs：6,7或10表示的免疫球蛋白单可变结构域。
3.根据权利要求1所述的多肽,所述多肽包含至少两个能够结合hP2X7的免疫球蛋白单可变结构域。
4.根据权利要求3所述的多肽,其中至少两个免疫球蛋白单可变结构域包含式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1至FR4是指构架区1至4并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区(FRs)。
5.根据权利要求4所述的多肽,其中至少两个免疫球蛋白单可变结构域选自免疫球蛋白单可变结构域的组,其中：
-CDR1是SEQ ID NO：34,CDR2是SEQ ID NO：62；并且CDR3是SEQ ID NO：90；
-CDR1是SEQ ID NO：35,CDR2是SEQ ID NO：63；并且CDR3是SEQ ID NO：91；和
-CDR1是SEQ ID NO：38,CDR2是SEQ ID NO：66；并且CDR3是SEQ ID NO：94。
6.根据权利要求3-5任一项所述的多肽,其中所述多肽选自由以下多肽组成的组，所述多肽包含各自选自SEQ ID NOs：6,7和10组成的组的至少两个免疫球蛋白单可变结构域。
7.根据权利要求3-5任一项所述的多肽,其中所述至少两个能够结合hP2X7的免疫球蛋白单可变结构域可以相同或不同。
8.根据权利要求1至5任一项所述的多肽，所述多肽还包含结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
9.权利要求8所述的多肽，其中所述结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是SEQ ID NO:126表示的Alb8或SEQ ID NO:125表示的Alb11。
10.根据权利要求1至5任一项所述的多肽,其中所述多肽是SEQ ID NO:118表示的多肽。
11.一种多肽，所述多肽包含至少两个针对由SEQ ID NO:1，2或3表示的人P2X7的免疫球蛋白单可变结构域,其中
a)至少一个第一免疫球蛋白单可变结构域针对所述人P2X7的第一抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象；并且其中,
b)至少一个第二免疫球蛋白单可变结构域针对所述人P2X7的分别不同于所述第一抗原决定簇表位,部分,结构域,亚单位或构象的第二抗原决定簇,表位,部分,结构域,亚单位或构象，
其中所述免疫球蛋白单可变结构域在权利要求1中定义。
12.根据权利要求1至5任一项所述的多肽,其中所述免疫球蛋白单可变结构域由以下组成：结构域抗体,适于用作结构域抗体的氨基酸序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的氨基酸序列,dAb,适于用作dAb的氨基酸序列,纳米抗体,VHH序列,人源化VHH序列或骆驼源化VH序列。
13.一种生产根据权利要求1至12任一项所述的多肽的方法,所述方法至少包含以下步骤：
a)在合适的宿主细胞或宿主生物中或在另一个合适的表达系统中表达编码根据权利要求1至12任一项所述的多肽的核酸或核苷酸序列。
14.权利要求13所述的方法，所述方法还包含分离和/或纯化所述免疫球蛋白单可变结构域或所述多肽的步骤。
15.筛选针对由SEQ ID NO:1，2或3表示的人P2X7的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)提供免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库；并且
b)从所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库中筛选能够结合所述人P2X7和/或对所述人P2X7具有亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；并且
c)分离能够结合所述人P2X7和/或对所述人P2X7具有亲和力的氨基酸序列，
其中所述免疫球蛋白单可变结构域如权利要求1-12任一项中所定义。
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