CN104507456B - 含有用于制造后叠氮化物炔烃环加成官能化的应变的环炔烃官能度的聚合物结构 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产生生物相容性聚合物结构的方法，包括以下步骤：提供含有应变的环炔烃端基的生物相容性聚合物；由所述生物相容性聚合物形成聚合物结构使得所述应变的环炔烃端基保持在所述生物相容性聚合物上；提供叠氮化物拴系的分子；以及，在形成所述聚合物结构之后，使所述叠氮化物拴系的分子与所述环炔烃在叠氮化物炔烃环加成反应中反应以进一步官能化所述聚合物结构。

Description

含有用于制造后叠氮化物炔烃环加成官能化的应变的环炔烃 官能度的聚合物结构
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月31日提交的美国专利临时申请No.61/677,691的优先权，所述专利的内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明通常属于生物相容性聚合物结构领域。更具体地说，本发明涉及具有应变的环炔烃官能度的生物相容性聚合物结构，所述应变的环炔烃官能度存活于制造聚合物结构的过程中。可通过叠氮化物炔烃环加成将环炔烃官能度有益地用于制造后官能化。
背景技术
二十多年来，已经在再生医学中提供了巨大的进步，希望材料将提供世界范围内存在的器官和组织短缺的解决方案。然而，克服剩余的挑战将需要许多另外的创新，特别是在具有引导再生过程的特定官能度的材料中的创新。
已经将具有机械性能、多孔微结构和与胶原纤维具有空间相似性的纳米纤维状脚手架用于模拟天然的细胞外基质(ECM)并在许多不同的应用中与组织工程高度相关。使用能够通过改变包括溶剂、浓度、添加剂和电极设计的条件控制尺寸、形态和取向的熔体或电纺丝方法已经将聚合物纳米纤维制成多种构建体和脚手架。
对于再生医学应用，用于制造基于纳米纤维的脚手架的聚合物前体应为生物相容的和生物可降解的。已经将许多生物可降解的和生物相容性聚合物(诸如聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚(ε-己内酯)(PCL))广泛研究为纤维和纳米纤维前体材料。尽管这些生物可降解的聚合物满足组织工程应用的若干基本要求，但是引导细胞行为和保存细胞表型的生物活性分子对于最佳性能是必需的。需要有效地掺入能够引导或指导特定生物功能的特定官能团。一般存在两种可用于生物分子官能化的方法：物理吸附和化学键合。虽然物理吸附存在随着时间的推移生物分子损耗的风险，但是化学缀合通常需要多步加工和纯化，两者均经常包括苛刻条件。
另外，纳米纤维的衍生化经常需要多步程序，包括等离子处理、湿式化学法、表面接枝聚合以及表面活性剂和聚合物的共电纺丝。这些修饰中的每一种为集中优化的时间和资源并且可能导致免疫特异性反应和生物相容性问题。
优选能够有效的、正交的和生物系统友好的官能化的新方法。已经将铜催化的点击化学用于聚合物的有效的官能化。然而，铜离子的副作用导致生物相容性问题。最近，应变-促进的叠氮化物炔烃环加成的发现已经为生物分子的有效缀合提供了稳健的化学方法。该方法已经被广泛地用于生物成像和生物缀合。本发明有益利用该点击化学并且为纤维脚手架的产生以及通过此类叠氮化物炔烃环加成化学的它们的制造后生物功能化提供指导。
已经将肽、生长因子和碳水化合物各自共价拴系至合成和天然衍生的聚合物表面以刺激特异性细胞功能。关于拴系物质的生物利用度、特异性和活性的关注持续存在。最近研究示出所需生物响应可用适当的拴系获得。许多合成的可降解的聚合物，包括聚(乳酸)目前在临床上利用；但是，细胞系统不能通过正常的整联蛋白介导的装配而与合成聚合物容易地直接相互作用。Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)，来自层粘连蛋白的生物活性肽，示出促进细胞粘附和层粘连蛋白受体结合。Graf,J.；Ogle,R.C.；Robey,F.A.；Sasaki,M.；Martin,G.R.；Yamada,Y.；Kleinman,H.K.Biochemistry 1987,26,6896-6900。YIGSR-官能化的基质已经示出与Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)肽(一种更普遍研究的层粘连蛋白-衍生的肽和层粘连蛋白-涂覆的基质)类似的或比其优异的细胞作用。本领域能够从YIGSR掺入至纳米纤维基质受益以促进胚胎干细胞至神经元的定向分化。然而，含有能够指导细胞功能的生物基序的可降解聚合物的精确的、配向性官能化对于溶剂、催化剂、残余物和加工方法已经如此复杂以致。作为官能化聚合物和材料的方法的点击化学的最近演化已经使得天然和合成聚合物两者能够以先前不可能的方式衍生化。
发明内容
本发明的第一实施方案提供了产生生物相容性聚合物结构的方法，包括以下步骤：提供包含应变的环炔烃端基的生物相容性聚合物；由所述生物相容性聚合物形成聚合物结构使得所述应变的环炔烃端基保持在所述生物相容性聚合物上；提供叠氮化物拴系的分子；以及，在所述形成步骤之后，使所述叠氮化物拴系的分子与所述环炔烃在叠氮化物炔烃环加成反应中反应以进一步官能化所述聚合物结构。
第二实施方案提供了如在第一实施方案中所述的方法，其中所述提供生物相容性聚合物的步骤包括通过采用具有应变的环炔烃的ROP引发剂的开环聚合使单体聚合以产生包含应变的环炔烃端基的所述生物相容性聚合物的步骤。
第三实施方案提供了如在第一或第二实施方案中所述的方法，其中所述ROP引发剂包含五至九元应变的环炔烃。
第四实施方案提供了如在第一至第三实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂还包含选自羟基或胺基的反应性基团。
第五实施方案提供了如在第一至第四实施方案中任一项所述的方法，其中所述反应性基团为羟基，并且在所述聚合步骤中聚合的单体为环酯。
第六实施方案提供了如在第一至第五实施方案中任一项所述的方法，其中所述反应性基团为羟基，并且在所述聚合步骤中聚合的单体选自内酯、丙交酯和乙交酯。
第七实施方案提供了如在第一至第六实施方案中任一项所述的方法，其中所述反应性基团为胺，并且在所述聚合步骤中聚合的单体为N-羧酸酐。
第八实施方案提供了如在第一至第七实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂包含8-元环炔烃。
第九实施方案提供了如在第一至第八实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
第十实施方案提供了如在第一至第九实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中X为氨基甲酸酯或碳酸酯，Y为亚甲基(CH2)或乙氧基(CH2CH2O)，n为1或以上至12或以下，并且Z为胺或羟基或羟乙基。
第十一实施方案提供了如在第一至第十实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中n为1至5。
第十二实施方案提供了如在第一至第十一实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中n为1至11。
第十三实施方案提供了如在第一至第十二实施方案中任一项所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中n为1至5。
第十四实施方案提供了如在第一至第十三实施方案中任一项所述的方法，其中所述形成聚合物结构的步骤包括选自电纺丝、熔喷、盐浸出脚手架、气体喷射的纳米纤维、喷墨印刷和3d打印的方法。
第十五实施方案提供了如在第一至第十四实施方案中任一项所述的方法，其中所述应变的环炔烃存活于所述形成步骤。
第十六实施方案提供了如在第一至第十五实施方案中任一项所述的方法，还包括在所述形成步骤之后储存所述聚合物结构的步骤以便保存所述应变的环炔烃端基，以及在所述储存步骤之后进行所述反应叠氮化物拴系的分子的步骤以便进行所述反应步骤的进一步官能化因为官能化为必需的并且可将此类官能化调整至所需官能度。
第十七实施方案提供了如在第一至第十六实施方案中任一项所述的方法，其中所述叠氮化物-官能化的基团选自叠氮化物-官能化的DNA、叠氮化物-官能化的肽、叠氮化物-官能化的蛋白质、叠氮化物-官能化的糖、叠氮化物-官能化的金属、叠氮化物-官能化的纳米颗粒和叠氮化物-官能化的抗菌剂。
第十八实施方案提供了根据以下结构的开环聚合引发剂：
其中X为氨基甲酸酯或碳酸酯，Y为亚甲基(CH2)或乙氧基(CH2CH2O)，n为1或以上至12或以下，并且Z为胺或羟基或羟乙基。
第十九实施方案提供了根据以下结构的开环聚合引发剂：
其中n为5。
附图说明
图1为用于合成二苯并环辛炔醇-官能化的聚(γ-苄基-L-谷氨酸)(DIBO-PBLG)的反应方案。
图2提供了具有不同进料比率的DIBO-PBLG的SEC结果。在50℃下于DMF中用LiBr(0.1mol/L)进行SEC。
图3提供了在电纺丝之前和之后的DIBO-PBLG的UV光谱，指示应变的环辛炔存活于脚手架制造过程(上图)。测量环加成反应之后留下的残余DIBO的第二实验指示约26％的基团能够反应(下图)。
图4提供了金纳米颗粒(50nm)官能化的纤维(A,B)和作为对照的未修饰的纤维(C,D)的SEM显微照片。图像A、B、C、D的比例尺分别为600nm、100nm、300nm和200nm。
图5提供了图1的反应方案的化合物4的1H NMR和13C NMR光谱。
图6提供了图1的反应方案的化合物5的1H NMR和13C NMR光谱。
图7提供了图1的反应方案的化合物6的ESI光谱。
图8提供了使用DIBO引发的4-二苯并环辛炔醇(DIBO)和聚(ε-己内酯)的1H NMR光谱(下)。经由b从4.7至5.6ppm的低场位移确认DIBO的存在和末端-官能化。
图9提供了9-亚甲基叠氮基蒽(黑色)和DIBO-PCL叠氮化物混合物(绿色)的荧光发射的比较。
图10提供了电纺丝之前和之后的DIBO-PCL的UV-可见吸收光谱，示出应变的环辛炔存活于电纺丝条件。
图11提供了末端-官能化的聚己内酯的1H NMR光谱。
图12提供了示出纳米纤维取向和YIGSR官能化对经3天培养的分化的小鼠胚胎干细胞胚胎(nanog和oct3/4)、神经祖先(pax6和巢蛋白)以及神经(神经元特异性III类β-微管蛋白(TUJ1)和微管-相关蛋白2(MAP2))基因表达的影响的图。样品组包括胚胎干细胞(ESC)样品、无规未官能化的(RU)样品、无规YIGSR官能化的(RF)样品、取向未官能化的(AU)样品和取向YIGSR官能化的(AF)样品。*的使用指示相对于ESC，p-值<0.05。#的使用指示相对于1天取向YIGSR官能化的样品，p-值<0.05。&的使用指示相对于3天取向YIGSR官能化的样品，p-值<0.05。
图13提供了在电纺丝之前和电纺丝之后聚合物的UV-可见光谱，证明DIBO基团存活于电纺丝。
图14提供了用于合成O-(戊-4-烯-1-基)羟基胺盐酸盐的反应方案。
图15提供了在一批中用无铜点击化学和肟连接合成双官能化聚合物的反应方案。
具体实施方式
本发明提供了用于产生由具有存活于产生过程的应变的环炔烃官能度的聚合物形成的聚合物结构的方法。在产生聚合物结构之后，通过应变-促进的叠氮化物炔烃环加成无铜“点击”化学官能化聚合物。可储存具有环炔烃官能度的聚合物结构并视需要通过简单的明确定义的叠氮化物炔烃环加成无铜“点击”化学将其后官能化。
至少部分包含应变的环炔烃端基的生物相容性聚合物形成聚合物结构。如本文所用，应变的环炔烃为五至九元或更高的环炔烃。在一些实施方案中，应变的环炔烃包含8-元环炔烃。在一些实施方案中，8-元环炔烃为4-二苯并环辛炔端基(DIBO端基)。
在一些实施方案中，环炔烃为选自聚谷氨酸、聚内酯、聚丙交酯、聚乙交酯以及前述的任何共聚物的生物相容性和生物可降解的聚合物上的端基。
在一些实施方案中，环炔烃为选自聚γ-苄基-L-谷氨酸、聚己内酯、聚乳酸和聚乙交酯以及前述的任何共聚物的聚合物上的端基。在一些实施方案中，环炔烃为选自聚(丙交酯-共-乙交酯),聚(丙交酯-共-己内酯),聚(己内酯-共-乙交酯)和聚(己内酯-共-3-酮己内酯)的共聚物上的端基。
在一些实施方案中，具有环炔烃端基的生物可降解的和生物相容性聚合物通过开环聚合(ROP)形成。这些聚合采用具有如上文所定义的应变的环炔烃的本文称为“ROP引发剂”。在一些实施方案中，应变的环炔烃包含8-元环炔烃。在一些实施方案中，8-元环炔烃为4-二苯并环辛炔(DIBO)基团。
值得注意的是，与环炔烃端基形成聚合物的ROP方法为特别有益的，因为环炔烃通常并不用作引发剂，并且，就生物相容性和生物可降解的聚合物而言，提供了使其官能化的方法，熟练的技术人员认为这是难以做到的。应变的环炔烃使得技术人员能够使用不需要催化剂或添加剂并且不会降解聚合物的条件衍生化可降解的聚合物。使用DIBO作为引发系统使得技术人员使用聚合物的分子质量控制聚合物中官能种类的化学计量，因为每条链中存在一个官能团。
在一些实施方案中，ROP引发剂包含应变的环炔烃并且具有选自羟基和胺基的反应性基团。具有羟基官能度，ROP引发剂适合于环酯(诸如内酯、丙交酯和乙交酯)的开环聚合。具有胺官能度，ROP引发剂适合于具有N-羧酸酐，诸如γ-苄基-L-谷氨酸N-羧酸酐的单体的开环聚合。
在一些实施方案中，环酯为5至9元环内酯。在一些实施方案中，环内酯选自ε-己内酯、1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮、γ-丁内酯和δ-戊内酯。
在一些实施方案中，单体选自乙醇酸和乙交酯。
在一些实施方案中，单体选自丙交酯和乳酸。
在一些实施方案中，ROP引发剂选自4-二苯并环辛炔醇(DIBO)：
在一些实施方案中，ROP引发剂选自其DIBO衍生物。在一些实施方案中，ROP引发剂为胺-官能化的DIBO衍生物或羟基-官能化的DIBO衍生物。在一些实施方案中，ROP引发剂根据以下结构选择：
其中X为氨基甲酸酯或碳酸酯键合，Y为亚甲基(CH2)或乙氧基(CH2CH2O)，n为1或以上至12或以下，并且Z为胺或羟基或羟乙基。
在一些实施方案中，X为氨基甲酸酯键合，Y为亚甲基，n为1至5，并且Z为胺，使得ROP引发剂具有以下结构：
在其特定实施方案中，n为5。
在一些实施方案中，X为碳酸酯键合，Y为亚甲基，n为1至11，并且Z为羟基，使得ROP引发剂具有以下结构：
在其特定实施方案中，n为1至6。
在一些实施方案中，X为碳酸酯键合，Y为CH2CH2O，n为1至5，并且Z为羟乙基，使得ROP引发剂具有以下结构：
在其特定实施方案中，n为5。
在一些实施方案中，ε-己内酯单体通过使用上文的DIBO的ROP聚合。在一些实施方案中，γ-苄基-L-谷氨酸N-羧内酸酐通过使用以下的ROP聚合：
其中n为5。在一些实施方案中，1-丙交酯单体通过使用DIBO的ROP聚合。在其它实施方案中，DIBO被用作ε-己内酯和1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮(TOSUO)的开环共聚的引发剂以产生DIBO-(P(CL-共-OPD))。
具有环炔烃端基的聚合物形成聚合物结构。考虑到任何给定聚合物的性质和限制(如，溶解度和热稳定性)，这些结构可以以任何合适的方式形成。在一些实施方案中，具有环炔烃端基的聚合物通过选自电纺丝、熔喷、盐浸出脚手架、气体喷射的纳米纤维、喷墨印刷和3d打印的方法形成聚合物结构。
在一些实施方案中，具有环炔烃端基的聚合物为电纺丝以形成纤维结构。电纺丝为熟知的方法，其中具有环炔烃官能度的聚合物溶解于适当的溶剂，所得电纺丝溶液为带电的，从喷丝头抽取至接地的收集器，并以收集器的形状形成纤维垫。在一些实施方案中，可将电纺丝方法用于产生具有应变的环炔烃官能度的生物可降解的和生物相容性聚合物的多孔的纤维基质。
合适的溶剂对本领域普通技术人员将为显而易见的。在一些实施方案中，溶剂选自含有10-50％乙醇的水溶液或含有10-50％甲醇的水溶液。
通过选择用于形成聚合物结构的合适的制造方法，环炔烃端基官能度存活于制造过程。通过叠氮化物炔烃环加成无铜“点击”化学，该官能度然后对于制造后官能化为可用的。点击化学为熟知的，并且可将所需官能度通过采用用于与炔烃通过环加成反应的叠氮化物拴系的分子赋予聚合物。如本文所用，叠氮化物拴系的分子为具有反应性叠氮化物基团的分子。
在特定实施方案中，叠氮化物-拴系的分子选自叠氮化物-官能化的DNA、叠氮化物-官能化的肽、叠氮化物-官能化的蛋白质、叠氮化物-官能化的糖、叠氮化物-官能化的金属、叠氮化物-官能化的纳米颗粒和叠氮化物-官能化的抗菌剂。
可在制造本发明的聚合物结构之后将其储存并保存应变的环炔烃端基。因此视需要可官能化聚合物结构。因此可用特异性选定的叠氮化物-拴系的分子将储备的聚合物结构调整至所需最终用途。应变的环辛炔仅与叠氮化物基团反应。因此在应变的环辛炔为可用的并且叠氮化物官能化分子为可溶的任何条件将导致共价环化。这在室温下于几分钟内发生并且反应速率随着温度的升高而增加。
本发明的这些和其它方面由以下实验的方面实验式地证明。
实验
实施例1:
经由应变-促进的叠氮化物炔烃环加成的电纺丝纳米纤维的组装后衍生化
在本工作中，将用伯胺基团官能化的4-二苯并环辛炔醇(DIBO)用作γ-苄基-L-谷氨酸N-羧内酸酐(Bz-L-GluNCA)开环聚合的引发剂以产生4-二苯并环辛炔醇官能化的聚(γ-苄基-L-谷氨酸)(DIBO-PBLG)。PBLG为通用的、可降解的材料，其可采用α-螺旋和β-折叠构象，当与蛋白预吸附技术使用时，其被用于研究细胞粘附和增殖。钙与PBLG的高的结合亲和力对于骨再生应用也是有希望的。
如图1中所述合成DIBO-PBLG。根据先前描述的方法合成应变的DIBO前体。用对硝基苯基氯甲酸酯衍生化DIBO并与过量的己二胺进一步反应以产生伯胺-衍生的DIBO化合物，6(图1)。根据先前报道的程序合成γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧内酸酐(Bz-L-GluNCA)并通过快速色谱法纯化。
在纯化之后立即使用DIBO引发剂。在一系列聚合中，将胺衍生的DIBO用作Bz-L-GluNCA在无水DMF中于氮气下保持3天的开环聚合的引发剂以产生DIBO官能化的PBLG。DIBO-PBLG的分子量随50:1至500:1渐增的进料比率线性增加。对应的分子量分布从1.14增加至1.29，这展示这些聚合得到很好的控制并且与渐增的进料比率显示出线性生长动力学。不同的进料比率条件和所得分子量以及所得聚合物的分子量分布经由DMF相SEC测量并且示于图2中。在渐增的进料比率出现的高分子质量肩部与其他人已经报道的使用基于胺的引发剂用于PBLG的聚合相一致并且最可能是由于水引发的聚合物。
然后将DIBO-衍生的PBLG用作官能前体用于纳米纤维的电纺丝以生成无铜可点击的脚手架。DIBO-PBLG(Mn＝128K,PDI＝1.29)和未修饰的PBLG(分子量150,000-350,000,Sigma)均在12重量％的1,4-二噁烷溶液中制备。将每种聚合物溶液保持在玻璃吸管中并从尖端处内径为300μm的孔口进行电纺丝。对于修饰的聚合物，22cm尖端-至-收集器距离范围内的电势为6kV，而对于未修饰的聚合物，27cm尖端-至-收集器距离范围内的电势为12kV。将适当的正气压应用至溶液表面以保持进料速率。在导电玻璃载片上收集纤维用于随后的荧光测量，在硅晶片上收集纤维用于SEM观察，以及在铜载网上收集纤维用于TEM观察。将每种类型的收集器置于大的接地的铝箔垫的顶部用于电纺丝纤维的收集。在SEM观察之前，将样品用离子覆膜机(SPI Supplies,Pennsylvania,USA)镀银。由SEM显微照片，观察到获得的纤维的直径接近1μm。
为了确认电纺丝过程之后应变的DIBO基团的存活，将纤维溶解于DMF中并且溶液的UV-可见光谱示出接近306nm处存在光跃迁，这对应于制造过程之前和之后的DIBO中的炔烃基团(图3)。已经通过电纺丝确认了DIBO基团的存活，下一步研究纤维表面上用于生物功能化的DIBO的可用性。
使用UV-可见光谱定量纳米纤维表面上可用的DIBO反应的程度。使得对于PBLG为非溶剂的9-亚甲基叠氮基蒽在甲醇中的溶液与电纺丝纤维的垫反应。同时，使得对于PBLG为优良溶剂的9-亚甲基叠氮基蒽在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液与DIBO-引发的PBLG的当量溶液反应。在反应之后测量纳米纤维官能化后的吸光度和具有相同浓度的PBLG-DIBO的吸光度并且由DIBO中炔烃转换的吸光度的下降，纤维表面上可用于衍生化的DIBO基团的分数为26±5％。
进行利用含有荧光探针的叠氮化物(Chremo 488叠氮化物)的组装后实验。将含有纤维的玻璃盖玻片浸入0.4％(mg/mL)的荧光探针溶液中保持5min。在短暂的温育之后，移除纤维-负载盖玻片，用甲醇洗涤并在氮气下干燥。使用荧光显微镜，发现叠氮化物官能化的荧光探针与纤维表面上的DIBO基团反应。未衍生的PBLG在甲醇之后未显示出荧光。这些实验指示在表面上的DIBO基团通过应变-促进的叠氮化物-炔烃环加成用于官能化的可用性。
纤维表面上存在DIBO基团的其它证据获得自在浸入叠氮化物官能化的金纳米颗粒的溶液之后的纤维的SEM显微照片。将纤维负载硅晶片浸入叠氮化物官能化的金纳米颗粒的溶液(50nm,Nanocs,稀释500倍)保持5h，这之后将晶片用超纯水(nanopure water)(18MΩ/cm-1)洗涤并真空干燥。SEM图像清楚地示出在纤维表面存在金纳米颗粒，这确认在纤维表面上的DIBO基团可用于官能化(图4)。使用由未修饰的PBLG组成的纤维进行对照实验，这令人信服地示出金纳米颗粒至纤维表面的非特异性物理吸附是可以忽略的(图4)。
用透射电子显微镜(TEM)的其它实验确认纤维表面上DIBO基团的存在和可用性。在环境温度下将负载有纳米纤维的TEM网格浸入叠氮化物-官能化的金纳米颗粒溶液中保持1h，这之后将网格用超纯水(18MΩ/cm-1)洗涤并真空干燥。TEM图像示出金纳米颗粒存在于纳米纤维表面。含未修饰的纳米纤维的对照实验示出在浸入含有纳米颗粒的溶液之后金纳米颗粒的非特异性物理吸附为明显的。
因此，首次展示胺-衍生的DIBO单元作为用于开环聚合的引发剂的实用性。另外，DIBO基团存活于电纺丝程序。所得纳米纤维脚手架然后可用于任何数目的叠氮化物-衍生的分子的组装后官能化。纳米纤维表面上基于无铜点击化学的生物功能化位点的可用性提供通用的方法以产生多种有希望应用于再生医学的高度官能的脚手架。
DIBO和胺-衍生的DIBO的合成细节和特征包括在下文中。
通用方法和材料
化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich和Acros并且没有进一步纯化即使用。所有反应在无水条件下于氩气气氛中进行。快速色谱在硅胶(Sorbent Technologies Inc.,70-230目)上进行。荧光探针Chromeo 488叠氮化物购自Active Motif，叠氮化物官能化的金纳米颗粒(50nm)购自Nanocs，使用Varian NMRS 500和Varian NMRS 300获得1H和13C NMR光谱。用来自BioTek的SynergyTM MX测量UV光谱，使用来自TOSOH的HLC-8320GPC获得SEC结果，用4kV的工作电压使用JEOL-JSM-7401F获得SEM图像，用120kV的加速电压由Philips TECNAITEM获得TEM图像。
2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.l]壬-2,6-二烯(1)
将250mL烧瓶火焰干燥并装载氩气。然后经由注射器加入苯乙醛(18.52g,0.154mol)和100mL氯仿(无水)。将反应烧瓶在冰浴中冷却。将三甲基碘硅烷(25mL,37.5g,0.188mol)加入至溶液并使反应在5℃静置7天。通过TLC监控反应。7天之后，加入硫代硫酸钠(1.0M,160mL)和氯仿(200mL)，并搅拌混合物直至排出碘的颜色。分离有机相、干燥(硫酸钠)并真空浓缩。用氯仿洗脱的硅胶上的色谱法得到6.1g晶体醚化合物(35％)。
3-羟基-2’,3’,2”,3”-四甲氧基,-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(2)
将含2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.1]壬-2,6-二烯1(2.00g,5.84mmol)的无水THF(60mL)置于三颈圆底烧瓶中并在冰浴中于氩气下冷却。经由注射器缓慢加入正丁基锂(4.92mL,2.5M,12.4mmol)。将反应混合物在室温下于氩气中搅拌4h。通过小心地加入水猝灭反应并用2XSOmL CHCl3萃取。将合并的有机相用30mL盐水洗涤，经Na2S04干燥，真空浓缩并通过柱色谱法在硅胶CHC13上纯化以得到1.83g 3-羟基-2’,3’,2”,3”-四甲氧基,-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(90％)。
11,12-二溴-5,6,11,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(3)
将溴(0.51mL,10mmol)逐滴加入至2(2.22g,10mmol)在CHC13(50mL)中的搅拌的溶液。在将混合物搅拌0.5h之后，TLC分析指示反应完成。将溶剂在减压下蒸发并将残余物通过快速色谱法经由硅胶(2:1/1:2,v/v,己烷/CH2Cl2)纯化以得到呈浅黄色油状物的3(60％)。
5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(4)
在氩气气氛下，将含二异丙基酰胺锂的四氢呋喃(2.0M；8.0mL,16mmol)逐滴加入至3(1.53g,4.0mmol)在四氢呋喃(40mL)中的搅拌的溶液。将反应混合物搅拌0.5h，这之后通过逐滴加入水(0.5mL)将其猝灭。将溶剂在减压下去除，并将残余物通过快速色谱法在硅胶(己烷/CH2Cl22:1/0:1,v/v)上纯化以得到呈白色无定形固体的4(0.52g,60％)。图5提供了化合物4的1HNMR和13C NMR光谱。
碳酸,5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(5)
将4-硝基苯基氯甲酸酯(0.4g,2mmol)和吡啶(0.4mL,5mmol)加入至4(0.22g,1mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液。在室温搅拌4h之后，将混合物用盐水(2×10mL)洗涤并将有机层干燥(MgSO4)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯,10:1,v/v)纯化以得到5(0.32g,82％)。图6提供了化合物5的1H NMR和13C NMR光谱。
6-氨基己基-氨基甲酸5,6-二氢-11,12-二脱氢二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯(6)
向己二胺(151mg,1.3mmol)和13.2ul TEA在CH2Cl2中的50ml溶液加入5(50mg,0.26mmol)。在搅拌3h之后，将有机相用10×20ml水洗涤，并经Na2SO4干燥。将溶剂在真空下去除并通过快速色谱法在硅胶(CH2Cl2/CH3OH,3:1含有0.5％异丙胺)上纯化以得到6(31mg,65％)。图7提供了化合物6的ESI光谱。
DIBO官能化的聚γ-苄基-L-谷氨酸的合成
将γ-苄基-L-谷氨酸N-羧内酸酐(Bz-L-GluNCA)和6溶解于在火焰干燥的舒伦克瓶中的无水DMF中。在三次冷冻、抽气、解冻循环之后，将聚合在氮气下静置3天。将聚合物在乙醚中沉淀并真空干燥。
电纺丝
DIBO-PBLG和未修饰的PBLG均在12重量％的1,4-二噁烷溶液中制备。将每种聚合物溶液保持在玻璃吸管中并从尖端处内径为300um的孔口进行电纺丝。对于修饰的聚合物，22cm尖端-至-收集器距离范围内的电势为6kV，而对于未修饰的聚合物，27cm尖端-至-收集器距离范围内的电势为12kV。将适当的正气压应用至溶液表面以保持进料速率。在导电玻璃载片上收集纤维用于随后的荧光测试，在硅晶片上收集纤维用于SEM观察，以及在铜载网上收集纤维用于TEM观察。将每种类型的收集器置于大的接地的铝箔垫的顶部用于电纺丝纤维的收集。在SEM观察之前，将样品用SPI离子覆膜机镀银。
UV光谱
在电纺丝之前和之后的DIBO-PBLG的UV光谱使用读板仪在DMF溶液中进行测量。
实施例2:
4-二苯并环辛炔醇(DIBO)作为引发剂用于聚(ε-己内酯):无铜可点击的聚合物和基于纳米纤维的脚手架
在本工作中，使用4-二苯并环辛炔醇(DIBO)来引发ε-己内酯(ε-CL)的聚合。该方法产生末端-官能化的PCL，其与叠氮化物-衍生的化合物在无金属条件下容易地官能化。这是重要的因为PCL的合成后修饰和纯化已经由于其降解性而受限。
使用辛酸亚锡在传统的基于Sn的催化条件下进行聚合：
DIBO(28mg,0.13mmol)、ε-CL(2.50g,21.93mmol)和新鲜蒸馏的辛酸亚锡(0.053mmol)。在加入至火焰干燥的舒伦克瓶和冷冻-抽气-解冻脱气的三次循环之后，在80℃下用4h至20h变化的反应时间加热反应物。聚合条件产生分子质量与时间几乎线性增加的生物学特性。
图8示出DIBO引发剂(上)和所得PCL聚合物(下)的1H NMR光谱。苯基共振态(～7.3)、来自应变环(2.9,3.1)的亚甲基(CH2)和b(CHOH)从4.6至5.6的低场位移的保留示出DIBO成功地引发PCL的聚合，并且在聚合过程中存活完整。尺寸排阻色谱(SEC)洗脱克数指示DIBO–PCL的分子质量随着4h至20h的增长的聚合时间线性增加，同时多分散性在分子质量分布中保持窄的且单峰。
聚合之后PCL链末端处DIBO基团的反应性使用DIBO和9-亚甲基叠氮基蒽之间的无金属点击反应确认。简而言之，将DIBO–PCL(Mn＝4.5kDa,7.7mg,1.7×10-3mmol)加入至含9-亚甲基叠氮基蒽溶液的DMSO(500μL,1.4×10-4mmol)中。15min之后，将溶液稀释100倍并获得荧光发射光谱。
在将叠氮化物溶液和DIBO-PCL溶液混合之后，导致荧光强度增加～7倍(图9)。将相同浓度的叠氮化物分子的溶液用作对照。
然后经由电纺丝过程将DIBO-PCL(Mn＝20k)用于生成纳米纤维。含DIBO-PCL溶液40％(重量/mL)的DCM/DMF(4/1)经受明确界定的电纺丝条件：5.5kv电压和10cm塔板高度。使用这些条件成功获得直径接近500nm的PCL纳米纤维。
图10示出在电纺丝之前和之后的DIBO-PCL聚合物的UV-可见吸收光谱。在电纺丝过程之后，306nm处来自炔烃基团的π-π*光跃迁不会改变位置或相对强度，证明DIBO基团存活。
使用含有叠氮化物荧光探针(Chemo 488叠氮化物)的反应证明纤维表面上DIBO基团的反应性。在环境温度下，将涂有纤维的玻璃载片浸入0.4％(mg/mL)该荧光染料的溶液保持5min。然后将玻璃载片用水洗涤并在氮气下干燥。DIBO-PCL纳米纤维的荧光图像示出9-亚甲基叠氮基蒽的共价衍生化。所得纳米纤维为高度荧光的，指示DIBO基团存在于纳米纤维的表面并且能够与含有叠氮化物的染料反应。在相同条件下使用来自未修饰的PCL的纤维于对照实验中观察到非常少的荧光，指示荧光探针的非特异性吸附是可以忽略的，并且荧光是由于染料和纤维表面上DIBO基团之间的无铜点击反应。
4-二苯并环辛炔醇(DIBO)作为引发剂用于ε-己内酯的开环聚合产生DIBO末端-官能化的PCL聚合物。DIBO基团存活于聚合条件并为聚合物和聚合物-衍生的生物材料提供有效的、正交的和生物相容性官能化机会。PCL和DIBO的组合使得能够大规模生产新型的具有通用的再生医学应用的容易官能化的基于纳米纤维的脚手架。
方法和材料
化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich或Acros并且没有进一步纯化即使用。所有反应在无水条件下于氩气气氛中进行。在硅胶(Sorbent Technologies Inc.,70-230目)上进行快速色谱法。在使用之前将辛酸亚锡(Aldrich)和ε-己内酯(Acros Organics)蒸馏。
使用配备有三个HR-Styragel柱[100,混合床(50/500/103/104),混合床(103,104,106)]和包括差示折光计(Waters 410)、差示粘度计(Viscotek100)和激光散射检测器(Wyatt Technology,DAWN EOS,λ＝670nm)的三个检测器的Waters 150-C Plus仪器进行尺寸排阻色谱分析(SEC)。在30℃下将流速为1.0mL/min的THF用作洗脱液。根据光散射数据计算分子量和多分散性。
使用Varian Mercury 300NMR和500NMR分光仪获得1H核磁共振(NMR)光谱。使用来自BioTek的SynergyTM MX读板仪测量UV-可见光谱。使用工作电压为1kV的JEOLJSM-7401F获得SEM图像。使用CKX41显微镜(Olympus,Center Valley,PA)获得荧光图像。
4-二苯并环辛炔醇(DIBO)的合成已经实验式地示于实施例1并且这里不再重复。
将DIBO(28mg,0.13mmol)、ε-CL(2.50g,21.93mmol)和新鲜蒸馏的辛酸亚锡(0.053mmol)加入至火焰干燥的舒伦克瓶。在冷冻-抽气-解冻脱气的三次循环之后，在80℃用变化的反应时间加热反应物。在指定的聚合时间之后，将反应在液氮中猝灭，溶解于THF并在冷的甲醇中沉淀。如上所述收集分子质量、质量分布、UV可见和NMR光谱。末端-官能化的PCL的1H NMR光谱示于图11中。
实施例3:
在用YIGSR肽官能化的取向聚(丙交酯)纳米纤维上的小鼠胚胎干细胞的定向分化和神经突延伸
这里我们报道产生能够在制造后用任何叠氮化物官能化分子被衍生的纳米特征的聚-L-丙交酯(PLLA)的通用的和潜在地转化方法。PLLA为再生医学应用中得到广泛接受且应用的材料，然而产生指导细胞行为的合适的官能变体仍充满挑战。电纺丝被用于产生纤维直径接近示出促进干细胞神经分化和神经突延伸的纳米形貌尺寸的纳米纤维基质，其中使用无金属炔烃-叠氮化物环加成用YIGSR肽进行脚手架的官能化。此类方法呈现了用于产生官能化脚手架的温和的且有效的方法，所述官能化脚手架避免PLLA降解并能够以翻译相关的方式制造纳米纤维垫。在此，我们展示了在取向YIGSR纳米纤维基质上以可容易地被放大和转化成其它应用和临床的方式小鼠胚胎干细胞至神经系的直接分化。
材料
化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich，除非具体指明，否则没有进一步纯化即使用。所有反应在无水条件下于氩气气氛中进行。在硅胶(Sorbent Technologies Inc.,70-230目)上进行快速色谱法。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护的氨基、Fmoc-氨基酸负载的-王氏树脂和-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)购自NovaBiochem。根据先前的文献合成4-二苯并环辛炔醇(DIBO)并在使用前于真空中经P2O5干燥72小时(DIBO合成根据Ngalle Eric Mbua,J.G.,Margreet A.Wolfert,Richard Steet,Geert-Jan Boonschembiochem 2011,12,1912–1921；Jung,M.E.；Mossman,A.B.；Lyster,M.A.The Journalof Organic Chemistry 1978,43,3698-3701)。在惰性气氛下，将1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)新鲜蒸馏至来自CaH2的可密封的安瓿中。将l-丙交酯(l-LA,Purac)首先溶解于二氯甲烷中，通过二氧化硅柱塞然后经无水MgSO4搅拌。然后将溶液过滤并真空去除二氯甲烷。在旋转蒸发仪上真空蒸发至干燥之前，将所得固体溶于热的甲苯中。然后将所得结晶固体转移至舒伦克瓶并溶解于无水热的甲苯中并将溶剂然后在真空歧管上真空去除。将结晶的白色固体然后溶于无水二氯甲烷中，通过套管转移至活化的3分子筛上并静置24h，然后第二次转移至新鲜的3筛持续另外24h。将二氯甲烷/l-LA溶液然后使用过滤套管转移至舒伦克瓶并真空去除二氯甲烷。最后，将所得白色固体从热的(70℃)甲苯重结晶并在环境温度下储存在手套箱中。含重氢的氯仿(CDCl3)购自Apollo Scientific Ltd并在使用之前从CaH2蒸馏。
总论
除非另有说明，否则所有操作在填充氮气的手套箱中进行。在298K下，将1H和13CNMR光谱记录在Bruker DPX-400分光仪上。化学位移记录为在百万分之一的δ(ppm)并参考残余溶剂共振态的化学位移(CHCl3:1Hδ＝7.26ppm；13Cδ＝77.16ppm)。在配有示差折光检测器以及由短的保护柱(Varian Polymer Laboratories PLGel 5μM,50×7.5mm)和两个其它的色谱柱(Varian Polymer Laboratories PLGel 5μM,300×7.5mm)组成的混合的-D柱装置的Varian GPC 50仪器上进行尺寸排阻色谱(SEC)。流动相是流速为1.0mL min-1的CHCl3(HPLC级)。使用Cirrus v3.3软件用Varian Polymer Laboratories Easi-Vials线性聚(苯乙烯)标准(162–2.4×105g mol-1)校准SEC样品。
典型DIBO-封端的PLLA合成
在手套箱中，将l-LA(2g,1.39×10-2mol,200当量)和DIBO(15.3mg,6.95×10- 5mol,1当量)加入至配备有磁力搅拌棒的玻璃小瓶中并溶解于二氯甲烷(13.9mL)中。在迅速搅拌下，然后加入DBU(21.12mg,1.39×10-4mol,2当量)。在30min之后，通过加入Dowex50w x8(20-50目)酸性树脂猝灭反应随后将聚合物沉淀至冷的己烷。在再溶解于CHCl3之前通过过滤分离沉淀物并再两次沉淀至冷的己烷中。将所得白色固体然后经受高真空保持48h以去除痕量溶剂(1.5g,74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝7.52(m,8H,DIBOC6H4),5.59(s,1H,CH(OH)),5.16(q,1H,OCH(CH3)C(O)),4.35(m,1H,CH(CH3)OH),3.00(m,2H,DIBOCH2),1.58(d,3H,OCH(CH3)C(O)).13CNMR(100MHz CDCl3,ppm):δ＝169.8,69.2,16.8.GPC(CHCl3,聚(苯乙烯)标准)：表1。
电纺丝
将DIBO-封端的PLLA(DIBO-PLLA)溶解于1:4(v/v)N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液以产生25％(w/v)浓度的澄清的、略微粘性的溶液。摇振溶液并留下过夜以确保匀质性。用Parafilm(Pechiney Plastic Packaging,Chicago,IL)密封溶液小瓶以保持溶液的浓度。将溶液保持在通过将玻璃移液管加热并抽取至0.4mm的外径制得的锥形管中。调节溶液上方的气压以控制流动。将喷流内部的溶液连接至高压电源(0～60kV,ES60,Gamma HighVoltage Research,Ormond Beach,FL)，并将样品收集器接地。将12kV的电压应用至DIBO-PLLA溶液，并且尖端-至-屏的距离为20cm。对于无规纤维，将铝箔用作接地的收集器。将圆形玻璃盖玻片(18mm直径,18CIR,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)置于铝箔上以收集纤维。对于取向纤维，制造并使用具有细长开口为20mm×70mm的特定薄片的不锈钢收集器。将取向纤维在置于不锈钢收集器的缺口中的玻璃盖玻片上收集。
肽合成
使用标准的FMOC条件在CEM Discovery微波肽合成器上合成Br-GYIGSR。将N-端用如显现描述的6-溴己酸衍生。Moore,N.M.；Lin,N.J.；Gallant,N.D.；Becker,M.L.Biomaterials 2010,31,1604-1611。将粗的Br-封端的肽通过反相HPLC纯化。将Br端基用在23℃搅拌过夜的含有18-冠-6(0.05当量)的1:2的甲醇:水溶液中的叠氮化物基团取代。将叠氮化物-取代的肽通过透析纯化以消除NaN3残余物，并在冻干之后获得浅黄色固体。该取代通过ESI-质谱确认(MW＝789.3Da)。
纳米纤维官能化
将N3-GYIGSR肽溶解于1:2的水/甲醇(v/v)以产生0.5mg/mL溶液。将覆盖有电纺丝纤维的玻璃载片小心地浸入肽溶液三次并用1:2的水/甲醇溶液漂洗。将官能化的纤维干燥过夜并用环氧乙烷灭菌。将灭菌的纳米纤维脱气3天。
劳瑞测定
在纤维上的YIGSR浓度使用如先前描述的劳瑞测定确定。Miller,J.S.；Shen,C.J.；Legant,W.R.；Baranski,J.D.；Blakely,B.L.；Chen,C.S.Biomaterials 2010,31,3736-3743。简而言之，将1.0mg肽官能化的聚合物溶解于1.000mL DMSO中。通过将1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL或20ug/mL的YIGSR肽溶解于含有1.0mg聚合物/mL的DMSO中产生标准曲线。根据制造方案使用Dc蛋白测定(Biorad,Hercules,CA)测量每种样品内的总蛋白。
扫描电子显微术
纤维大小和取向通过SEM(JSM-7401F,JEOL,Peabody,MA)评估。将加速电压设置在1kV。在成像之前，纤维未进行溅射涂覆。使用Image J通过测量超过100根纤维计算纤维直径和角度。
D3小鼠胚胎干细胞培养和接种
将D3小鼠ESC[Doetschman,T.；Eistetter,H.；Katz,M.；Schmidt,W.；Kemler,R.JEmbryol Exp Mophol 1985,87,27-45]培养在ESC培养基(补充有10％FBS,10-4Mβ-巯基乙醇,0.224μg/mL L-谷氨酰胺,1.33μg/mL HEPES和1,000单位/mL人类重组LIF的DMEM)中的0.1％明胶-涂覆的组织培养瓶上。将纳米纤维-负载的盖玻片放在12孔板中，用环氧乙烷灭菌，然后用80％F-12/20％Neurobasal培养基(Invitrogen,Grand Island,NY)润湿保持1h。将D3细胞(325,000)均匀地接种在于400μL新鲜神经培养基(含有N2和B27补充物，10mM丙酮酸钠以及1μM视黄酸的80％F-12/20％Neurobasal培养基)中的每个样品上。在整个实验期间，每隔一天更换培养基。
免疫荧光和碱性磷酸酶定量
如先前描述进行免疫荧光。Smith Callahan,L.A.；Ma,Y.；Stafford,C.M.；Becker,M.L.Biomaterials Science 2013。简而言之，将培养在纳米纤维-涂覆的盖玻片上的细胞在指定的时间点用4％多聚甲醛/PBS固定、洗涤并在4℃于PBS中储存。非特异性抗体结合通过在10％山羊血清中温育而阻断，然后将梯度暴露于神经元特异性III类β-微管蛋白(TUJ1)(PRB-435p,Covance,1:500)，随后将适当的第二抗体与Alexaflour 544(Invitrogen)缀合。使用DAPI对细胞核染色。用自动化的IX81显微镜(Olympus)拍摄图像。通过使用ImageJ的自动化计数功能以计数在每个位置处来自至少5个单独的样品的图像中的细胞核确定每个位置处的细胞密度。使用ImageJ(NationalInstitute of Health,Bethesda,MD,USA)测量来自至少3个单独样品/组的至少250个细胞制成来自细胞核的神经突长度的统计平均值。使用ImageJ细胞计数器并将每个时间点时表达TUJ1的染色的细胞的总数目除以在至少10个视野/样品和1000个细胞/样品组中的细胞核的数目确定表达TUJ1的细胞的分数。碱性磷酸酶的定量根据制造商的方案用SensoLyte pNNP碱性磷酸酶测定试剂盒(AnaSpec,Fremont,CA)确定。为了归一化，根据制造商的方案用Dc蛋白测定(Biorad,Hercules,CA)测量样品中的总蛋白。
半定量PCR
在用细胞刮棒从材料样品收获细胞之后根据制造商的方案使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从至少三个复制品中分离总RNA。使用260nm的吸光度(RNA)与280nm的吸光度(蛋白质)的光密度比率大于1.9的RNA样品制备cDNA。基于260nm处的吸光度读数，使用2710热循环仪(Applied Biosystems)用TaqMan逆转录试剂使用来自每个样品的0.5mg RNA制备cDNA。热循环仪的程序如下：在25℃温育10min，在48℃下逆转录30min，和在95℃失活5min。对于以下中的每种使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)使两微升的每个反应经受PCR：
Nanog(5’-agggtctgctactgagatgctctg-3’和5’-atcttctgcttcctggcaag-3’)；Oct3/4(5’-ggggatccgatggcatactgtggacctcag-3’和5’-gggaattcgcttcgggcacttcagaaac-3’)；pax6(5’-aagggcggtgagcagatgt-3’和5’-gcatgctggagctggttgg-3’)；巢蛋白(5’-gtgcctctggatgatg-3’和5’-ttgaccttcctccccctc-3’)；TUJ1(5’-tcactgtgcctgaacttacc-3’和5’-ggaacatagccgtaaactgc-3’)；微管-相关的蛋白2(MAP2)(5’-gaggcagaagctccaaga-3’和5’-ctggacccactccacaaact-3’)；少突细胞转录因子1(OLIG1)(5’-tgcgcgcgagaaggccgaag-3’和5’-cccagccagccctcacttg-3’)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(5’-gaggcagaagctccaaga-3’和5’-gctctagggactcgttcgtg-3’)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(5’-accacagtccatgccatcac-3’和5’-tccaccaccctgttgctgta-3’)。
Nanog和Oct3/4的循环条件为94℃保持5min随后94℃保持30s，55℃保持60s，72℃保持60秒，pax6和TUJ1的循环条件为94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持60秒；巢蛋白的循环条件为94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持45秒；GFAP和OLIGO1的循环条件为94℃保持30秒，56℃保持30秒，72℃保持60秒；以及GAPDH的循环条件为94℃保持30秒，62℃保持30秒，72℃保持60秒。所有扩增进行35个循环和随后在72℃进行10min的延伸。将PCR产物上样在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶中并在100V下运行45min。用BiospectrumImaging System(UVP,Upland,CA)获得凝胶的荧光图像。用VisionWorks LS(UVP)分析条带的相对密度并归一化至针对样品的GAPDH密度。
统计
如每部分所指出的将所有实验用多个底物进行至少3次(n≥3)。所有定量数据呈现为平均值±标准偏差。在适用情况下用Tukey事后分析进行单向方差分析(ANOVA)。显著性设置为p-值小于0.05。
结果
使用4-二苯并环辛炔醇(DIBO)作为引发剂通过由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)催化的L-丙交酯的开环聚合如下进行末端-官能化聚(L-丙交酯),PLLA的合成：
该技术简化了催化残余物的去除并使能够靶向具有高的端基保真性的高分子量PLLA。在30min内获得具有170、200和370的靶向聚合度的PLLA并产生具有窄的摩尔质量分布的41.1、59.5和87.4kDa的聚合物。
纳米纤维状基质，其仿真天然ECM的尺度，示出比传统的组织工程基质更有效地促进细胞粘附、增殖和分化。电纺丝为一种能够在ECM尺度上生成纳米纤维的方法。使用DIBO-PLLA，制造无规和取向纤维两者；平均纤维直径分别为345nm±51nm和338nm±63nm。取向基质具有高度的取向，其中取向纤维的窄的角度分布为～89.5°±6.5°。发现官能化的纳米纤维具有4.94μg±2.76μg(平均值±标准偏差)的YIGSR肽/1000μg官能化的纤维。
表1.对于合成的4-二苯并环辛炔醇(DIBO)封端的-L-丙交酯的尺寸排阻色谱结果的概述
纤维直径、取向和官能化可影响神经祖先分化和神经突延伸5、6、28-30。在分化1天之后，与在无规未官能化的(0.53±0.03；p-值＝0.001)和官能化的样品(0.53±0.02；p-值＝0.001)上培养的ESC相比，在取向官能化的样品(0.75±0.07(平均值±标准偏差))上培养的显著较高分数的ESC表达TUJ1，而在取向未官能化的样品上培养的ESC表达中间分数的TUJ1(0.63±0.03)。在分化3天之后，与在无规未官能化的样品(0.56±0.01,p-值＝0.04)上培养的ESC相比，在取向官能化的样品(0.71±0.01)上培养的显著较高分数的ESC表达TUJ1。无规官能化的(0.61±0.01)和取向未官能化的样品(0.61±0.08)表达中间分数值。纤维取向对干细胞分化至神经系的影响的先前研究已经与某些指示和我们的结果相似的或指示取向不会影响表达TUJ1的细胞的分数的其它结果出现分歧。细胞系和分化方案之间的差异，特别是暂时地，最可能有助于该矛盾。在取向官能化的样品上培养的ESC的平均神经突长度显著长于在无规未官能化的和未官能化的样品上培养的ESC的平均神经突长度。结果类似于已经发现纤维取向和YIGSR的掺入与对照相比改善神经突延伸的先前研究。细胞密度的细微差异不可能影响这些结果因为在研究的每个时间点(数据未示出)相似量的DNA分离自所有样品组。然而，纤维密度不能再样品之间得到精确控制并且可能有助于组间的差异。
胚胎干细胞标记物、nanog和Oct 3/4的基因表达在起始ESC群体中较高并随着将所有样品组中的ESC渐增暴露于神经分化培养基而下降。与相对于每种样品的总蛋白随着时间的推移而减少(数据未示出)的碱性磷酸酶定量相组合指示所有样品组支持ESC分化。尽管所有样品组支持ESC分化，但是在1天之后取向官能化样品上的ESC与ESC起始群体相比示出Oct 3/4mRNA表达的显著下降，而在其它组上需要3天培养的ESC相对于ESC起始群体在Oct 3/4mRNA表达中示出显著下降。在分化1天之后，与ESC起始群体相比，PAX6mRNA表达，神经祖先标记物在所有样品组上的ESC中上调(图12)。相似地，在无规未官能化的、取向未官能化的和取向官能化的样品上培养的ESC神经分化1天之后，与ESC起始群体相比发现巢蛋白mRNA表达，另一神经祖先标记物上调(图12)。在3天神经培养之后，pax6和巢蛋白的mRNA表达在所有样品组上的ESC中下降，指示ESC的分化超出神经祖先。在分化3天之后，与在其它样品组上培养的ESC相比，TUJ1的mRNA表达(未成熟的神经元标记物)在取向官能化的样品上培养的ESC中显著增加(图12)。在3天分化之后，与在未官能化的无规和取向样品上培养的ESC相比，MAP2mRNA表达(成熟的神经元标记物)在取向官能化的样品上培养的ESC中也上调(图12)。在任何样品组上培养的ESC中通过PCR未检测到GFAP(星形胶质细胞标记物)和Oligo1(少突细胞标记物)，指示那些细胞类型还未出现在培养物中(数据未示出)。虽然已经示出纤维取向影响干细胞中的基因表达，检查纤维-取向或YIGSR肽-官能化垫对经历神经分化的ESC的基因表达的影响的研究未存在于本文献中。
结论
用生物部分官能化的合成聚合物已经在临床再生医学中得到广泛应用。通过用DIBO末端-官能化PLLA，已经开发出以翻译相关的方式用于组织工程基质的温和的、制造后官能化的方法。与在未官能化的基质上培养的ESC的基因表达相比，在官能化基质上培养的ESC的增加的神经突长度和神经基因表达指示官能化对于细胞为生物可利用的并且DIBOPLLA提供用于产生功能性合成聚合物的临床上相关的材料。在此我们展示的制造后策略为医学理念和创新的转化方法，由于挑战的特征、加工生物活性物质的难度以及组合产物的调节路径的忧虑，许多被临床上忽视。
实施例4:
用应变-促进的叠氮化物炔烃环加成和肟化学的聚(ε-己内酯)共聚物衍生的纳米纤维脚手架的一批双官能化
在本文中，将两个正交的化学反应、无铜点击化学和肟反应组合以生成基于双官能化纳米纤维的脚手架的有效的、生物相容的一批方法。将DIBO用作用于ε-己内酯和1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮(TOSUO)的开环共聚的引发剂以产生DIBO-(P(CL-共-OPD))。聚合后脱保护在温和的条件下进行以回收反应性酮基。聚合物的进一步双官能化使用叠氮化物封端的PEG和O-(戊-4-烯-1-基)羟基胺盐酸盐在一批中进行。基于纳米纤维的脚手架的易于官能化的可行性也用荧光探针Chemo 488叠氮化物(绿色)和Alexa Fluor 568酰肼(红色)证明。
通用方法和材料
所有化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich或Acros并除非另外指出，否则没有进一步纯化即使用。所有反应在无水条件下于氩气气氛中进行。在硅胶(Sorbent TechnologiesInc.,70-230目)上进行快速色谱法。在使用之前蒸馏辛酸亚锡(Aldrich)和ε-己内酯(Acros Organics)。根据先前描述的方法合成4-二苯并环辛炔醇(DIBO)。26,35Chemo 488叠氮化物获得自Active Motif以及Alexa Fluor 568获得自Life Technologies。
仪器信息
使用配备有三个HR-Styragel柱[100，混合床(50/500/103/104)，混合床(103,104,106)]和包括差示折光计(Waters 410)、差示粘度计(Viscotek100)和激光散射检测器(Wyatt Technology,DAWN EOS,λ＝670nm)的三个检测器的Waters 150-C Plus仪器进行尺寸排阻色谱分析(SEC)。在30℃下将流速为1.00mL/min的THF用作洗脱液。由光散射数据计算分子质量和分子质量分布。
在Varian Mercury 300NMR或500NMR分光仪上获得1H核磁共振(NMR)光谱。使用来自BioTek的SynergyTM MX读板仪测量UV-可见光谱。
使用倒置的IX81获得荧光图像。使用JEOL-JSM-7401F以1kV的工作电压获得扫描电子显微术(SEM)图像。
单体1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮(TOSUO)的合成。
根据先前描述的已知方法合成本单体。Tian,D.；Dubois,P.；Grandfils,C.；R.Macromolecules 1997,30,406。
O-(戊-4-烯-1-基)羟基胺盐酸盐的合成(图14)
将5-溴-1-戊烯(3g,20mmol,1当量)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(5g,30mmol,1.5当量)和NaHCO3(3.2g,30mmol,1.5当量)悬浮在100mL THF中。将深红的反应系统在80℃用磁力搅拌回流24h。将溶剂在减压下去除，并将固体残余物再溶解于200mL CHCl3。将该溶液用饱和的碳酸钠溶液洗涤直至水相为无色的。收集有机相并用MgSO4干燥，然后在减压下蒸发。将粗产物通过在硅胶上的快速柱色谱法纯化以得到呈白色固体的产物(3.4g，产率75％)。将来自先前步骤的产物(2.3g,10mmol,1当量)和一水合肼(1mL,20mmol,1.5当量)加入至100mL乙醚中。将悬浮液在环境温度搅拌24h，然后过滤以去除固体副产物。将收集的有机相经MgSO4干燥。在用干的HCl气体酸化之后，得到呈白色固体的产物(1.3g，产率92％)。通过1H NMR和13C NMR光谱确认产物。
DIBO封端的共聚物的合成
将DIBO(28.0mg,0.13mmol)、-己内酯(2.50g,21.9mmol)1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮(TOSUO)(138.0mg,0.80mmol)和新鲜蒸馏的辛酸亚锡(0.053mmol)加入至火焰干燥的舒伦克瓶中。在冷冻-抽气-解冻脱气的三次循环之后，将反应物在80℃加热保持24h。通过1H NMR光谱、UV-可见光谱和SEC确认产物。
反应性酮基的回收
将三苯基四氟硼酸碳(235mg,71mmol)加入至聚合物溶液(470mg/14mL)中，在氩气下保护2h之后，通过在冷的甲醇中沉淀获得产物。通过1HNMR光谱和UV-可见光谱确认产物。
聚合物的一批双官能化
将CH3O-PEG-N3(Mn＝1k,5mg,0.005mmol,2当量)、O-(戊-4-烯-1-基)羟基胺盐酸盐(12mg,87mmol,2当量)、三乙胺(9.5μL,68mmol,1.5当量)和4-甲基苯磺酸(2mg)加入至含脱保护的聚合物的THF溶液(50/3mg/mL)中。在5h之后，通过离心机回收固体并通过在冷的甲醇中沉淀回收产物。通过1HNMR光谱确认产物。
电纺丝
用在4:1DCM/DMF中的40％(w/v)溶液在10kv,10cm尖端-接收器高度下进行电纺丝。使用JEOLJSM-7401F以1kV的工作电压获得SEM图像。
UV-可见光谱。
测量DIBO-P(CL-共-OPD))的UV-可见光谱、脱保护的共聚物和获得自电纺丝的纳米纤维以分别确保来自聚合、脱保护反应和电纺丝的DIBO基团的存活。
纳米纤维脚手架的一批双官能化
将含有沉积的纳米纤维的玻璃载片浸入Chemo 488叠氮化物(0.4％mg/mL)和Alexa Fluor 568(0.2％mg/mL，用2mg 4-甲基苯磺酸作为催化剂)的溶液保持5min。在移除玻璃载片之后，将其用水和甲醇洗涤。使用FITC和TRITC模式以使所得纤维的荧光成像。用来自未修饰的PCL生成的纳米纤维进行去除荧光探针的物理吸附作用的对照实验。
聚合和脱保护
根据先前结果，1H NMR光谱指示DIBO存活于聚合过程并引发聚合。根据SEC结果，产生的聚合物的分子量为约Mn＝19k，其中PDI大约为1.23。根据峰δ＝2.0的积分，OPD单体的含量计算为约10％。聚合之后酮基的回收用三苯基四氟硼酸碳实现。在1H NMR中的OCH2CH2O峰消失并且邻近酮基的CH2位移至两个峰，得到成功脱保护的证据。
在约306nm处DIBO中炔烃的UV-可见吸收峰的特征为DIBO官能团，其已经被用于DIBO与叠氮化物的反应动力学研究。使用UV-可见光谱以验证DIBO基团的存在。UV-可见光谱显示获得自聚合的聚合物在306nm处具有来自DIBO基团的炔烃特征的π-π*光跃迁。这再次意味着DIBO基团存活于聚合，这与先前的结果一致。在脱保护以回收酮基之后，将聚合物再次通过UV-可见光谱测量以观察DIBO是否还完整，并且306nm峰指示在脱保护反应之后DIBO仍在聚合物中。
共聚物的一批双官能化
化学位移方案的变化δ＝2.5-2.7还指示一批双官能化成功发生。因此在这种情况下，我们合成可用于在一批中易于双官能化的生物相容性和生物可降解的基于PCL的共聚物。
基于纳米纤维的脚手架制造
在电纺丝之后进行SEM测量以对获得的纤维的形态成像。根据SEM图像，我们生成直径为约600nm的纳米纤维。为了检查DIBO基团的生存能力，使用UV-可见测量。图13指示在电纺丝之前和之后306nm峰的吸光度未发生改变。因此我们再次证明DIBO基团存活于电纺丝过程。
脚手架的双官能化
在FITC模式下检测绿色荧光，证明无铜点击反应在纳米纤维表面发生，这与先前的研究一致。尽管保持显微镜中的样品和设置不变，仅从FITC转换至TRITC模式，还是观察到红色荧光。该结果证实肟反应在纳米纤维表面也为成功的。考虑到对照实验，几乎为观察到荧光，这可能是由于荧光探针的物理吸附。荧光探针的物理吸附是可以忽略的并且纤维表面的荧光是由于荧光分子和表面反应位点的共价缀合。使用两种有效的正交反应，荧光图像展示纳米纤维为双官能化的。
该原稿描述了用封端的DIBO基团合成P(CL-共-OPD)共聚物。成功的聚合后修饰回收了用于肟连接的反应性酮基同时保持DIBO基团完整。一批双官能化对于聚合物和聚合物衍生的纳米纤维起作用，这以1H NMR和荧光为特征。本文中描述的方法提供了具有两种类型或甚至更多生物活性分子的用于有效的、正交的和生物相容性官能化的组织工程脚手架的潜在应用。本研究提供了用于再生医学应用的高度官能化的脚手架的通用方法。

Claims (18)

1.一种构造生物相容性聚合物结构的方法，包括以下步骤：
通过采用具有应变的环炔烃的ROP引发剂的开环聚合使一种或多种单体聚合以制备包含应变的环炔烃端基的生物相容性聚合物；
由所述生物相容性聚合物形成聚合物结构使得所述应变的环炔烃端基保持在所述生物相容性聚合物上；
提供叠氮化物拴系的分子；以及，在所述形成步骤之后，
使所述叠氮化物拴系的分子与所述环炔烃在叠氮化物炔烃环加成反应中反应以进一步官能化所述聚合物结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROP引发剂包含五至九元应变的环炔烃。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述ROP引发剂还包含选自羟基或胺基的反应性基团。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述反应性基团为羟基，并且在所述聚合步骤中聚合的一种或多种单体为环酯。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述反应性基团为羟基，并且在所述聚合步骤中聚合的一种或多种单体选自内酯、丙交酯和乙交酯。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述反应性基团为胺，并且在所述聚合步骤中聚合的一种或多种单体为N-羧酸酐。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述ROP引发剂包含8元环炔烃。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中X为氨基甲酸酯或碳酸酯，Y为亚甲基(CH2)或乙氧基(CH2CH2O)，n为1或以上至12或以下，并且Z为胺或羟基或羟乙基。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中n为1至5。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中n为1至11。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述ROP引发剂根据以下结构进行选择：
其中n为1至5。
13.根据权利要求1所述的方法，其中形成聚合物结构的所述步骤包括使用选自电纺丝、熔喷、盐浸出脚手架、气体喷射的纳米纤维、喷墨印刷和3d打印的方法，以由所述生物相容性聚合物形成聚合物结构。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述应变的环炔烃存在于所述聚合物结构中并且将在所述形成步骤之后与所述叠氮化物拴系的分子相结合。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括在所述形成步骤之后储存所述聚合物结构的步骤以便保存所述应变的环炔烃端基供将来使用，以及在所述储存步骤之后进行所述反应叠氮化物拴系的分子的步骤以便进行所述反应步骤的进一步官能化因为官能化为必需的并且可将此类官能化调整至所需官能度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述叠氮化物-官能化的基团选自叠氮化物-官能化的DNA、叠氮化物-官能化的肽、叠氮化物-官能化的蛋白质、叠氮化物-官能化的糖、叠氮化物-官能化的金属、叠氮化物-官能化的纳米颗粒和叠氮化物-官能化的抗菌剂。
17.使用具有以下结构的化合物作为开环聚合引发剂的用途：
其中X为氨基甲酸酯或碳酸酯，Y为亚甲基(CH2)或乙氧基(CH2CH2O)，n为1或以上至12或以下，并且Z为胺或羟基或羟乙基。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述化合物具有以下结构中的一种或多种：
其中n为5，m为1或以上至11或以下的整数。
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