CN110366434A - 使用镁催化剂通过开环聚合制备的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物 - Google Patents

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Abstract

在一个或多个实施方案中，本发明涉及聚(富马酸丙烯酯)聚合物和由其制备的聚合物结构(以及相关方法)，所述聚合物和聚合物结构已被末端和/或单体官能化，以添加用于优选通过许多容易的“点击”反应中的一种用生物活性材料或其他功能性物质进行聚合后修饰的官能团。在一些实施方案中，端基官能化经由聚合过程中使用的官能化引发醇来完成。在一些实施方案中，这些聚(富马酸丙烯酯)聚合物的官能化经由环氧丙烷单体前体的官能化完成，所述环氧丙烷单体前体之后形成所得的聚(富马酸丙烯酯)聚合物上的官能化侧链。

Description

使用镁催化剂通过开环聚合制备的官能化聚(富马酸丙烯酯) 聚合物
相关申请的交叉引用
本申请要求以下专利申请的权益：2017年2月2日提交的名称为“内酯和聚(富马酸丙烯酯)的嵌段共聚物(Block Copolymers Of Lactones And Poly(PropyleneFumarate))”的美国临时专利申请序列号62/543,786、2017年2月2日提交的名称为“使用Mg催化剂和官能化引发剂的环氧丙烷和马来酸酐的共聚(Copolymerization of PropyleneOxide And Maleic Anhydride using Mg Catalysts with Functional Initiators)”的美国临时专利申请序列号62/453,724、2017年5月3日提交的名称为“用于增强生物活性的3D打印后的官能化聚合物支架(Post-3D Printing Functionalization PolymerScaffolds for Enhanced Bioactivity)”的美国临时专利申请序列号62/500,777、2017年5月22日提交的名称为“官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物及其制备方法”的美国临时专利申请序列号62/509,340、2017年8月7日提交的名称为“明确定义的聚(富马酸丙烯酯)和聚(乙二醇)嵌段共聚物的合成和表征(Synthesis and Characterization of Well DefinedPoly(propylene fumarate)and Poly(ethylene glycol)Block Copolymers)”的美国临时专利申请序列号62/541,889、2017年9月22日提交的名称为“在己烷中的Mg催化的聚(富马酸丙烯酯)的产生(Mg Catalyzed Production of Poly(propylene fumarate)inHexanes)”的美国临时专利申请序列号62/561,722、和于2018年2月2日由申请人与本文一起提交的名称为“内酯和聚(富马酸丙烯酯)的嵌段共聚物(Block Copolymers ofLactones and Poly(Propylene Fumarate))”的美国专利申请，所有这些专利申请均通过引用以其全文并入本文。
联合研究协议的参与方的名称
本申请受限于俄亥俄州阿克伦市(Akron,Ohio)的阿克伦大学与俄亥俄州阿克伦市的21世纪医疗科技有限公司(21st Century Medical Technologies,Inc.)之间的联合研究协议。
技术领域
本发明的一个或多个实施方案涉及新颖的聚(富马酸丙烯酯)聚合物和用于制备聚(富马酸丙烯酯)聚合物的方法。在某些实施方案中，本发明涉及明确定义的可生物降解聚(富马酸丙烯酯)聚合物和用于制备和官能化所述聚(富马酸丙烯酯)聚合物的可扩展方法。在某些实施方案中，本发明涉及用于在各种再生医学应用中使用的明确定义的可生物降解聚(富马酸丙烯酯)聚合物。
背景技术
如应了解的，组织工程是一个跨学科领域，其将工程学和生命科学的原理应用于生物替代物的开发，所述生物替代物恢复、维持或改善组织功能并且适用于多种治疗性靶标，诸如血管、神经和骨治疗。对于组织工程有两种常用的方法。一种方法是将细胞植入到称为支架的支撑结构装置中。另一种方法是在将支架植入到患者体内之前使细胞将支架重塑为天然组织。基于这些组织工程原理，支架在组织工程应用中起着关键作用。因此，构成支架的材料对于组织工程也是重要的。需要材料满足骨组织工程的所有或几乎所有要求并且可以加工成支架。用于组织工程的一般材料在形成支架时必须符合靶组织的本体机械和结构要求，并使其能够与促进组织愈合的细胞发生分子相互作用。此外，低毒性和快速生物降解性是材料应具有的基本特性。
已经用作支架的材料，诸如金属、陶瓷、天然聚合物和合成聚合物都不能满足这些要求。然而，在这些材料中，合成聚合物可以提供到合适的支架材料的可能途径，这是由于调节其机械和物理特性的能力。例如，已经合成了一种类型的聚酯聚(富马酸丙烯酯)(PPF)，并且将其研究用于骨组织工程。
此外，增材制造(additive manufacturing)(诸如3D打印)的进步有可能由于各种原因而极大地改变组织工程，最重要的原因是这些技术有可能使得可以快速设计和打印支架以满足患者的特定要求。然而，这些进步将高度依赖于满足特定应用的化学、机械和生物要求的可打印材料的可用性。在文献中已经展示了各种形式的增材制造，更通俗地称为3D打印。熔融沉积成型(FDM)是挤出成型固体丝的逐层方法，所述固体丝诸如为聚(氨基甲酸酯)(PU)、聚(L-乳酸)(PLLA)或聚(酯脲)(PEU)。还可以使用连续数字光处理(cDLP)打印聚合物树脂，其中通过高分辨率立体光刻法实现特定区域中的光交联。喷墨方法也已在3D打印中得到展示并且可与粉末或树脂一起使用。
为了生产与生物系统相容的3D支架，聚合物应是无毒的、可植入而没有排斥并且在降解时完全可再吸收。虽然前两个标准是在众多聚合物系统中实现的，但是相对较少的实例也是可生物再吸收的；聚乳酸、聚(ε-己内酯)(PCL)和聚(富马酸丙烯酯)(PPF)。这些实例中的每一种都是聚酯并且因此能够通过酶促降解或通过体内水解降解。然而，由于PLLA的快速降解，定期观察到酸中毒和周围组织区域的炎症。相反，PCL在人体中的缓慢降解限制了其在组织修复中的用途，特别是在重组血管组织方面。
PLLA和PCL二者都可以通过FDM挤出以产生能够进行体外降解的3D支架。虽然材料表现出适度的机械和拉伸特性，但是在沉积层之间的界面处观察到材料中的大部分缺陷。此外，由于FDM中挤出喷嘴的可实现宽度，使3D打印支架的分辨率受到限制。
然而，已经显示诸如cDLP的立体光刻方法表现出与FDM技术相比更高的分辨率，因为它们受到打印机的光源而不是所使用的材料的限制。这使得3D支架能够被打印成具有可控孔隙率，所述可控孔隙率可以被调控以匹配生理条件。
PPF是一种不饱和聚酯，其在体内降解形成自然排泄的富马酸和丙二醇。PPF已被用于多种医学应用，诸如血管支架、神经移植物、软骨、药物释放载体、血管工程和骨组织工程。由于聚合物主链中的不饱和烯烃，可以实现分子间交联以增强材料的机械特性。通过将聚合物溶解到作为溶剂和交联剂的反应性稀释剂富马酸二乙酯(DEF)中而形成的可打印PPF树脂的开发已经被广泛研究并且显示出能够生产具有与骨相当的压缩模量的3D支架。
目前的PPF生产方法是通过DEF和丙二醇的逐步增长缩聚进行(方案1)。然而，对于3D打印目的而言，这不是工业上可行的PPF生产方法。在cDLP系统中仅展示了低分子量PPF(<3000Da)，这是由于因链长增加的结晶度导致具有低溶解度的固体聚合物，与在较低分子量下观察到的流体低聚物相反。因此，经由逐步增长缩聚用于3D打印的PPF的放大和商业化已被证明是困难的。逐步增长方法不利于保持高的端基保真度和窄分子量分布。对分子量分布缺乏控制直接影响材料的降解特性。作为逐步增长缩聚条件的副产物的残余乙醇和未反应单体也导致PPF工业扩展的纯化问题。
方案1
生产聚(富马酸丙烯酯)的聚合方法
先前已报道马来酸酐(MAn)和环氧丙烷(PO)的开环(共)聚合(ROCOP)产生PPF顺式烯烃异构体聚(马来酸丙烯酯)(PPM)，其可以在低温(约60℃)下使用弱碱转化为PPF。有利地，ROCOP允许通过单体与醇引发剂的比例的变化而高度控制分子量分布和端基保真度。经由ROP合成PPF的最近研究(包括接触细胞毒性测定和细胞培养结果)已显示由ROP产生的PPF聚合物是无毒的，并且细胞在其薄膜上附接并增殖良好。虽然文献中已经存在使用ROCOP生产PPM的实例，但这些体系一直是基于使用金属醇盐催化剂/链转移剂，它们在用作引发端基的醇方面具有有限的选择。
先前，乙醇镁(Mg(OEt)2)显示出对PPM的ROCOP形成的催化行为。镁虽然由于其反应性而不通常用于催化中，但对于生物材料合成是有吸引力的，因为末端氧化产物氧化镁用作食品添加剂。然而，在Mg(OEt)2的情况下，由于弱配位的乙醇根配体也充当链转移物质，因此不能实现端基保真度。所得的聚合物是乙氧基或羟基末端物质。2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚镁(Mg(BHT)2(THF)2)是一种催化剂，先前已证明其是内酯的“永生”ROP催化剂、可用于在低催化负载下生产高的端基保真度聚酯。有利地，催化剂在“空气”条件下表现出相对稳定性，并且在水存在下不促进引发/酯交换副反应。值得注意的是，最初由于在食品和包装中作为抗氧化剂和稳定剂的用途而选择2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚盐(BHT)作为配体体系。这有限的生物相容性受到关注。
PPF的实用性的关键是能够控制官能团化学计量和降解特性。为了使PPF成为完全可生物再吸收的材料，MAn和PO的掺入必须完全地交替以产生能够进行容易水解的聚酯，并避免可能在不易降解的连续PO重复单元之间引入聚醚键的副反应。在许多应用中，受控降解是必要的，以使支架在组织生长时降解，从而使支架的机械贡献最大化并确保与骨组织有效替换。已知具有较低分子量分布的聚合物比高聚合物更均匀地降解，从而能够更好地控制支架降解。
为了最小化植入物被身体排斥并促进修复过程，已经广泛研究了用生物缀合物对植入物表面进行的聚合后修饰。已经显示向支架表面添加小分子和多肽有助于细胞附接和在支架表面上扩散。此外，通过选择性选择多肽，可以靶向这些细胞的分化以产生特定的组织生长(例如骨组织)。然而，用于组织生长修复的支架必须能够影响细胞附接、增殖和分化，以确保仅形成所需的组织，这尚未使用官能化PPF展示出。苛刻的光化学交联条件破坏大多数官能团，并且限制使用先前描述的方法掺入生物活性物质的能力。
然而，当前PPF聚合物的问题之一是非官能化PPF不与细胞相互作用，与细胞相互作用是成功生物材料的关键要求。因此，尽管PPF的合成方法已得到改进并且由于其完全可生物再吸收的性质和没有可观察到的毒性而已经满足骨组织工程的一些基本要求，但是PPF特性需要进一步改善。如应了解的，改善合成聚合物生物活性特性的一般途径是用具有所需特性或能够获得所需特性的物质官能化聚合物。因为最终目标是改善PPF生物活性，所以期望能够在PPF中添加一个或多个官能团，所述一个或多个官能团可以经历“点击”型反应或其他反应，从而给予PPF在打印后经历表面修饰并附接有用的生物活性分子的能力。
因此，本领域需要的是明确定义、无毒且可生物降解的PPF聚合物，以及制备和使用这种聚合物的方法，所述PPF聚合物具有可调节的机械特性并且被官能化为具有至PPF的一个或多个官能团，所述一个或多个PPF官能团可以经历“点击”型反应或其他反应，从而给予PPF在3D打印后经历表面修饰并且附接有用的生物活性分子的能力。
发明内容
在一个或多个实施方案中，本发明提供了明确定义、无毒且可生物降解的PPF聚合物，以及制备和使用这种聚合物的方法，所述PPF聚合物具有可调节的机械特性并且被官能化为具有至PPF的一个或多个官能团，所述一个或多个官能团可以经历“点击”型反应或其他反应，从而给予PPF在3D打印后经历表面修饰并且附接有用的生物活性分子的能力。在一些实施方案中，这些官能化PPF聚合物使用2步法形成，其中在第一步中使用具有官能端基的引发醇和镁催化剂、通过马来酸酐和环氧丙烷的开环聚合形成末端官能化的聚(马来酸丙烯酯)(PPM)聚合物中间体。然后在第二步中将PPM聚合物中间体异构化以形成末端官能化的PPF聚合物。在一些其他实施方案中，本发明通过官能化用于经由ROP合成PPF的共聚单体之一以添加给予这些PPF材料附接一些小的生物活性分子的能力的功能位点来获得新颖的官能化PPF聚合物。选择环氧丙烷共聚单体用于本发明的这些实施方案中的官能化，因为来自马来酸酐的烯键充当聚合物的光交联位点，使得难以找到用于官能化马来酸酐共聚单体的反应位点。
在这些实施方案中，首先使用相转移化学获得环氧丙烷官能化的共聚单体，并且在纯化之后，使用镁催化剂使其与马来酸酐和引发醇(可以或可以不官能化)聚合以形成新颖的官能化聚(马来酸丙烯酯)聚合物，然后将所述新颖的官能化聚(马来酸丙烯酯)异构化以形成本发明的新颖的官能化PPF聚合物。根据本发明的各种实施方案的官能化共聚单体和聚合物的化学结构已通过1H NMR、13C NMR和1H-1H COSY光谱表征。通过MALDI-ToF质谱证明了聚合物的高的端基保真度。在本发明的各种实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物的分子量为约1000-2000Da，适于3D打印以产生PPF支架。这些新颖的官能化PPF聚合物还表现出低分散性。此外，发现足够的连接至这些官能化PPF聚合物的官能团在通过常规光交联方法3D打印成PPF结构之后继续存在，以产生官能化PPF支架，所述官能化PPF支架具有被修饰以实现完好的骨和/或其他组织工程装置的稳健能力。
在第一方面，本发明涉及末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物。在一个或多个实施方案中，本发明的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包含马来酸酐单体的异构化残基和官能化环氧丙烷单体的残基。在这些实施方案中的一个或多个中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包含官能化引发醇的残基。
在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个上述参考实施方案、具有下式：
其中n是1至1000的整数；并且R是选自由以下组成的组的官能团：炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基及其组合。在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个的上述参考实施方案、具有下式：
其中n是1至1000的整数。
在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个的上述参考实施方案，其中官能化引发醇选自炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛炔醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯或其组合。
在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中官能化环氧丙烷单体选自炔烃官能化的环氧丙烷、2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)、缩水甘油基炔丙基醚、(±)-表氯醇或其组合。在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中官能化引发醇包含选自以下的官能团：炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基及其组合。
在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个上述参考实施方案、具有下式：
其中n是1至100的整数；R是选自以下的官能团：苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基和聚(乙二醇)基团，或其组合；并且R'为官能团、或具有官能团的烷基或芳基，其中官能团是炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基、卤化物基团或其组合。在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个的上述参考实施方案、具有选自以下的式：
其中n是约1至约100的整数。
在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个上述参考实施方案、具有约0.7kDa至约100,000kDa的数均分子量(Mn)。在一个或多个实施方案中，本发明的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物包括本发明第一方面的任何一个或多个上述参考实施方案、具有约1.01至约1.8的多分散指数
在第二方面，本发明涉及用于形成单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的官能化环氧丙烷单体，所述官能化环氧丙烷单体包含直接地或通过醚键连接至官能团的缩水甘油基或包含官能团的烷基或芳基，其中官能团能够与相应的官能团进行点击反应。在这些实施方案中的一个或多个中，官能团选自炔基、烯基、羟基、受保护的羟基或其组合。
在一个或多个实施方案中，本发明的官能化单体包括本发明第二方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中官能化单体是缩水甘油基炔丙基醚。在一个或多个实施方案中，本发明的官能化单体包括本发明第二方面的任何一个或多个的上述参考实施方案、具有下式：
在一个或多个实施方案中，本发明的官能化单体包括本发明第二方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中官能化单体是2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。在一个或多个实施方案中，本发明的官能化单体包括本发明第二方面的任何一个或多个的上述参考实施方案、具有下式：
在第三方面，本发明涉及用于形成本发明第一方面的单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的官能化环氧丙烷单体，其具有下式：
其中R是官能团、或包含官能团的烷基或芳基，所述官能团选自炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基、卤化物基团或其组合。在这些实施方案中的一个或多个中，官能化环氧丙烷单体具有下式：
在第四方面，本发明涉及用于形成本发明第一方面的单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的官能化环氧丙烷单体，其具有下式：
在第五方面，本发明涉及用于制备本发明第一方面的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的方法，所述方法包括：制备引发醇，该引发醇进一步包含官能端基；将引发醇、镁催化剂、马来酸酐和环氧丙烷在合适的容器中合并并且添加合适的溶剂；密封然后加热容器以引起和/或保持由引发醇引发的马来酸酐与环氧丙烷之间的开环聚合反应，从而形成包含官能端基的聚(马来酸丙烯酯)聚合物；收集和纯化包含官能端基的聚(马来酸丙烯酯)聚合物；以及将包含官能端基的聚(马来酸丙烯酯)聚合物异构化为包含官能端基的聚(富马酸丙烯酯)聚合物。在这些实施方案中的一个或多个中，组合中引发醇与镁催化剂的摩尔比为约1:1。
在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中组合中引发醇的摩尔数与单体(马来酸酐和官能化和/或未官能化的环氧丙烷)的总摩尔数之比为约1:5至约1:1000。在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中溶液中的总单体浓度(马来酸酐和官能化和/或未官能化的环氧丙烷)为约0.5M至约5.0M。在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中合适的溶剂是甲苯或己烷。
在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中加热步骤包括将容器加热至约40℃至约100℃的温度。在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中合适的溶剂是己烷并且加热步骤包括将容器加热至约45℃的温度。
在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个的上述参考实施方案，其中引发醇选自苄醇、炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛炔醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯及其组合。在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中引发醇的官能化端基包括炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基、聚(乙二醇)基团及其组合。在一个或多个实施方案中，本发明的方法包括本发明第五方面的任何一个或多个上述参考实施方案，其中镁催化剂包括Mg(BHT)2(THF)2。
在第六方面，本发明涉及用于制备本发明第一方面的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的方法，所述方法包括：制备官能化环氧丙烷；使官能化环氧丙烷与马来酸酐和引发醇在镁催化剂存在下反应以形成官能化聚(马来酸丙烯酯)聚合物；通过使官能化聚(马来酸丙烯酯)聚合物与碱反应使其异构化以形成本发明第一方面的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物。在这些实施方案中的一个或多个中，官能化环氧丙烷选自炔烃官能化的环氧丙烷、2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)、缩水甘油基炔丙基醚、(±)-表氯醇或其组合。在这些实施方案中的一些中，引发醇是选自以下的官能化引发醇：苄醇、炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛炔醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯及其组合。在这些实施方案中的一个或多个中，金属催化剂是2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚镁(Mg(BHT)2(THF)2)。
在第七方面，本发明涉及制备本发明第一方面的官能化单体的方法，所述方法包括：将炔丙醇添加至含有选自由氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)及其组合组成的组的碱的水溶液中；将(±)-表氯醇和四丁基硫酸氢铵溶解于合适的有机溶剂中；将溶液和H2O添加至炔丙醇溶液中；并使反应在惰性气氛下进行，以产生缩水甘油基炔丙基醚。
在这些实施方案中的一些中，添加炔丙醇的步骤包括在搅拌的同时将炔丙醇逐滴添加至温度为约-10℃至约30℃的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，其中氢氧化钠(NaOH)水溶液包含按重量计约20％至约50％的NaOH；溶解步骤中的有机溶剂包括己烷；并且使反应进行的步骤包括使反应温度增加至环境温度并且使反应在N2覆盖层下继续约1小时至约24小时。在一些其他实施方案中，所述方法进一步包括：淬灭反应；用合适的有机溶剂萃取粗产物；通过柱色谱法或蒸馏纯化粗产物，以产生纯化的缩水甘油基炔丙基醚。
在第八方面，本发明涉及制备官能化单体的方法，所述方法包括：将邻硝基苄醇溶解于合适的有机溶剂中；将四丁基硫酸氢铵和含碱的水溶液添加至邻硝基苄醇溶液中，其中碱选自由氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)及其组合组成的组；添加(±)-表氯醇；并且使反应进行以产生2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。在这些实施方案中的一个或多个中，所述方法还包括：用合适的有机溶剂萃取粗产物；以及通过柱色谱法或蒸馏纯化粗产物，以产生纯化的2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。
在又另一个方面，本发明涉及包含本发明第一方面的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的3D打印聚合物支架。在这些实施方案中的一个或多个中，3D打印聚合物支架进一步包含与官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物键合的多种生物活性材料。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述和附图，在附图中：
图1是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂的DP 10苄醇引发的聚(马来酸丙烯酯)(表2，条目1)的1H NMR波谱(300MHz，303K，DMSO-d6)。
图2是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂的DP 25炔丙醇引发的聚(马来酸丙烯酯)(表2，条目6)的1H NMR波谱(300MHz，303K，DMSO-d6)。
图3是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂的DP 25 4-羟基丁-2-酮引发的聚(马来酸丙烯酯)(表2，条目10)的1H NMR波谱(300MHz，303K，DMSO-d6)。
图4是(上部)在己烷中产生的前体DP25炔丙醇引发的PPM(表2，条目6)和(下部)异构化后所得的炔丙醇引发的PPF的1H NMR波谱比较(500MHz，CDCl3，303K)。
图5A-5B是马来酸酐和环氧丙烷在80℃下在甲苯中以[MAn]0:[PO]0:[BnOH]0:[Cat.]0＝25:25:1:1、总初始单体浓度＝2M(图5A)进行共聚的动力学图，以及示出通过SEC相对于聚(苯乙烯)标准物测定的，对于同一共聚Mn(菱形)和(正方形)随单体转化率增加的变化的图(图5B)。
图6是示出在一系列引发物质的情况下不同聚合度下的PPF的Mn(实心形状)和(空心形状)的图。分子量是使用THF作为洗脱液通过SEC相对于聚(苯乙烯)标准物测定的。
图7是DP 10苄醇引发的PPM(表2，条目1)的13C NMR波谱(125MHz，CDCl3，303K)。
图8是DP 25苄醇引发的PPM(表2，条目2)的SEC色谱图。相对于聚(苯乙烯)标准物测定分子量。
图9是DP 25炔丙醇引发的PPM(表2，条目6)的13C NMR波谱(125MHz，DMSO-d3，303K)。
图10是DP 25炔丙醇引发的PPM(表2，条目6)的SEC色谱图。相对于聚(苯乙烯)标准物测定分子量。
图11是DP 25 4-羟基丁-2-酮引发的PPM(表2，条目10)的13C NMR波谱(125MHz，CDCl3，303K)。
图12是DP 25 4-羟基丁-2-酮引发的PPM(表2，条目10)的SEC色谱图。相对于聚(苯乙烯)标准物测定分子量。
图13是在60℃下在己烷中聚合的DP 25苄醇引发的PPM(表3，条目2)的1H NMR波谱(300MHz，CDCl3，303K)。
图14是在60℃下在己烷中聚合的DP 25苄醇引发的PPM(表3，条目2)的13C NMR波谱(125MHz，CDCl3，303K)。
图15是在45℃下在己烷中聚合的DP 25苄醇引发的PPM(表3，条目2)的SEC色谱图。相对于聚(苯乙烯)标准物测定分子量。
图16是叠氮化物官能化的GRGDS(N3-GRGDS)多肽序列的ESI光谱。
图17是示出如通过测定法测定的炔丙醇官能化的PPF、炔丙醇官能化的PPF上的物理吸附的N3-GRDGS和GRGDS-PPF生物缀合物膜的细胞存活比的图。
图18是缩水甘油基炔丙基醚(下部)、炔丙醇(中间)和表氯醇(上部)的1H NMR波谱。
图19是2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷的1H NMR波谱。
图20是反式聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)的1H NMR波谱。
图21是反式聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)的定量13C NMR波谱。
图22是异构化之前(底部)和之后(顶部)的聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)的1H NMR波谱。
图23是反式聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)的1HNMR波谱。
图24是反式聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)的13CNMR波谱。
图25是缩水甘油基炔丙基醚(GPE)和马来酸酐(MA)的共聚的短期动力学研究图。
图26是缩水甘油基炔丙基醚(GPE)和马来酸酐(MA)的共聚的长期动力学研究图。
图27是2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)和马来酸酐(MA)的共聚的动力学研究图。
图28是聚(ECH-co-MA)的1H NMR波谱(300MHz，303K，CDCl3)。
图29是聚(ECH-co-MA)的定量13C NMR波谱(125MHz，303K，CDCl3)。
图30是P(ECH-co-MA)的分子量分布的SEC色谱图。
图31是聚(GPE-co-MA)的1H NMR波谱(300MHz，303K，CDCl3)。
图32是聚(GPE-co-MA)的定量13C NMR波谱(125MHz，303K，CDCl3)。
图33是聚(NMMO-co-MA)的1H NMR波谱(300MHz，303K，CDCl3)。
图34是聚(NMMO-co-MA)的13C NMR波谱(125MHz，303K，CDCl3)。
具体实施方式
如上所述，由于其低细胞毒性，良好的生物降解性和可调节的机械特性，聚(富马酸丙烯酯)(PPF)是制备用于骨或其他组织工程的支架的理想合成聚酯。然而，基于组织工程要求，PPF理想地应与细胞具有分子相互作用以帮助细胞附接、增殖和分化。因此，如果将PPF用于骨组织工程应用，则PPF的官能化以连接生物活性分子(即生物活性药物、肽、蛋白质、糖)是关键步骤。修饰合成聚合物的更容易的方法中的一种是添加官能团以实现聚合后修饰，这将改变聚合物的化学结构。基于PPF化学结构及其合成路线(即ROCOP)，有两种可能的官能化方法。一种是经由官能化引发醇进行端基官能化，另一种是经由单体前体的官能化，然后在聚合时在PPM/PPF聚合物上形成官能化侧链(“单体官能化的”PPM/PPF)。
如本文所用，术语“官能化的”是指包含或已被修饰为包含官能团的聚合物、生物活性材料或其他物质，并且更广义的术语“官能化”是指将官能团添加至聚合物、生物活性材料或其他物质的过程、方法和/或反应，并且特别是指向PPF聚合物(即使在异构化之前添加)和/或生物活性材料或其他功能性物质添加官能团，其目的是将生物活性材料或其他功能性物质添加至PPF聚合物。此外，如本文所用，术语“官能团”和“官能部分”可互换地用于指化学活性物质或含有化学活性物质的基团。如本文所用，“官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物”是指为了将生物活性材料或其他功能性物质添加至聚合物的目的而包含一个或多个官能团的聚(富马酸丙烯酯)聚合物。
因此，术语“端基官能化的(end-group functionalized或end groupfunctionalized)”或“末端官能化的”可互换地用于在聚合物链的末端具有官能团或已经被修饰为在聚合物链的末端包含官能团的聚合物，并且术语“端基官能化(end-groupfunctionalization或end group functionalization)”或“末端官能化”可互换地用于指将官能团添加至聚合物链末端的过程、方法和/或反应。如本文所用，术语“单体官能化的”是指具有一个或多个在聚合过程中通过官能化单体、且特别是官能化环氧丙烷单体添加的官能团的PPM或PPF聚合物。类似地，如本文所用，术语“官能端基”是指位于聚合物链的末端的官能团。术语“官能化引发醇”在本文中用于指在镁催化剂存在下能够引发马来酸酐单体和官能化或未官能化聚环氧丙烷单体的开环共聚的醇。
如本文所用，术语“生物活性分子”和“生物活性材料”可互换地用于指影响细胞功能的物质。生物活性分子可包括但不限于肽、碳水化合物、蛋白质、寡核苷酸和小分子药物。
术语异构化在本文中用于指在催化剂存在下将顺式异构体(PPM)转化为反式异构体(PPF)形式的反应。
可以与本发明的PPF聚合物上的官能团连接的生物活性物质或其他功能性物质没有特别限制，条件是它们含有或被官能化以含有能够与聚合物上的至少一个官能团键合的部分。如本文所用，术语“生物活性分子”和“生物活性材料”可互换地用于指影响细胞功能的物质，并且可包括但不限于肽、碳水化合物、蛋白质、寡核苷酸和小分子药物。如在可以附接于本发明的官能化PPF聚合物的物质的上下文中所使用的，术语“功能性物质”是指除了生物活性材料之外的物质，其可以添加至本发明的官能化PPF聚合物以提供增加的益处并且可以包括诸如荧光和其他标记物、小分子染料和/或卤素原子的事物。虽然待连接的生物活性或其他功能性物质的尺寸不受限制，但它们通常较小、小于约40,000Da并且不应太大以至于它们不能容易地到达打印或形成的聚合物结构的内表面和/或到达PPF聚合物上的官能团以使键合成为可能。在各种实施方案中，待连接的生物活性或其他功能性物质可包括但不限于短链肽、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、生物活性药物、寡核苷酸、小分子药物、荧光或其他标记物、小分子染料和/或卤化物原子。
虽然不一定实践本发明，但是添加至本发明的PPF上的官能团优选是这样的官能团，所述官能团能够进行熟知的“点击”反应以有利于向聚合物聚合后添加所需材料，诸如生物活性化合物。如本文所用，术语“点击反应”、“点击化学”、“点击化学方法”和“点击化学反应”可互换地用于指满足以下先决条件的一组正交缀合反应，在本领域中通常称为“点击”反应：(i)高产率，几乎定量转换；(ii)生物良性条件(水溶液、环境温度和接近生理pH)；(iii)有限的或无残留副产物。这些反应通常易于执行、高产率、立体定向、范围广、仅产生在无需色谱法的情况下可除去的副产物，并且可以在易于除去或良性的溶剂中进行。类似地，术语“可点击的”是指能够经由点击反应键合的分子或官能团。
如上所述，“点击”化学概念目前代表许多正交反应，其是稳健的、选择性的、高效的和高产率的。在各种实施方案中，合适的点击反应可以包括但不限于铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)反应(亦称胡伊斯根(Huisgen)环加成反应)、硫醇-烯基加成反应、肟连接反应(oxime ligation reaction)、迈克尔加成反应、硫醇-迈克尔加成反应、曼尼希型加成反应、“烯型”加成反应、硫醇-烯基加成、应变促进的叠氮化物-炔环加成反应(SPAAC)、非无痕施陶丁格连接(non-traceless Staudinger ligation)、无痕施陶丁格连接、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应、杂化狄尔斯-阿尔德反应、反电子需求狄尔斯-阿尔德反应、串联[3+2]环加成-逆向狄尔斯-阿尔德(串联crD-A)反应、硫醇-炔烃反应、硫醇-吡啶基二硫化物反应、硫醇-卤素连接、天然化学连接和噻唑烷连接反应。在一个或多个实施方案中，合适的“可点击”部分可包括但不限于炔基、烯基、叠氮基、酮或应变的环辛炔基。在一个或多个实施方案中，生物活性或其他功能性物质可以通过生物活性或其他功能性物质上的官能部分与本发明的官能化PPF聚合物上的官能团之间的以下反应与本发明的PPF聚合物上的官能团连接：硫醇-烯反应、硫醇-炔反应、炔烃与叠氮化物之间的1,3-偶极环加成、或酮与胺之间的肟连接的反应类型。
末端官能化PPF聚合物
在第一方面，本发明涉及末端官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其是无毒的、具有适于使用反应性引发剂的3D打印的受约束且可预测的材料特性，并且可以在其打印或以其他方式形成为聚合物结构之后用生物活性基团衍生化。如上所述，在一些实施方案中，本发明的PPF聚合物含有可用于聚合后反应以向聚合物添加功能性物质的官能端基，所述官能端基通过在上面概述的第一步中用于形成PPM中间体的引发醇引入到这些PPF聚合物中。术语“引发醇(initiation alcohol和initiating alcohol)”可互换地用于指包含直接或间接地结合至官能端基的羟基的分子，所述羟基在Mg催化剂存在下引发马来酸酐和环氧丙烷的开环聚合反应。这些官能端基中的一些或全部在聚合(步骤1)和异构化反应(步骤2)之后均继续存在，其形成本发明的PPF聚合物并且可用于聚合后添加一种或多种功能性物质，诸如生物活性材料、标记物、小分子染料、短链肽、药物和/或卤化物原子。如本文所用，术语“异构化”广义地是指顺式异构体(PPM)转化为其反式异构体(PPF)形式，或者在化学反应或过程(“异构化反应”)的上下文中是指将顺式异构体(PPM)转化为其反式异构体(PPF)形式的反应或过程。
可以使用的官能端基没有特别限制，条件是它们在聚合和异构化反应后保持其至少一些反应性。在一个或多个实施方案中，本发明的末端官能化PPF聚合物上的官能团可包括但不限于苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基和聚(乙二醇)基团、内酯基团、受保护的羟基或其组合。如本文所用，术语“受保护的羟基”是指这样的羟基，其中氢原子已经被保护基团替换以防止不希望的反应，直到可以发生所需的反应，此时保护基团被质子取代以重组羟基。可以使用本领域已知的任何合适的保护基团，包括但不限于叔丁氧基羰基(BOC)、三甲基甲硅烷基醚(TMS)基团、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBDMS)或芴基甲氧基羰基(FMOC)。
在一个或多个实施方案中，本发明的PPF聚合物可具有多于一种的不同末端官能团。在一些实施方案中，这可以通过使用具有多于一种类型的官能团的引发醇来实现。然而，与使用单官能化引发醇的情况相比，该方法通常会导致具有更宽的多分散性的聚合物混合物并且对聚合物特性的控制不足。因此，本发明的具有多于一种的不同末端官能团的PPF聚合物的产生优选地通过制备两个或更多个单独批次的聚合物来完成，每个批次具有不同的所需末端官能团，然后将它们梳理成均匀的混合物以形成本发明的可具有多于一种的不同末端官能团的PPF聚合物。
在各种实施方案中，本发明的末端官能化PPF聚合物具有如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量的约0.7kDa至约100,000kDa的数均分子量(Mn)和约1.01至约1.8的多分散指数在一些实施方案中，末端官能化PPF聚合物具有1.0kDa或更大、在其他实施方案中约5kDa或更大、在其他实施方案中约8kDa或更大、在其他实施方案中约10kDa或更大、在其他实施方案中约1000kDa或更大、以及在其他实施方案中约10,000kDa或更大的Mn。在一些实施方案中，末端官能化PPF聚合物具有90,000kDa或更小、在其他实施方案中约80,000kDa或更小、在其他实施方案中约70,000kDa或更小、在其他实施方案中约60,000kDa或更小、在其他实施方案中约50,000kDa或更小、以及在其他实施方案中约40,000kDa或更小的Mn。
在一些实施方案中，末端官能化PPF聚合物具有1.03或更大、在其他实施方案中约1.05或更大、在其他实施方案中约1.10或更大、在其他实施方案中约1.20或更大、在其他实施方案中约1.30或更大、在其他实施方案中约1.40或更大的多分散指数在一些实施方案中，末端官能化PPF聚合物具有1.70或更小、在其他实施方案中约1.60或更小、在其他实施方案中约1.50或更小、在其他实施方案中约1.40或更小、在其他实施方案中约1.30或更小、以及在其他实施方案中约1.20或更小的
在各种实施方案中，本发明的末端官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是1至1000的整数，并且R是可用于向聚合物聚合后添加所需材料，诸如生物活性化合物的官能团。在这些实施方案中的一些中，n是100至1000、在其他实施方案中200至1000、在其他实施方案中300至1000、在其他实施方案中400至1000、在其他实施方案中1至900、在其他实施方案中1至800、在其他实施方案中1至700、以及在其他实施方案中1至600的整数。在各种实施方案中，R可包括但不限于苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基和聚(乙二醇)基团及其组合。在这些实施方案中的一些中，R可以包括可点击部分，如上文所定义的。
在一些实施方案中，本发明的聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是如上文所定义的。
如上所述，本发明的PPF的末端官能团可用于向聚合物聚合后添加功能性物质，诸如生物活性或其他有用的材料。在这些实施方案中的一个或多个中，与本发明的PPF聚合物连接的功能性物质将天然地含有可通过点击或其他类型的反应与PPF的末端官能团键合而不会丢失其所需的功能性的官能团。然而，在一些其他实施方案中，待与本发明的PPF聚合物连接的功能性物质必须首先用已知优选经由点击反应键合使用的末端官能团的部分官能化。选择的具体可点击部分及其连接方式当然取决于待连接的生物活性或其他材料以及待使用的特定点击反应。本领域普通技术人员将能够将适当的可点击部分连接至待连接的生物活性或其他材料而无需过多的实验。例如，用叠氮基官能化的肽可以使用胡伊斯根1,3环加成反应与支架上的炔烃末端官能化的PPF链偶联。例如，用硫醇基团或半胱氨酸残基官能化的肽可以使用硫醇烯反应与支架上的炔烃或降冰片烯末端官能化的PPF链偶联。
已经发现，在本发明的PPF聚合物上添加末端官能团不会显著影响聚合物在本文公开和讨论的分子量下所需的机械、热、降解和/或毒性特性。
单体官能化PPF聚合物
在第二方面，本发明涉及新颖的官能化PPF聚合物，其包含用于形成聚合物的马来酸酐单体的异构化残基和官能化环氧丙烷单体的残基。显而易见的是，当马来酸酐单体和官能化环氧丙烷单体反应以形成聚合物时，马来酸酐单体和环氧丙烷将形成PPM/PPF聚合物的主链，其中官能化环氧丙烷单体的官能团形成活性侧链。
如本文所用，术语“残基”通常用于指已掺入到聚合物或大分子中的单体或其他化学单元的部分。通过扩展，术语“马来酸酐单体的残基”和“官能化环氧丙烷单体的残基”分别用于指已掺入到PPM和PPF聚合物中的马来酸酐单体和官能化环氧丙烷单体的部分。术语“马来酸酐单体的异构化残基”具体是指马来酸酐单体的残基，其中双键已从顺式构型异构化为反式构型，伴有官能化PPF聚合物的形成。术语“引发醇的残基”或“引发醇残基”等是指引发醇的在其引发聚合后保留结合在PPM/PPF聚合物链末端的部分。类似地，术语“官能化引发醇的残基”或“官能化引发醇残基”等是指官能化引发醇的在官能化引发醇引发聚合后保留结合在聚合物链末端的官能团和其他部分。
在各种实施方案中，官能化环氧丙烷单体的残基上的官能团可包括但不限于炔基、炔丙基、烯基、羟基、酮基、硫醇基、卤化物基团、硝基苄基或可以容易地转化成诸如卤化物基团、硝基苄基或羟基的官能团的基团。已经发现与仅端基官能化(甚至在处理之后较少官能团继续存在)相比，使用单体官能化方法增加了可用官能团的数量。已经发现，本发明的PPF聚合物的单体不会显著影响聚合物至少在本文公开和描述的分子量下所需的机械、热、降解和/或毒性特性。
在各种实施方案中，本发明的新颖的官能化PPF聚合物的官能化环氧丙烷单体残基将包含能够与具有或被官能化以具有用于点击反应的相应官能团的生物活性化合物进行“点击”反应的官能团。例如，在这些实施方案中的一个或多个中，官能化环氧丙烷上的官能团可以是炔基、烯基、羟基、酮基、硫醇基或可以容易地转化成这种官能团的基团。在一些实施方案中，官能化环氧丙烷可以是(±)-表氯醇。在一个或多个实施方案中，官能化环氧丙烷可以是炔烃官能化的环氧丙烷。在一些实施方案中，本发明的新颖的官能化PPF聚合物包含缩水甘油基炔丙基醚的残基。
在这些实施方案中的一些中，本发明的新颖的官能化PPF聚合物包含2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)的残基。应了解，在这些实施方案中，NMMO上的硝基苄基是UV敏感性保护基团，其在暴露于特定UV波长时可以容易地被羟基替代。在一些其他实施方案中，本发明的新颖的官能化PPF聚合物包含卤化物官能化的环氧丙烷的残基。在这些实施方案中的一些中，本发明的新颖的官能化PPF聚合物包含(±)-表氯醇的残基。应了解，在这些实施方案中，(±)-表氯醇上的卤化物基团是保护基团，其随后被任何合适的亲核试剂替代。合适的亲核试剂可包括但不限于胺、醇、硫醇和羟胺。
还应该显而易见的是，在各种实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物还可含有通过如上所述的引发醇添加的末端官能团。因此，在一个或多个实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物可具有下式：
其中n是1至100的整数；R是包括选自以下的基团的官能团：炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基和聚(乙二醇)基团、内酯基团和非官能引发醇残基；并且R'为官能团、或具有官能团的烷基或芳基，所述官能团能够与相应官能团进行点击或其他反应并且可以包括炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基、卤化物基团或羟基等等。如上所述，术语“受保护的羟基”是指这样的羟基，其中氢原子已经被保护基团替换以防止不希望的反应，直到可以发生所需的反应，此时保护基团被质子取代以重组羟基。可以使用本领域已知的任何合适的保护基团，包括但不限于叔丁氧基羰基(BOC)、三甲基甲硅烷基醚(TMS)基团、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBDMS)或芴基甲氧基羰基(FMOC)。在这些实施方案中的一些中，n可以是约5至约100、在其他实施方案中15至100、在其他实施方案中25至100、在其他实施方案中40至100、在其他实施方案中1至80、在其他实施方案中1至70、在其他实施方案中1至60、以及在其他实施方案中1至40的整数。
在一些实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物可以具有下式：
其中n是约1至约100的整数。在这些实施方案中的一些中，n可以是约5至约100、在其他实施方案中15至100、在其他实施方案中25至100、在其他实施方案中40至100、在其他实施方案中1至80、在其他实施方案中1至70、在其他实施方案中1至60、以及在其他实施方案中1至40的整数。
在一些其他实施方案中，本发明的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是约1至约100的整数。在这些实施方案中的一些中，n可以是约5至约100、在其他实施方案中15至100、在其他实施方案中25至100、在其他实施方案中40至100、在其他实施方案中1至80、在其他实施方案中1至70、在其他实施方案中1至60、以及在其他实施方案中1至40的整数。
在一些其他实施方案中，本发明的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是约1至约100的整数。在这些实施方案中的一些中，n可以是约5至约100、在其他实施方案中15至100、在其他实施方案中25至100、在其他实施方案中40至100、在其他实施方案中1至80、在其他实施方案中1至70、在其他实施方案中1至60、以及在其他实施方案中1至40的整数。
在各种实施方案中，本发明的单体官能化PPF聚合物具有如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量的约0.7kDa至约100,000kDa的数均分子量(Mn)和约1.01至约1.8的多分散指数在一些实施方案中，单体官能化PPF聚合物具有1.0kDa或更大、在其他实施方案中约5kDa或更大、在其他实施方案中约8kDa或更大、在其他实施方案中约10kDa或更大、在其他实施方案中约1000kDa或更大、以及在其他实施方案中约10,000kDa或更大的Mn。在一些实施方案中，单体官能化PPF聚合物具有90,000kDa或更小、在其他实施方案中约80,000kDa或更小、在其他实施方案中约70,000kDa或更小、在其他实施方案中约60,000kDa或更小、在其他实施方案中约50,000kDa或更小、以及在其他实施方案中约40,000kDa或更小的Mn。
在一些实施方案中，单体官能化PPF聚合物具有1.03或更大、在其他实施方案中约1.05或更大、在其他实施方案中约1.10或更大、在其他实施方案中约1.20或更大、在其他实施方案中约1.30或更大、在其他实施方案中约1.40或更大的多分散指数在一些实施方案中，单体官能化PPF聚合物具有1.70或更小、在其他实施方案中约1.60或更小、在其他实施方案中约1.50或更小、在其他实施方案中约1.40或更小、在其他实施方案中约1.30或更小、以及在其他实施方案中约1.20或更小的
官能化环氧丙烷单体
在第三方面，本发明涉及用于形成上文讨论的新颖的官能化PPF聚合物的新颖的官能化共聚单体。在各种实施方案中，用于形成本发明的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的官能化单体包含通过醚键连接至具有能够与相应的官能团进行点击反应的官能团的烷基或芳基的缩水甘油基。在这些实施方案中的一些中，烷基或芳基包含炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基或卤化合物基团。在一些其他实施方案中，官能团可以直接连接至缩水甘油基。
在一些实施方案中，本发明的新颖的官能化共聚单体可以具有下式：
其中R是官能团，或含有官能团的烷基或芳基，所述官能团能够与待添加至PPF聚合物的生物活性化合物(即生物活性药物、肽、蛋白质、糖类等，如上所述)、功能性物质或其他化合物上的相应官能团进行“点击”或其他反应。在一些实施方案中，可以将靶向的生物活性化合物官能化以添加相应的官能团，条件是这样做不会使生物活性化合物变性或以其他方式使将要加至PPF聚合物的生物活性化合物、功能性物质或其他化合物对其预期目的无效。在一个或多个实施方案中，R将是含有炔烃、烯烃、羟基、受保护的羟基、硫醇或卤化物官能团的烷基或芳基。
在一个或多个实施方案中，本发明的官能化单体是缩水甘油基炔丙基醚。在一些实施方案中，本发明的官能化单体可具有下式：
在一个或多个其他实施方案中，本发明的官能化单体是2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。在一些实施方案中，本发明的官能化单体可具有下式：
在一些其他实施方案中，官能化环氧丙烷可以是(±)-表氯醇。在一些实施方案中，本发明的官能化单体可具有下式：
具有连接物的官能化PPF聚合物
在另一个方面，本发明涉及如上所述的官能化PPF聚合物，其进一步包含一种或多种连接至如上所述的PPF聚合物上的官能团的生物活性或其他功能性物质。在一个或多个实施方案中，本发明可以包括连接至本发明的官能化PPF聚合物的短链肽、染料或其他生物活性化合物或功能性物质，如以下方案3所示和/或如以下实例13和14中所述的。在这些实施方案中的一些中，将叠氮化物官能化的染料、生物活性化合物或其他功能性物质溶解于合适的溶剂，诸如异丙醇/H2O混合物中、与CuSO4催化剂和抗坏血酸钠合并，并且使其与具有炔烃官能团的末端或单体官能化PPF聚合物反应约1小时。在这些实施方案中，通过铜辅助的1,3胡伊斯根环加成点击反应将官能化的染料、生物活性化合物或其他功能性物质添加至末端或单体官能化PPF聚合物。然后用异丙醇和H2O洗涤具有连接的染料、生物活性化合物或其他功能性物质的末端或单体官能化PPF聚合物，以除去任何未系接的染料、生物活性化合物或其他功能性物质和催化剂。
在一些其他实施方案中，叠氮化物官能化肽可以如下合成。首先，可以使用标准Fmoc化学条件和Wang树脂，在CEM Liberty1肽合成仪上通过微波辅助固相肽合成法(SPSS)合成所需的肽。然后将肽(仍然在Wang树脂上)与溴己酸(1mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和羟基苯并三唑合并，并且使其反应约2小时以产生Br-官能化肽，然后使用惯用方法将其裂解下来。然后纯化固体Br-官能化肽，然后再溶于10％乙醇水溶液中。通过以下方式进行对叠氮化物官能团的添加：添加NaN3和18-冠醚-6并且使溶液反应约12h，得到叠氮化物官能化肽。
官能化PPF支架或其他聚合物结构
在又另一个方面，本发明涉及包含如上所述的官能化PPF聚合物的3D打印支架或其他结构。在这些实施方案中的一个或多个中，将本发明的官能化PPF聚合物形成到3D可打印树脂中。在这些实施方案中的一些中，3D可打印树脂具有Luo,Y.；Dolder,C.K.；Walker,J.M.；Mishra,R.；Dean,D.；Becker,M.L.,生物大分子(Biomacromolecules),2016,17,690-697中报道的组成，其公开内容以其全文并入本文。在这些实施方案中，将末端或单体官能化PPF溶解于等质量的富马酸二乙酯(DEF)中，并且将光引发剂和光散射剂的混合物均匀混合在整个树脂中。然后将树脂用cDLP打印机或其他合适的3D打印机进行3D打印和光交联以形成具有用于添加生物活性化合物或其他功能性物质的可用官能团的支架或其他聚合物结构。
在又另一个方面，本发明涉及3D打印的支架或其他聚合物结构，其包含如上所述的官能化PPF聚合物和多种生物活性或其他功能性物质，其中多种生物活性或其他功能性物质在形成支架或其他结构后已连接至PPF聚合物上的可用官能团。
制备末端官能化PPF聚合物的方法
在第二方面，本发明还涉及形成上文所述的末端官能化PPF聚合物的方法。该方法相当简单。首先，将引发醇、镁催化剂(优选Mg(BHT)2(THF)2或Mg(OEt)2)、马来酸酐和环氧丙烷置于安瓿或其它合适的密封干燥容器中并且用合适的溶剂诸如甲苯或己烷溶解至单体(马来酸酐和环氧丙烷)浓度为约0.5M至约5M。显而易见的是，重要的是使反应在密封的干燥环境中发生以避免不希望的副反应。在一些实施方案中，所有试剂均在惰性气氛下并且优选在N2覆盖层下添加。
如上所述，在本发明的这些实施方案中的一个或多个中，官能化引发醇将包含羟基，其引发马来酸酐和环氧丙烷单体的开环聚合反应，和官能端基，其可用于聚合后反应并且在聚合(步骤1)和异构化反应(步骤2)之后继续存在。合适的官能化引发醇可包括但不限于炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、PEG二醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯、具有羟基端基的线性聚合物或其组合。
用于马来酸酐和环氧丙烷的ROP聚合的催化剂可以是有机金属催化剂，并且优选是镁催化剂。合适的镁催化剂可以包括Mg(BHT)2(THF)2和Mg(OEt)2。在一个或多个实施方案中，催化剂是Mg(BHT)2(THF)2。用于该反应的合适溶剂通常是非极性烷基碳链，并且可以包括但不限于戊烷、己烷、混合己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十二烷、甲苯、二噁烷或其组合。在一些实施方案中，溶剂是甲苯。在一些其他实施方案中，溶剂是己烷或混合己烷。
如上所述，溶液中的单体(马来酸酐和(官能化和/或非官能化)环氧丙烷)浓度为约0.5M至约5M。如本领域技术人员应了解的，更高的单体浓度将导致单体的更快转化并且需要更少的溶剂。在一些实施方案中，溶液中的单体浓度是约0.5M至约4M、在其他实施方案中约0.5M至约3M、在其他实施方案中约0.5M至约2M、在其他实施方案中约1M至约5M、在其他实施方案中约1.5M至约5M、在其他实施方案中约2M至约5M、以及在其他实施方案中约2.5M至约5M。
在这些实施方案中，引发醇与镁催化剂的摩尔比是约1:1至约1:1000并且引发醇与单体的摩尔比是约1:5至约1:1000。在一些实施方案中，引发醇与镁催化剂的摩尔比是约1:1至1:500、在其他实施方案中1:1至1:300、在其他实施方案中1:1至1:200、在其他实施方案中1:1至1:100、在其他实施方案中1:1至1:75、在其他实施方案中1:1至约1:50、在其他实施方案中约1:5至约1:20、在其他实施方案中约1:5至约1:25、在其他实施方案中约1:1至约1:15、在其他实施方案中1:10至1:1000、在其他实施方案中1:50至1:1000、在其他实施方案中1:100至1:1000、以及在其他实施方案中1:200至1:1000。在一些实施方案中，引发醇与单体的摩尔比是约1:5至约1:500、在其他实施方案中约1:5至约1:300、在其他实施方案中约1:5至约1:250、在其他实施方案中约1:5至约1:150、在其他实施方案中约1:5至约1:50、在其他实施方案中约1:5至约1:10、在其他实施方案中约1:25至约1:1000、在其他实施方案中约1:100至约1:1000、在其他实施方案中约1:200至约1:1000。
对于本领域技术人员显而易见的是，马来酸酐和环氧丙烷应以约1:1的摩尔比存在于溶液中以防止浪费单体。应了解的是，在这些反应条件下，马来酸酐或环氧丙烷都不会均聚。
然后将安瓿或其他容器密封，并且将溶液加热至约40℃至约100℃的温度，持续约1h至约96h，以开始和/或维持由引发醇引发并由镁催化剂催化的马来酸酐和环氧丙烷的开环聚合反应，以形成末端官能化PPM聚合物中间体。在一些实施方案中，将溶液加热至约40℃至约90℃、在其他实施方案中约40℃至约70℃、在其他实施方案中约40℃至约50℃、在其他实施方案中约45℃至约100℃、在其他实施方案中约60℃至约100℃、以及在其他实施方案中约70℃至约100℃的温度，以形成末端官能化PPM聚合物中间体。
在一些实施方案中，将溶液加热约1h至约6h、在其他实施方案中约1h至约12h、在其他实施方案中约1h至约24h、在其他实施方案中约1h至约48h、在其他实施方案中约1h至约72h、以及在其他实施方案中约1h至约96h，以产生PPM中间体。(参见图1-3)
在一些实施方案中，在氮气覆盖层下将马来酸酐、环氧丙烷、引发醇和Mg(BHT)2(THF)2催化剂全部溶解于甲苯中，然后加热至约80℃的温度，持续约1至约30小时，以产生PPM中间体。在这些实施方案中的一些中，反应时间是约6小时至约24小时、在其他实施方案中约12小时至约24小时、在其他实施方案中约18小时至约24小时、在其他实施方案中约20小时至约24小时、在其他实施方案中约1小时至约24小时、在其他实施方案中约1小时至约20小时、以及在其他实施方案中约1小时至约18小时。
在一些其他实施方案中，在氮气覆盖层下将马来酸酐、环氧丙烷、引发醇和Mg(BHT)2(THF)2催化剂全部溶解于己烷中，然后加热至约45℃的温度，持续约1h至约100h，以产生PPM中间体。在这些实施方案中的一些中，反应时间是约12小时至约96小时、在其他实施方案中约24小时至约96小时、在其他实施方案中约36小时至约96小时、在其他实施方案中约48小时至约96小时、在其他实施方案中约60小时至约96小时、在其他实施方案中约72小时至约96小时、在其他实施方案中约84小时至约96小时、在其他实施方案中约90小时至约100小时、在其他实施方案中约1小时至约90小时、在其他实施方案中约1小时至约80小时、在其他实施方案中约1小时至约70小时。已经发现，虽然该体系由于降低的温度需要更长的聚合时间，但就放大反应而言，该方法可能是有利的。除聚合物之外的所有试剂在己烷中的溶解性意味着大部分杂质通过在聚合后倾析出己烷溶液而从聚合物中除去，因此减少了回收纯PPM聚合物中间体所需的沉淀的数量。有利地，一旦将倾析的溶液冷却至室温，未反应的MAn重结晶并且可以回收用于进一步使用。
可以使用任何已知方法收集和纯化PPM聚合物中间体。本领域普通技术人员将能够使用常规技术收集和纯化PPM聚合物而无需过度实验。在一个或多个实施方案中，所得PPM聚合物中间体可通过重复沉淀到不可混溶的溶剂中来回收，所述溶剂诸如过量的乙醚、己烷(hexane)、己烷(hexanes)、庚烷、辛烷或氯仿。
在第二步中，使用本领域已知用于异构化目的的任何方法将PPM聚合物中间体异构化成其反式异构体形式(PPF)。在一个或多个实施方案中，PPM聚合物可使用美国公布申请号2016/0237212中描述的方法异构化，所述申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。虽然异构化步骤确实导致聚合物的一些其他变化，但应显而易见的是，本发明实施方案的末端官能化PPF聚合物的大多数一般方面，诸如近似Mn、和Tg范围在第一反应中进行测定。
在这些实施方案中的一个或多个中，然后将PPM聚合物中间体置于合适的容器诸如圆底烧瓶中，并且在惰性气氛下溶解于合适的溶剂，诸如氯仿、四氢呋喃(THF)、二噁烷、乙醚、或其组合中。据设想，可以在没有过度困难或花费的情况下除去选择的任何溶剂，并且在一些实施方案中，溶剂是氯仿。一旦PPM聚合物中间体溶解，就添加催化剂，优选二乙胺。然后将容器与冷凝器连接，然后加热至约5℃至约80℃的反应温度。在一些实施方案中，反应温度可以是约55℃至约65℃。在这些实施方案中，将溶液加热约5至约100小时。在一些实施方案中，将溶液加热约24至约48小时。
已经发现，即使相对少量的PPM聚合物链保留在PPF聚合物中，它也会不利地影响聚合物交联的能力，使其不适合3D打印和其他类似应用。因此，重要的是基本上所有PPM都转化为PPF或被除去。(参见图4)在一些实施方案中，PPM至PPF的转化率为约96质量％至约100质量％。在一些实施方案中，PPM至PPF的转化率为约98质量％至约100质量％。在一些实施方案中，PPM至PPF的转化率为约99质量％至约100质量％。在一些实施方案中，如通过紫外-可见光谱(UV-Vis)光谱、傅立叶变换红外光谱(FTIR)光谱、质子核磁共振(1H NMR)光谱或基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱测量的，本发明的PPF聚合物不含残留的PPM聚合物链。
当异构化反应完成时，可以通过本领域已知用于分离和纯化目的的任何合适的方法分离和纯化末端官能化PPF聚合物。在一个或多个实施方案中，通过从己烷中沉淀来回收末端官能化PPF聚合物，并且通过用磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)洗涤以完全除去二乙胺来分离和纯化末端官能化PPF聚合物。可以通过旋转蒸发或本领域已知用于除去目的的任何其他方法除去溶剂。
为了进一步限定和减少实践本发明的实施方案，使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂、在不同的醇引发剂和目标DP的情况下对马来酸酐和环氧丙烷的等摩尔混合物的开环共聚进行了研究。这些实验的反应条件和产率如下表1所示：
表1
使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂、在不同的醇引发剂和目标DP的情况下产生PPF聚合物的条件和产率。
a4-羟基-2-丁酮。
最初，使用苄醇(BnOH)作为伯醇引发剂，甲苯中的试剂总浓度为2M。将反应在80℃下在密封的干燥N2气氛中进行(方案2)。使聚合继续24h，然后用过量氯仿淬灭，之后从乙醚中沉淀来回收聚合物。
方案2.
使用各种引发剂的马来酸酐和环氧丙烷的开环共聚以形成聚(马来酸丙烯酯)
经由对粗反应混合物的1H NMR波谱分析和单体质子共振(δ＝7.01ppm)与相应的聚合物质子共振(δ＝6.26ppm)比较监测MAn的单体转化率。由于PO的低蒸汽压和沸点导致使用1H NMR波谱的不可靠积分，因此未表征PO的单体转化率。回收材料的1H NMR波谱分析显示聚合物是聚(马来酸丙烯酯)，其中还存在对应于苄醇的质子共振(图1)。值得注意的是，没有对应于从PO的均聚反应中观察到的亚甲基质子的质子共振(δ＝3.3-3.5ppm)。虽然在共聚过程中没有观察到MAn的均聚反应，但先前已观察到PO的均聚反应，这是由于较高的环应变导致PO的较高反应性和催化剂的低选择性。掺入到聚合物主链中的MAn和PO的比率保持大致等摩尔，并且因此观察到发生了很少的副反应(诸如在掺入的MAn的烯烃处的支化或交联)。
使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-ToF MS)以确认链端基保真度。如交替共聚体系所预期的，观察到两种主要分布，这可归因于完全聚合重复单元或半聚合重复单元(即掺入在链端的一种额外的马来酸酐或环氧丙烷)。计算针对两种主要分布的端基以对应于BnOH引发，没有观察到小的分布。因此，使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂的MAn和PO的共聚将从伯醇源选择性地引发。先前使用有机催化剂的共聚已导致不需要的副反应，包括在烯键处的交联和不需要的超支化共聚物的形成。PPM的MALDI-ToF质谱也确认了PO均聚的缺少，没有连续的质量差异，这可归因于相邻于另一个PO重复单元的PO加成。MAn和PO共聚的机理可能以类似于使用二金属锌催化剂的酸酐和环氧化物的ROCOP的方式发生，其中马来酸酐的配位插入只能通过醇链端引发并且环氧化物的配位插入只能由羧酸链端引发，这导致交替的共聚合。
在相同条件下遵循MAn和PO的ROCOP的伪一级动力学，目标聚合度(DP)为25个重复单元。在8h的时段内取出等分试样，并且通过对粗混合物1H NMR波谱分析测定MAn的单体转化率。(图5A)每个等分试样的分子量分布在沉淀后通过SEC测定。(图5B)MAn的单体转化率指示二级动力学，并且观察到蔓延(propagation)速率常数(k’p)为k’p＝1.36×10-5s-1。由于伪一级动力学，可以假设保持活性链的数量并且在整个聚合过程中不发生终止副反应。对于每个等分试样还观察到随着单体转化率增加的线性分子量增长和低的提供了受控ROCOP的进一步证据。
为了定量对共聚动力学的控制程度，确定了一系列DP目标。基于引发剂与共聚单体的比率，以10、25、50和100的DP为目标合成PPM(图6)。使用1H NMR波谱和SEC表征最终共聚物的分子量。基于苄醇亚甲基质子共振(δ＝5.01ppm)与开环环氧丙烷的次甲基质子共振(δ＝5.25ppm)和开环马来酸酐的烯烃质子共振(δ＝6.26ppm)的比率计算所得共聚物的DP。观察到分子量随目标DP线性增加，并且在整个过程中观察到低的
当然，苄基链端不是用于用生物活性物质聚合后或打印后修饰的理想端基。为此，使用炔丙醇作为伯醇引发剂，在相同条件下进行MAn和PO的ROCOP(方案3)。所得PPM的1HNMR波谱分析显示在δ＝4.78和2.27ppm处存在质子共振，分别对应于炔丙醇的亚甲基和炔烃质子。MALDI-ToF MS进一步确认了从炔丙醇的引发。观察到两种分布，一种主要分布和一种次要分布，两者的分子量均对应于炔丙醇链端。如对于苄醇引发所观察到的，主要分布是具有完全重复单元的PPM，并且次要分布包含推测在链端的额外的环氧丙烷单元。没有观察到其他分布，这表明实现了高度的链端基保真度。
方案3
使用炔丙醇作为引发剂由马来酸酐和环氧丙烷的ROCOP合成染料-和肽-功能化的聚(富马酸丙烯酯)支架。
在相同条件下使用伯醇4-羟基-2-丁酮(4HB)作为引发物种进一步探究了MAn和PO的ROCOP。选择4HB作为引发剂以有利于用胺或羟胺进行的打印后功能化。通过所得PPM材料的1H NMR波谱确认从4HB的引发，其中分别在δ＝4.45和2.19ppm处观察到酰基亚甲基和甲基的特征质子共振。同样，使用MALDI-ToF MS来确认聚合物的链端保真度。然而，由于所需的电离能，发生了裂解副反应，其中端基被裂解以释放作为副产物的丙烯醛。因此，端基呈现出通过MALDI-ToF MS进行的水引发，这在相同材料的1H和13C NMR波谱中未观察到。先前的文献显示，聚合过程中水的存在使催化剂中毒，而不是引发聚合。与苄醇和炔丙醇引发体系不同，观察到3种分布，对应于具有一个、两个或三个额外的PO重复单元的完全PPM重复单元。然而，每种分布显示出4HB链端，并且因此可以假设尽管对PO掺入的倾向增加，但仍保留了链端保真度。
为了产生端基可修饰的PPF，必须在没有导致端基物质的裂解或其他副反应的情况下进行PPM的异构化。遵循先前报道的程序(参见DiCiccio,A.M.；Coates,G.W.,美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.),2011,133,10724-10727，其公开内容通过引用以其全文并入本文)，使用二乙胺(每当量烯烃0.15当量)作为催化剂，在CHCl3中以0.5M的浓度在回流下进行苄醇引发的PPM的异构化，持续24h。将溶液用磷酸钠缓冲溶液(3:1v/v)洗涤，以在经由旋转蒸发除去溶剂之前完全除去二乙胺。回收的聚合物的1H NMR波谱显示出可归因于顺式烯烃质子的质子共振(δ＝6.2ppm)的完全减少和可归因于反式烯烃质子的新质子共振(δ＝6.7ppm)，这表明含有顺式烯烃的PPM完全异构化为含有反式烯烃的PPF。
1H NMR波谱的进一步分析显示每个端基的质子共振保留具有与异构化之前的聚合物匹配的积分，因此证明端基不受异构化过程的影响。通过对异构化之前和之后的聚合物的SEC分析(显示出相似的分子量分布)进一步确认了这一点。
在这些实验中产生的PPF聚合物的特性汇总在下表2中：
表2
使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂、在不同的醇引发剂和目标DP的情况下产生的PPF聚合物的特性
a通过1H NMR波谱测定的单体转化率。b通过1H NMR波谱对端基分析测定。c通过SEC在THF中针对聚苯乙烯标志物测定。d 4-羟基-2-丁酮。
还参见，图1-3、7-12。
作为与在较低温度下使用其他有机金属催化剂产生PPM的比较，使用苄醇作为引发剂并且使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂，在45℃下以在己烷中的2M总单体浓度进行MAn和PO的ROCOP。由于较低的温度，需要较长的聚合时间，并且因此在淬灭之前使聚合继续96h。与在甲苯中的聚合不同，在加热溶液之前未观察到MAn溶解。类似地，在大部分聚合过程中观察到聚合物与己烷溶液不混溶，这也阻止了单体转化率通过1H NMR波谱监测。然而，通过1H NMR波谱分析所得的聚合物显示，基于引发剂与单体的初始摩尔比，合成具有目标DP的PPM(表3)。MALDI-ToF MS进一步证明在聚合期间保持端基保真度，没有可归因于水引发或与水的酯交换副反应的分布。聚合物的SEC分析表明，基于1H NMR波谱，分子量对应于理论Mn和Mn，即使大部分聚合物与反应溶液不混溶，也具有低的(1.17)。
表3
针对不同DP在己烷中产生的PPF的分子量特性
a通过1H NMR波谱对端基分析测定。b通过SEC在THF中针对聚苯乙烯标志物测定。
还参见，图4、13-15。
如上所述，尽管该体系由于降低的温度需要更长的聚合时间，但就放大反应而言，该方法可能是有利的。所有试剂而非聚合物在己烷中的溶解性意味着大部分杂质通过在聚合后倾析出己烷溶液而从聚合物中除去，因此减少了回收纯PPM所需的沉淀的数量。有利地，一旦将倾析的溶液冷却至室温，观察到未反应的MAn重结晶并且可以回收用于进一步使用。由于在甲苯和己烷中产生的PPM在化学上是相同的，因此在相同条件下进行至PPF的异构化并且导致所有顺式烯烃完全转化为反式烯烃(图4)。
如上所述，为了打印3D支架，将末端官能化的PPF混合到具有先前报道的组成的树脂中。参见Luo,Y.；Dolder,C.K.；Walker,J.M.；Mishra,R.；Dean,D.；Becker,M.L.,生物大分子,2016,17,690-697，其公开内容以其全文并入本文。简而言之，将末端官能化PPF溶解于等质量的富马酸二乙酯(DEF)中，并且将光引发剂和光散射剂(4.1重量％)的混合物均匀混合在整个树脂中。使用EnvisionTEC Micro cDLP打印机打印薄膜。打印炔丙醇官能化的PPF圆盘并且计算表面积。使用铜介导的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)将546-叠氮化物染料连接至盘上，并通过消减浓度法计算炔丙醇端基的表面浓度。也就是说，在将膜浸入溶液中之后，通过UV/可见光和荧光光谱测量染料溶液浓度的降低。在存在催化剂和不存在催化剂的情况下涂覆膜并且与原始溶液进行比较。确定染料在表面上的物理吸附浓度为0.1(±0.1)pmol.cm-2，而CuAAC表面连接浓度为30.0(±3.3)pmol.cm-2。其他表面功能化材料，诸如PEG-肽水凝胶和肽交联的聚(酯脲)已经表现出相似的表面浓度，具有细胞活力增加的阳性研究。通过将673-叠氮化物染料CuAAC在覆盖有充当掩模的六角格子状透射电子显微镜(TEM)网格的薄膜上进一步证明叠氮化物官能化染料的选择性连接。将覆盖的膜浸入硫酸铜和抗坏血酸钠在异丙醇和水的混合物中的溶液中，持续1h。将膜用去离子水洗涤三次，并且置于装有673nm滤光片的荧光显微镜下进行成像。
为了确认末端官能化聚合物可以用生物活性肽衍生化，使用小鼠MC3T3-E1细胞进行细胞研究以评估肽在表面功能化后是否具有生物活性。肽序列GRGDS是RGD序列的类似物，其已被广泛用于增强细胞与生物材料表面的粘附。为此目的，经由固相肽合成来合成叠氮化物官能化的GRGDS(N3-GRGDS)，并且使用CuAAC将其连接至炔丙醇末端官能化的PPF圆盘上。(参见图16)还制备了没有添加N3-GRGDS且没有添加硫酸铜催化剂的圆盘以充当对照样本。打印直径为6mm的圆盘，并且将其用氯仿、丙酮和乙醇洗涤，以除去光引发剂副产物。在用70％乙醇和UV光灭菌后，然后测试盘的细胞毒性。将MC3T3-E1细胞在PPF盘上以250个细胞mm-2培养。在37℃和5％CO2下孵育48h后，对盘进行测定，其中可以通过绿色钙黄绿素AM染料鉴定活细胞，并且可以在荧光显微镜下通过红色乙锭同型二聚体染料鉴定死细胞。用预培养的玻璃载玻片作为对照，一式三份地定量盘(图17)。用GRGDS肽衍生化的盘显示出与末端官能化PPF(未添加RGD溶液)和物理吸附的末端官能化PPF(添加无铜的RGD溶液)对照盘相似的细胞存活率。针对载玻片对照的存活率标准化显示所有膜的细胞活力大于90％。因此，末端官能化PPF的细胞毒性低并且直接可比于逐步增长聚合产生的PPF和使用Mg(OEt)2作为ROCOP催化剂产生的PPF。
还进行肌动蛋白和细胞核的组织化学染色以可视化细胞附接。GRGDS功能化的盘在接种后显示出增强的扩散，在比末端官能化PPF对照更大的区域上具有明确定义的肌动蛋白丝形成，这与整联蛋白辅助的粘附一致。在这些初始细胞研究中收集的数据表明，GRGDS肽在系接至炔丙醇引发的PPF盘时仍具有生物活性和生物可利用性，并且进一步用其他肽或生物活性分子进行功能化是可行的。在相关的临床前模型中正在进行配体、浓度和降解的更高级研究。
通过使用ROCOP和官能伯醇引发剂合成了本发明的端基可修饰的聚(富马酸丙烯酯)(PPF)。由于ROCOP的性质，端基可修饰的PPF可以制成任何目标分子量而不会在聚合或异构化过程中因酯交换副反应或环化损失端基官能度。此外，已经用小分子染料和短链肽的连接证明了在聚合后和打印后修饰PPF支架表面的能力。在随后的细胞测定中观察到的低细胞毒性已经显示这种PPF的产生方法与先前的方法相当，具有通过对材料的肽功能化进行定向细胞分化的潜力。
用于制备官能化环氧丙烷单体的方法
在仍另一个方面，本发明涉及用于形成上文讨论的官能化环氧丙烷共聚单体的新颖的方法。一般而言，这些反应包括使用相转移化学向环氧丙烷共聚单体中添加官能团。在这些反应中，将含有所需官能团的一种或多种醇诸如炔丙醇溶解于含有碱诸如NaOH或KOH的水溶液中，并且与含有卤代环氧丙烷诸如(±)-表氯醇、相转移剂诸如四丁基硫酸氢铵和有机溶剂的溶液反应。在反应过程中，含有官能团的分子从水相转移到有机相，在有机相中它通过醚键与环氧丙烷的末端键合。因此，通过在伯卤化物上形成醚键，可以获得不同类型的官能化环氧丙烷并且将其用于通过与金属催化剂开环共聚来合成官能化PPF，如下面更详细描述的。
在各种实施方案中，醇上的官能团可以是含有官能团的烷基或芳基，所述官能团能够与待添加至PPF聚合物的生物活性化合物(即生物活性药物、肽、蛋白质、糖类等)、或任何其他化合物上的相应官能团进行“点击”或其他反应。在各种实施方案中，用于形成本发明的官能化环氧丙烷共聚单体的醇可包括但不限于炔丙醇、邻硝基苄醇、(±)-表氯醇或其组合。
在这些实施方案中的一个或多个中，合适的碱包括但不限于NaOH或KOH。在这些实施方案中的一些中，卤代环氧丙烷可以是但不限于(±)-表氯醇。在各种实施方案中，相转移剂可以是四丁基硫酸氢铵、四己基硫酸氢铵、四辛基硫酸氢铵、四癸基硫酸氢铵。在这些实施方案中的一个或多个中，合适的有机溶剂可包括但不限于甲苯、己烷、混合己烷、庚烷、辛烷、二噁烷、戊烷、壬烷、癸烷、十二烷或其组合。
在一个或多个实施方案中，官能化环氧丙烷共聚单体可根据以下方案4制备：
方案4
其中R是官能团，或含有官能团的烷基或芳基，所述官能团能够与待添加至PPF聚合物的生物活性化合物(即生物活性药物、肽、蛋白质、糖类等)、功能性物质或任何其他化合物上的相应官能团进行“点击”或其他反应。在一些实施方案中，可以将靶向的生物活性化合物官能化以添加相应的官能团，条件是这样做不会使生物活性化合物变性或以其他方式使待添加的生物活性化合物、功能性物质或其他化合物对其预期目的无效。在一个或多个实施方案中，R将是炔烃、烯烃、羟基、受保护的羟基、硫醇或卤化物官能团或含有这种官能团的烷基或芳基。
在各种实施方案中，形成本发明的官能化环氧丙烷共聚单体的方法开始于将炔丙醇添加至含有选自由氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)及其组合组成的组的碱的水溶液中。在这些实施方案中的一些中，在搅拌的同时将炔丙醇在约-10℃至约30℃的温度下逐滴添加至含有按重量计约20％至约50％NaOH的水溶液中。在这些实施方案中的一些中，水溶液含有按重量计约20％至约45％、在其他实施方案中约20％至约40％、在其他实施方案中约20％至约35％、在其他实施方案中约20％至约30％、在其他实施方案中约30％至约50％、在其他实施方案中约35％至约50％、在其他实施方案中约40％至约50％的NaOH。在一些实施方案中，水溶液在以下的温度下形成：约-10℃至约20℃、在其他实施方案中约-10℃至约15℃、在其他实施方案中约-10℃至约10℃、在其他实施方案中约-10℃至约5℃、在其他实施方案中约-10℃至约0℃、在其他实施方案中约-5℃至约30℃、在其他实施方案中约0℃至约30℃、以及在其他实施方案中约10℃至约30℃。
接下来，将(±)-表氯醇和四丁基硫酸氢铵溶解于合适的有机溶剂诸如己烷中，并且在惰性气氛下将水添加至炔丙醇水溶液中。使温度回到环境温度，并且使反应在惰性气氛诸如N2覆盖层下进行约1小时至约24小时，以产生缩水甘油基炔丙基醚。在一些实施方案中，使反应进行约5至约24小时、在其他实施方案中约10小时至约24小时、在其他实施方案中约12小时至约24小时、在其他实施方案中约1小时至约20小时、在其他实施方案中约1小时至约15小时、以及在其他实施方案中约1小时至约10小时。
然后淬灭反应，并且通过本领域已知的任何合适手段纯化所得的粗产物。在一些实施方案中，将反应在盐水中淬灭。在这些实施方案中的一些中，将粗产物用合适的有机溶剂萃取，并且通过柱色谱法或蒸馏纯化，以产生纯化的缩水甘油基炔丙基醚。在这些实施方案中的一些中，萃取步骤需要用三份二氯甲烷(DCM)萃取粗产物，经Na2SO4干燥合并的有机层，过滤出Na2SO4，并且通过旋转蒸发浓缩粗产物。
在一些实施方案中，官能化环氧丙烷共聚单体可如下文实例18中所述制备。
在一些其他实施方案中，官能化环氧丙烷共聚单体2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)可以使用基本相同的反应由邻硝基苄醇制备。在这些实施方案中，将邻硝基苄醇溶解于合适的溶剂(诸如1,4-二噁烷或THF)、和转移剂(诸如四丁基硫酸氢铵)和含有碱(诸如氢氧化钠(NaOH)或氢氧化钾(KOH))的水溶液中。在这些实施方案中的一些中，水溶液含有按重量计约20％至约50％的NaOH。在这些实施方案中的一些中，水溶液含有按重量计约20％至约45％、在其他实施方案中约20％至约40％、在其他实施方案中约20％至约35％、在其他实施方案中约20％至约30％、在其他实施方案中约30％至约50％、在其他实施方案中约35％至约50％、在其他实施方案中约40％至约50％的NaOH。
接下来，在搅拌的同时将(±)-表氯醇在约-10℃至约30℃的温度下添加至混合物中。在一些实施方案中，将(±)-表氯醇在以下的温度下逐滴添加至混合物中：约-10℃至约20℃、在其他实施方案中约-10℃至约15℃、在其他实施方案中约-10℃至约10℃、在其他实施方案中约-10℃至约5℃、在其他实施方案中约-10℃至约0℃、在其他实施方案中约-5℃至约30℃、在其他实施方案中约0℃至约30℃、以及在其他实施方案中约10℃至约30℃。
然后使温度回到环境温度，并且使反应在惰性气氛诸如N2覆盖层下进行约1小时至约96小时(或直到试剂完全反应)，以产生2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。在一些实施方案中，使反应进行约1至约72小时、在其他实施方案中约1小时至约48小时、在其他实施方案中约1小时至约24小时、在其他实施方案中约6小时至约96小时、在其他实施方案中约12小时至约96小时、以及在其他实施方案中约24小时至约72小时。
通过本领域已知的任何合适手段纯化所得的粗产物。在一些实施方案中，通过添加有机溶剂诸如乙醚或THF将2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)萃取两次或更多次到有机相中。每次分离并收集有机相。然后将合并的有机相用过量的H2O、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤两次或更多次。同样，每次洗涤时分离并收集有机层，然后合并并且用MgSO4干燥、过滤、通过旋转蒸发浓缩，并且通过柱色谱法或蒸馏纯化，以产生纯化的2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。
用于制备单体官能化PPF聚合物的方法
在另一个方面，本发明涉及用于形成上文讨论的官能化PPF聚合物的新颖的方法。通常，用于PPF合成的ROP方法使用马来酸酐和环氧丙烷作为共聚单体，所述共聚单体经历使用有机金属催化剂进行的交替的开环共聚合(ROCOP)，之后异构化形成PPF。在校正的反应条件下，使用有机金属催化剂通过交替开环共聚(ROCOP)进行的PPF合成显示出高的端基保真度、聚合期间分子量的精确控制、线性分子量增长和窄的单峰分子量分布。通过在该ROP反应中使用上述官能化的环氧丙烷，产生具有官能化侧链的单体官能化PPF聚合物。在一个或多个实施方案中，这些单体官能化的PPF聚合物也可以通过如上所述的官能化引发醇进行末端官能化。
受控聚合需要有两个特征，一个是没有终止，并且另一个是没有链转移。这两个特征使受控聚合成为合成明确定义的分子量聚合物的理想选择。通常，对于环状聚酯，采用受控聚合的一般方法是使用催化剂引发ROP。然而，为了产生用于骨组织工程临床支架或任何其他生物材料产品的PPF，必须考虑材料的体内影响。用于骨组织工程的理想材料是使用温和方法制成、以无毒方式加工并且最后打印成无毒支架。对于合成步骤，添加至反应系统中的每种试剂必须是无毒的或通过后续过程容易地除去。基于目前用于PPF合成的ROP方法，仅催化剂和溶剂有可能对最终聚合物引入毒性。可以容易地除去溶剂，并且因此只需要特别考虑催化剂。有机金属化合物必须是低毒性的，因为没有完美的方法除去材料中的痕量。为了满足这一要求，有必要考虑用于在人体中使用的中心金属和周围配体。
已发现满足所有这些要求的用于ROP的有机金属催化剂的一个实例是2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚镁(Mg(BHT)2(THF)2)。中心镁离子是人体的非细胞毒性成分，并且配体2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚盐(丁基化羟基甲苯，即BHT)已于1954年由药物管理局批准用作食品添加剂和稳定剂并且具有以下通式结构结构：
该镁催化剂不仅无毒，而且具有良好的控制ROP和ROCOP过程的能力、对空气不敏感，并且允许使用不同的引发剂而不影响催化活性。
在各种实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物可以如以下方案5中所示合成：
方案5
其中R是官能团，或含有官能团的烷基或芳基，所述官能团能够与待添加至PPF聚合物的生物活性化合物(即生物活性药物、肽、蛋白质、糖类等)、或任何其他化合物上的相应官能团进行“点击”或其他反应；并且R'是如上所述的末端官能团。在各种实施方案中，R'可以是但不限于一种或多种苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基或其组合。
在各种实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物可以如以下方案6中所示合成：
方案6
其中R是官能团，或含有官能团的烷基或芳基，所述官能团能够与待添加至PPF聚合物的生物活性化合物(即生物活性药物、肽、蛋白质、糖类等)、功能性物质或其他化合物上的相应官能团进行“点击”或其他反应。
在本发明方法的一个或多个实施方案中，首先制备如上所述的官能化环氧丙烷。接下来，使用标准Schlenk管线技术将官能化环氧丙烷、如上所述的引发醇(诸如苄醇、炔丙醇、4-羟基丁-2-酮或5-降冰片烯-2-醇)、金属催化剂(诸如Mg(BHT)2(THF)2)和马来酸酐溶解于合适的溶剂(诸如甲苯或己烷)中。在各种实施方案中，引发醇可以是或可以不是官能化引发醇。在这些实施方案中的一些中，溶液的总单体浓度是约1M至约6M、在其他实施方案中约1M至约5M、在其他实施方案中约1M至约4M、在其他实施方案中约1M至约3M、在其他实施方案中约2M至约6M、在其他实施方案中约3M至约6M、以及在其他实施方案中约4M至约6M。
在各种实施方案中，官能化环氧丙烷占使用的总环氧丙烷单体(即，官能化环氧丙烷和环氧丙烷的总组合摩尔数)的约30摩尔％至约50摩尔％。在一些实施方案中，官能化环氧丙烷占总单体的约35摩尔％至约50摩尔％、在其他实施方案中占使用的总环氧丙烷单体(即，官能化环氧丙烷和环氧丙烷的总组合尔数)的约40摩尔％至约50摩尔％、在其他实施方案中约45摩尔％至约50摩尔％、在其他实施方案中约30摩尔％至约45摩尔％、在其他实施方案中约30摩尔％至约40摩尔％、以及在其他实施方案中约30摩尔％至约35摩尔％。马来酸酐占使用的总单体(即，官能化环氧丙烷、环氧丙烷和马来酸酐的总摩尔数)的约50摩尔％。
在这些实施方案中的一个或多个中，将反应容器密封并且加热至约40℃至约80℃的温度，持续约1小时至约48小时(或直至基本上所有单体被消耗)，以产生本发明的官能化PPF聚合物的顺式异构体(官能化聚(马来酸丙烯酯))中间体。在一些实施方案中，将反应容器加热至以下温度：约40℃至约75℃、在其他实施方案中约40℃至约70℃、在其他实施方案中约40℃至约65℃、在其他实施方案中约40℃至约60℃、在其他实施方案中约50℃至约80℃、在其他实施方案中约55℃至约80℃、以及在其他实施方案中约60℃至约80℃。在一些实施方案中，将反应容器加热约1小时至约50小时、在其他实施方案中约1小时至约36小时、在其他实施方案中约1小时至约30小时、在其他实施方案中约1小时至约24小时、在其他实施方案中约6小时至约48小时、在其他实施方案中约12小时至约48小时、以及在其他实施方案中约24小时至约48小时。可以通过本领域已知用于回收目的的任何合适方法回收聚(马来酸丙烯酯)中间体。在这些实施方案中的一些中，通过在合适的有机溶剂诸如乙醚中沉淀来回收官能化聚(马来酸丙烯酯)中间体。
在这些实施方案中的一个或多个中，然后将该官能化聚(马来酸丙烯酯)中间体异构化以形成本发明的官能化PPF聚合物。在这些实施方案中，然后将回收的官能化聚(马来酸丙烯酯)中间体溶解于合适的有机溶剂，优选氯仿中，并且添加有机碱，诸如二乙胺或吡啶。然后将所得溶液在惰性气氛下加热至回流温度，持续约1小时至约50小时(或直至基本上所有聚(马来酸丙烯酯)中间体异构化)以产生本发明的官能化PPF聚合物。在一些实施方案中，使溶液回流约1小时至约36小时、在其他实施方案中约1小时至约30小时、在其他实施方案中约1小时至约24小时、在其他实施方案中约6小时至约48小时、在其他实施方案中约12小时至约48小时、在其他实施方案中约18小时至约48小时、在其他实施方案中约24小时至约48小时、以及在其他实施方案中约36小时至约48小时，以产生本发明的官能化PPF聚合物。
可以通过本领域已知用于纯化目的的任何合适方法纯化官能化PPF聚合物。在这些实施方案中的一些中，官能化PPF聚合物通过以下方式进行纯化：在过量磷酸盐缓冲盐水溶液或合适的酸溶液中重复洗涤、如上所述将有机层合并，并且真空干燥所得的聚合物以产生纯化的聚合物。
为了进一步限定和减少实践本发明的实施方案，选择容许三种不同的“点击”反应的官能团以使单体前体官能化并如下面实例部分中所述那样制备。第一个官能团是允许1,3-偶极环加成的炔基。第二个是羰基，其可以进行肟连接反应。最后一个是羟基，其可以调节PPF亲水性并形成氢键，具有进一步官能化的潜力。
对官能化环氧丙烷共聚单体的表征
1.缩水甘油基炔丙基醚(GPE)
使用相转移试剂(即四丁基硫酸氢铵)将炔丙醇从H2O转移至己烷来合成缩水甘油基炔丙基醚(GPE)。(参见实例18)纯化后，通过1H NMR波谱表征纯产物，并且将数据与起始物质进行比较，以证明产物的化学结构。GPE的1H GPE NMR波谱数据与起始物质的波谱数据的比较显示环氧环和炔官能团保持完整(图18)。此外，1H-1H COSY NMR波谱数据显示来自环氧结构的五个质子共振是耦合的，导致复杂的Gauche耦合。
2.2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)
在这些实验中，通过使用NaOH作为路易斯碱以与(±)-表氯醇形成醚键来合成2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷。纯化后，最终产物1H NMR波谱数据显示邻硝基苄基与环氧化物结构成功连接，而没有开环或其它不利的副反应(图19)。
对单体官能化PPM聚合物中间体的表征。
1.聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)(聚(GPE-co-MA))
通过缩水甘油基炔丙基醚和马来酸酐的开环共聚来合成聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)。沉淀和异构化后，通过1H和13C NMR波谱表征反式构型聚(GPE-co-MA)，通过MALDI-ToF MS和SEC表征分子量分布。
基于MALDI-ToF MS数据，靠近峰之间的规则分子量损失(210.10Da)与聚合物重复单元的分子量相同，这证明已经获得官能化PPF；类似地，1H NMR波谱显示出六种不同的质子共振，其对应于重复单元中的六种不同质子(图20)。所得PPF的13C NMR波谱显示出来自马来酸酐共聚单体和官能化环氧化物共聚单体的碳共振(图21)，这意味着已经获得了交替共聚物。
为了测试该体系可以具有多少控制，基于共聚单体和催化剂进料比测试了四种不同的目标DP聚合。在相同的反应条件下，结果显示当目标DP为大约25时，聚合可以良好精确度靶向特定的DP(表4)。同时，如果目标DP高于25，则由于聚合物溶解性差，体系最终将失去控制，并且可以控制低于25的目标DP。SEC结果显示，即使体系失去控制，与传统的酯交换方法相比，目标DP 50的聚合物分散性仍然很好。这暗示着具有催化剂的ROP具有精确控制聚合的内部特性。
表4
具有不同目标聚合度的缩水甘油基炔丙基醚和马来酸酐的共聚
a DP是聚合度；b通过1H NMR检测的；c通过SEC检测的。
2.聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)(聚(NMMO-co-MA))
以与聚(GPE-co-MA)类似的方法进行聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)合成。(参见下面的实施例19)为了测定在CHCl3中在二乙胺(每当量烯烃0.15摩尔当量)情况下回流期间烯基的异构化程度，利用了异构化之前和之后的聚合物的1H NMR波谱。如在异构化之前和之后的NMR波谱中观察到的，异构化后烯基的质子共振的化学位移有明显变化(δ＝6.27ppm至δ＝6.89ppm)，这与顺式到反式构型变化有关(图22)。在聚(GPE-co-MA)的异构化过程中类似地显示该过程。
此外，MALDI-ToF MS数据显示通过仅产生由炔丙醇引发的聚合物的聚(NMMO-co-MA)的高的端基保真度，这意味着所用的催化剂能够耐受不同的环氧化物而没有不希望的副反应。每两个靠近的峰(307.21Da)的相等重量损失和清晰的1H、13C NMR波谱证明存在官能化化学结构(图23-24)。
通过SEC分析，确定聚(NMMO-co-MA)的数均分子量(Mn)为约2.6KDa、确定重均分子量(Mw)为2.7KDa，导致1.04的分散性对于受控聚合，理想的分散性是一致的，SEC结果显示聚(NMMO-co-MA)的分散性非常接近理想的分散性，这意味着实现了对该聚合的成功控制。
通过1H NMR波谱数据证明的NMMO和MA共聚的其他完美特性是，NMMO和MA的共聚显示出高转化率(99％)并且DP几乎与目标DP(即25)相同。可能的原因是侧基硝基苄基改变了聚合物在反应溶剂(即甲苯)中的溶解度，这对应于聚合过程中较少的固体沉淀。当使用其他环氧化物时，单体的溶解度差或沸点低会严重影响聚合速率。例如，环氧丙烷在34℃沸腾，并且因此在聚合过程中可以从溶液中蒸发出。(参见图24)
聚合的动力学研究
进行了伪一级动力学研究，以进一步理解共聚过程和不同官能化单体在共聚过程中的影响。在此研究了合成的两种类型的环氧化物单体，动力学研究显示了GPE与NMMO之间的共聚速率之间的差异。
1.对于缩水甘油基炔丙基醚和马来酸酐的共聚的动力学研究
对于GPE和MA的共聚，GPE和MA的单体消耗速率是相似的，这表明这两种单体非常好地进行交替共聚(图25)；然而，如果考虑长期聚合，则GPE传播速率快于MA传播速率(图26)，这可以通过MALDI-ToF MS数据的端基分析来解释。基于MALDI-ToF MS数据，存在少量以GPE结束的聚合物链，其中经由断链副反应除去醚连接。这些GPE端基在相对较长时期内负责更高的转换率和更快的消耗率。(参见表5)
表5
基于1H NMR波谱的缩水甘油基炔丙基醚(GPE)和马来酸酐(MA)的转化率和ln([M]0/[M]t)a
a反应条件是80℃、在N2下，使用甲苯作为溶剂并且使用苄醇作为引发剂。
2.对于2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷和马来酸酐的共聚的动力学研究
表6
基于1H NMR波谱的2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)和马来酸酐(MA)的转化率和ln([M]0/[M]t)a
a反应条件是80℃、在N2下，使用甲苯作为溶剂并且使用炔丙醇作为引发剂。
对于NMMO和MA的共聚，NMMO的蔓延速率比MA消耗速率更快(表6；图27)。与GPE和MA共聚的蔓延速率相比，NMMO的蔓延速率快于MA的蔓延，导致聚合物链具有更多的NMMO重复单元，并且共聚可能不是严格的交替共聚合。根据MALDI-ToF MS数据的端基分析，这种现象也可以通过大多数聚合物链具有两个连续NMMO作为端基来解释(图24)。
对其他单体合成方法的讨论
如上所述，已经成功地实现了经由单体官能化对聚(富马酸丙烯酯)的官能化。基于通过醚化反应进行小分子连接的蓝图，尝试合成羰基官能化环氧化物，因为羰基具有进行“点击”型肟反应和其他有效有机反应的潜力。考虑到环氧化物的化学特性，官能化单体的成功合成必须防止环氧化物的开环，因此选择将环氧化物与已用于合成GPE的活性路易斯碱分离的相转移反应。然而，发现相转移反应对于羰基至环氧化物加成合成不能很好地起作用。
如上所示，实现了用炔烃和邻硝基苄基对PPF的官能化，这产生了两种新的共聚单体，分别是缩水甘油基炔丙基醚(GPE)和2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。1H和1H-1H COSY NMR波谱数据显示出GPE和NMMO的成功合成。1H和13C NMR波谱结果证明，在马来酸酐和官能化共聚单体共聚后，获得了官能化PPF，其进一步得到MALDI-ToF MS数据的支持。MALDI-ToF MS数据还显示出两种类型的官能化PPF的高的端基保真度。SEC数据显示两种官能化PPF变体具有低分散性。此外，基于动力学研究数据，用镁催化剂的开环共聚合是受控聚合，在聚合过程中没有链转移并且没有终止副反应发生。观察到不同的官能化共聚单体具有不同的蔓延速率。官能化PPF能够使用立体光刻技术进行打印，并且它们的支架具有经历表面修饰的能力，所述表面修饰可以增强PPF与细胞的分子相互作用。
用于制备官能化PPF支架或其他结构的方法
在又另一方面，本发明涉及制备上文所述的包含上文所述的官能化PPF聚合物的官能化PPF支架和其他聚合物结构的方法。如上所述，本发明的官能化FFP聚合物非常适合用于在3D打印的树脂中使用。在一个或多个实施方案中，3D支架或其他聚合物结构使用了用在先前报道的组成中的官能化PPF形成的树脂。参见Luo,Y.；Dolder,C.K.；Walker,J.M.；Mishra,R.；Dean,D.；Becker,M.L.,生物大分子,2016,17,690-697，其公开内容以其全文并入本文。简而言之，将官能化PPF溶解于等质量的富马酸二乙酯(DEF)中，并且将光引发剂和光散射剂(4.1重量％)的混合物均匀混合在整个树脂中。然后使用常规立体光刻技术或cDLP方法打印树脂并使其光交联以形成官能化PPF聚合物结构。
在一个或多个实施方案中，根据本发明的具有更高数均分子量(约4000Da或更高)的PPF聚合物可使用常规技术诸如静电纺丝、挤出或模塑然后光化学交联形成为官能化PPF支架和其他聚合物结构。本领域普通技术人员将能够由这些聚合物构建官能化PPF支架和其他聚合物结构而无需过多的实验。
用于将功能性物质连接至官能化PPF支架/结构的方法
在又另一个方面，本发明涉及将生物活性材料或其他功能性物质连接至官能化PPF聚合物的方法。在这些实施方案中的一些中，选择如上所述添加至PPF聚合物中的官能团以与待添加至聚合物的生物活性材料或其他功能性物质上的相应官能团键合。显而易见的是，生物活性材料或其他功能性物质必须具有、或被官能化以具有可用的官能团以与如上所述的PPF聚合物上的官能团键合，并且它必须以这样的方式进行，所述方式使得与上文所述的官能化PPF聚合物键合或被官能化以与上文所述的官能化PPF聚合物键合均不破坏或过度抑制所需特性或将连接生物活性材料或其他功能性物质的用途。
如上所述，待连接的生物活性材料或其他功能性物质必须含有能够与本发明的官能化PPF聚合物上的一个或多个官能团键合的官能团/部分。在一个或多个实施方案中，生物活性材料或其他功能性物质天然地含有能够与本发明的官能化PPF聚合物上的一个或多个官能团键合的官能团/部分，而不破坏或过度抑制所需特性或进行连接的用途。显而易见的是，必须存在的能够与本发明的官能化PPF聚合物上的一个或多个官能团键合的官能团/部分，必须位于生物活性化合物或其他功能性物质的自由地与本发明的官能化PPF聚合物上的官能团相互作用的区域中。这些官能化生物活性材料或其他功能性物质的实例可包括但不限于具有带有可用硫醇基团的半胱氨酸残基的肽、寡聚物或蛋白质；具有、或被官能化以具有硫醇官能团的肽、寡聚物或蛋白质；具有、或被官能化以具有烯烃或烯丙基官能团的肽、寡聚物或蛋白质；具有、或被官能化以具有炔烃或炔丙基官能团的肽、寡聚物或蛋白质；具有、或被官能化以具有叠氮化物官能团的肽、寡聚物或蛋白质(参见例如方案3，实施例14)；具有、或官能化以具有酮或胺官能团的肽、寡聚物或蛋白质；具有、或被官能化以具有羟基或受保护的羟基官能团的肽、寡聚物或蛋白质；具有、或被官能化以具有环辛炔或4-二苄基环辛炔官能团的肽、寡聚物或蛋白质；包含荧光原子或化合物或其他标记，并且具有或被官能化以具有炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基或卤化物基团的烷基或芳基；和具有、或被官能化以具有炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基团或卤化物基团的短链染料(参见例如，实施例13)。
然而，在一些其他实施方案中，待连接的生物活性材料或其他功能性物质完全没有可用的官能团或没有适于与本发明的官能化PPF聚合物上的官能团连接的官能团。在这些实施方案中，待连接的生物活性材料或其他功能性物质必须被官能化或以其他方式修饰以包含合适的官能团。如本文所用，“合适的”官能团或部分是这样的官能团或部分，其能够与优选经由点击反应连接的官能化PPF聚合物或生物活性材料/功能性物质中的另一者上的相应官能团/部分键合。显而易见的是，用于官能化待连接的生物活性材料或其他的功能性物质的具体机制将取决于所连接的特定材料，以及将与所述特定材料所将连接的官能化PPF聚合物上的一个或多个官能团键合的官能团的范围。在一个或多个实施方案中，可以如以上方案3中所示将官能团添加至代连接的生物活性材料或其他功能性物质。本领域普通技术人员能够将合适的官能团/部分连接至待连接的生物活性或其他功能性物质而无需过多的实验。
虽然不需要实践本发明，但应选择官能化PPF聚合物和连接至其上的生物活性材料或其他功能性物质上的官能团，以利用上文所述的许多“点击”反应中的任何一种。如上所述，优选已知的“点击”反应用于此目的，因为已知它们是模块化的、范围广、立体定向、产率非常高、产生可通过非色谱法(诸如重结晶或蒸馏)除去的极少副产物、对氧气和水不敏感、使用容易获得的起始物质和试剂，并且使用良性或易于除去的溶剂(如果有的话)。
对此目的特别有用的点击反应的实例是在生物活性或其他功能性物质的官能团/部分与本发明的官能化PPF聚合物上的官能团之间的硫醇与烯烃官能团之间的硫醇烯反应、硫醇与炔烃官能团之间的硫炔反应(thiolyne reaction)、炔烃与叠氮化物官能团之间的1,3-偶极环加成反应、和/或酮与胺官能团之间的肟连接反应，但许多其他合适的组合是可能的并且在本发明的范围内。例如，如果生物活性材料或其他功能性物质的官能团/部分是硫醇基团，则本发明的官能化PPF聚合物上的官能团可以是烯烃基团或炔烃基团。在该实例中，生物活性材料或其他功能性物质可通过硫醇与烯烃官能团之间的硫醇烯反应或硫醇与炔烃官能团之间的硫炔反应而连接。类似地，如果本发明的官能化PPF聚合物上的官能团是炔基，则可以使用具有、或已经被官能化以具有炔烃或叠氮化物官能团/部分的生物活性材料或其他功能性物质。在这些实施方案中，生物活性材料或其他功能性物质可通过硫醇与炔烃官能团之间的硫炔反应或炔烃与叠氮化物官能团之间的1,3-偶极环加成反应而连接。
在这些实施方案中的一些中，如上所述的PPF聚合物上的官能团实际上是保护基团或其他中间体，并且必须在反应之前除去或修饰以可以进行生物活性材料或其他功能性物质的添加。例如，在这些实施方案中的一些中，如上所述添加至PPF聚合物的官能团是卤化物基团，诸如(±)-表氯醇上的卤化物基团或硝基苄基，诸如2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。在这些实施方案中，NMMO上的硝基苄基是UV敏感性保护基团，其在暴露于特定UV波长时可以容易地被羟基替代，并且(±)-表氯醇上的卤化物基团是保护基团，其随后被任何合适的亲核试剂替代。合适的亲核试剂可包括但不限于胺、醇、硫醇和羟胺。
在一些实施方案中，本发明的聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是如上文所定义的。在这些实施方案中的一个或多个中，可以通过如上文所讨论述的1,3胡伊斯根环加成点击反应将已经用叠氮化物分子官能化的生物活性化合物或其他功能性物质，诸如官能化的肽、短链肽、蛋白质、短链染料、药物或标记物添加至末端炔丙基官能团。
在一些实施方案中，本发明的聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是如上文所定义的。在这些实施方案中，可以通过席夫碱缀合(shiff baseconjugation)或肟连接点击反应将已经被官能化为包含胺或羟胺官能团的生物活性化合物或其他功能性物质，诸如肽、短链肽、蛋白质、短链染料、药物或标记物添加至末端酮官能团。
在一些实施方案中，本发明的聚(富马酸丙烯酯)聚合物可以具有下式：
其中n是如上文所定义的。在这些实施方案中的一个或多个中，可以通过硫醇烯点击反应将已经被官能化为包含硫醇官能团的生物活性化合物或其他功能性物质，诸如肽、短链肽、蛋白质、短链染料、药物或标记物添加至末端降冰片基(norbornyl)官能团。
在一些实施方案中，本发明的官能化PPF聚合物可以具有下式：
其中n是约1至约100的整数。在这些实施方案中，可以通过硫醇炔点击反应将生物活性化合物或其他功能性物质，诸如肽、短链肽、蛋白质、短链染料、药物或标记物添加至炔丙基官能团。
在一些其他实施方案中，如权利要求1所述的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物具有下式：
其中n是约1至约100的整数。在这些实施方案中，可以使用光化学裂解NMMO官能团以产生游离羟基，然后其可以用作官能团以作为亲核试剂反应、以与亲电子试剂或其他合适的基团(诸如酰卤化合物或活化酯)反应。
在一些其他实施方案中，如权利要求1所述的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物具有下式：
其中n是约1至约100的整数。在这些实施方案中，可以通过Sn2置换反应将功能性物质诸如任何亲核试剂添加至氯酰基中。在各种实施方案中，合适的亲核试剂可包括但不限于胺、醇、硫醇和羟胺。
在各种实施方案中，本发明的官能化PPF具有低分散性、清晰的端基，并且聚合是受控聚合。这些特性可通过1H NMR波谱、13C NMR波谱、SEC、MALDI-ToF质谱和动力学研究数据证明。官能化PPF的成功合成意味着可以经由官能化共聚单体来改变PPF化学特性。此外，一旦官能化PPF支架显示出比PPF更好的一些特性，这种可扩展的官能化方法将为改变PPF化学结构用于不同应用提供一个良好的途径。
实例
提供以下实施例以更全面地说明本发明，但不应解释为限制其范围。此外，虽然一些实施例可以包括关于本发明可以起作用的方式的结论，但是发明人不旨在受这些结论的约束，而是仅作为可能的解释来提出。此外，除非使用过去时提到，否则实施例的呈现并不暗示实验或程序是否进行，或结果是否实际获得。虽然已尽力确保关于所用数字(例如量、温度)的准确性，但仍可能存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
缩写
BHT，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚盐；cDLP，连续数字光处理；CuAAC，铜辅助的叠氮化物-炔烃环加成；DEF，富马酸二乙酯；分散性；DP，聚合度；DSC，差示扫描量热法；FDM，熔融沉积成型；GPC，凝胶渗透色谱法；I，引发剂；MALDI-ToF MS，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱；MAn，马来酸酐；Mn，数均分子量；Mw，重均分子量；NMR，核磁共振；PCL，聚(ε-己内酯)；PEU，聚(酯脲)；PO，环氧丙烷；PLLA，聚(L-乳酸)；PPF，聚(富马酸丙烯酯)；PPM，聚(马来酸丙烯酯)；PU，聚(氨基甲酸酯)；RI，折射率；ROCOP，开环共聚；ROP，开环聚合；SEC，尺寸排阻色谱法；TEM，透射电子显微镜；THF，四氢呋喃；4HB，4-羟基丁-2-酮。
用于实施例1至17的材料
所有试剂均购自密理博(Millipore)-西格玛公司(Sigma)，但2,6-二叔-4-甲基苯酚除外，其购自阿科斯公司(Acros)(吉尔(Geel)，比利时(Belgium))。如先前报道那样合成Mg(BHT)2(THF)2。参见Wilson,J.A.；Hopkins,S.A.；Wright,P.M.；Dove,A.P.,聚合物化学(Polym.Chem.),2014,5,2691-2694，其公开内容通过引用以其全文并入本文。所有溶剂均购自飞世尔公司(Fisher)并使用创新科技有限公司(InnovativeTechnology Inc.)PureSolv MD-3溶剂纯化系统干燥。在真空蒸馏之前，将苄醇、炔丙醇、4-羟基丁-2-酮和环氧丙烷经氢化钙干燥24h。将马来酸酐经P2O5真空干燥一周。所有其他试剂均按原样使用。
用于实施例1至17的仪器方法
使用瓦里安公司(Varian)Mercury 300波谱仪记录质子(1H)NMR波谱。使用瓦里安公司NMRS 500波谱仪记录碳(13C)NMR波谱。对于1H和13C NMR波谱，所有化学位移记录分别为相对于氯仿溶剂在δ＝7.26和77.16ppm处的参考峰的百万分率(ppm)。使用东曹(Tosoh)EcoSEC HLC-8320GPC在TSKgelGMHHR-M柱上串联进行折射率(RI)检测，通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定分子量。使用由聚(苯乙烯)标准物测定的校准曲线计算分子量，其中四氢呋喃(THF)作为洗脱液，流速为1.0mL min-1，并且样品浓度为10.0mg mL-1。在配备有在355nm发射的Nd:YAG激光器的布鲁克公司(Bruker)Ultra-Flex IIIMALDI-ToF/ToF质谱仪上记录MALDI-ToF质谱。将仪器以正离子模式操作。将所有样品溶解于THF中，终浓度为10mg mL-1。制备充当基质的反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈(DCTB)(20mgmL-1)和作为阳离子化剂的三氟乙酸钠(NaTFA)(10mg mL-1)并以10:1的比率混合。通过夹心法将基质和样品溶液施加到MALDI-ToF目标板上。使用FlexAnalysis软件分析MALDI-ToF数据。使用EnvisiontecTMMicro Plus连续数字光处理(cDLP)打印机打印PPF膜。在具有FITC和TRITC滤波器的Olympus IX81荧光显微镜上进行荧光显微镜检查。
实施例1
末端官能化聚(马来酸丙烯酯)(PPM)的合成(一般方法)
使用标准Schlenk线技术，将安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2、引发醇、环氧丙烷和马来酸酐。将溶液溶解到甲苯中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在80℃下加热一段限定的时间。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。
实施例2
末端官能化聚(马来酸丙烯酯)的合成(用己烷的一般方法)
使用标准Schlenk线技术，将安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2、引发醇、环氧丙烷和马来酸酐。将溶液溶解到己烷中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在45℃下加热一段限定的时间。然后将溶液倾析并且将滤液溶解到氯仿中。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。
实施例3
苄醇引发的末端官能化聚(马来酸丙烯酯)的合成
使用实施例1中所述的方法、如下面的方案7中所示使用作为引发醇的苄醇和镁催化剂、使用如下表7中所示的反应参数来合成末端官能化的聚(马来酸丙烯酯)。
方案7
通过苄醇引发且通过Mg(BHT)2(THF)2催化的马来酸酐和环氧丙烷的共聚。
表7
苄醇引发的PPM
苄基封端的聚(马来酸丙烯酯)产物的存在通过1H NMR(300MHz，303K，DMSO-d6)确认：δ＝7.37(m,C6H5),6.52-6.44(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.16-5.10(m,CH2CH(CH3)O和(C6H5)CH2O),4.21-4.14(m,CH2CH(CH3)O)以及1.30-1.15(m,CH2CH(CH3)O)ppm(参见图1)；13CNMR(125MHz，298K，DMSO-d6)：δ＝164.60和164.30(MAn*-PO,OCOCH2),130.58和130.14(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),130.00和129.51(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),128.40和128.19(芳香族Cs),68.76(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),66.98(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),65.80((C6H5)CH2O)以及15.73(PO,CH2CH(CH3)O)ppm；和尺寸排阻色谱法(SEC)(DMF)：Mn＝3.7kDa，Mw＝4.6kDa，产率＝84％。
实施例4
使用己烷的苄醇引发的末端官能化聚(马来酸丙烯酯)的合成
使用上面的实施例2中所述的方法、如下面的方案8中所示使用作为引发醇的苄醇、己烷和镁催化剂、使用如下表8中所示的反应参数来合成末端官能化的聚(马来酸丙烯酯)。
方案8
通过苄醇引发且通过Mg(BHT)2(THF)2催化的马来酸酐和环氧丙烷的共聚。
表8
苄醇引发的PPM(己烷)
苄醇封端的聚(马来酸丙烯酯)产物的存在通过1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)确认：δ＝7.35(m,C6H5),6.50-6.15(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.25-5.16(m,CH2CH(CH3)O和(C6H5)CH2O),4.24-4.12(m,CH2CH(CH3)O)以及1.39-1.11(m,CH2CH(CH3)O)ppm。13C NMR(125MHz，298K，CDCl3)：δ＝164.60和164.30(MAn*-PO,OCOCH2),130.58和130.14(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),130.00和129.51(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),128.40和128.19(芳香族Cs),68.76(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),66.98(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),65.80((C6H5)CH2O)以及15.73(PO,CH2CH(CH3)O)ppm。SEC(DMF)：Mn＝3.7kDa，Mw＝4.6kDa，(参见图27)
实施例5
炔丙醇引发的末端官能化聚(马来酸丙烯酯)的合成
使用实施例1中所述的方法、如下面的方案9中所示使用作为引发醇的炔丙醇和镁催化剂、使用如下表9中所示的反应参数来合成末端官能化的聚(马来酸丙烯酯)。
方案9
通过炔丙醇引发且通过Mg(BHT)2(THF)2催化的马来酸酐和环氧丙烷的共聚。
表9
炔丙醇引发的PPM
炔丙基封端的聚(马来酸丙烯酯)产物的存在通过1H NMR(300MHz，303K，DMSO-d6)确认：δ＝6.54-6.27(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.39-5.21(m,CH2CH(CH3)O),4.88(s,HC≡CCH2O),4.78(s,HC≡CCH2O),4.38-4.21(m,CH2CH(CH3)O),2.27(s,HC≡C)和1.38-1.19(m,CH2CH(CH3)O)ppm；13C NMR(125MHz，298K，DMSO-d6)：δ＝164.60和164.29(MAn*-PO,OCOCH2),130.58和130.14(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),130.00和129.51(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),83.56(HC≡CCH2),68.90(HC≡CCH2)68.76(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),66.98(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),65.83(HC≡CCH2O)以及15.72(CH2CH(CH3)O)ppm；和SEC(DMF)：Mn＝3.4kDa，Mw＝3.5kDa，产率＝83％。
实施例6
使用己烷的炔丙醇引发的末端官能化聚(马来酸丙烯酯)的合成
使用上面的实施例2中所述的方法、如下面的方案10中所示使用作为引发醇的苄醇、己烷和镁催化剂、使用如下表10中所示的反应参数来合成末端官能化的聚(马来酸丙烯酯)。
方案10
通过炔丙醇引发且通过Mg(BHT)2(THF)2催化的马来酸酐和环氧丙烷的共聚。
炔丙基封端的聚(马来酸丙烯酯)产物的存在通过1H NMR(300MHz，303K，DMSO-d6)确认：δ＝6.54-6.27(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.39-5.21(m,CH2CH(CH3)O),4.88(s,HC≡CCH2O),4.78(s,HC≡CCH2O),4.38-4.21(m,CH2CH(CH3)O),2.27(s,HC≡C)和1.38-1.19(m,CH2CH(CH3)O)ppm。13C NMR(125MHz，298K，DMSO-d6)：δ＝164.60和164.29(MAn*-PO,OCOCH2),130.58和130.14(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),130.00和129.51(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),83.56(HC≡CCH2),68.90(HC≡CCH2)68.76(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),66.98(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),65.83(HC≡CCH2O)以及15.72(CH2CH(CH3)O)ppm。SEC(DMF)：Mn＝750Da，Mw＝1170Da，(参见图1)
实施例7
4-羟基丁-2-酮引发的末端官能化聚(马来酸丙烯酯)的合成
使用实施例1中所述的方法、如下面的方案11中所示使用作为引发醇的4-羟基丁-2-酮和镁催化剂、使用如下表10中所示的反应参数来合成末端官能化的聚(马来酸丙烯酯)。
方案11
通过4-羟基丁-2-酮引发且通过Mg(BHT)2(THF)2催化的马来酸酐和环氧丙烷的共聚
表10
4-羟基丁-2-酮引发的PPM
4-羟基丁-2-酮封端的聚(马来酸丙烯酯)产物的存在通过1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)确认：δ＝6.42-6.28(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.33-5.25(m,CH2CH(CH3)O),4.32-4.18(m,CH2CH(CH3)O),4.08(m,CH2CH2O),3.64和3.53(m,CH3C(＝O)CH2CH2)和1.38-1.13(m,CH2CH(CH3)O和CH3C(＝O)CH2)ppm(参见图3)；13C NMR(125MHz，303K，DMSO-d6)：δ＝165.42(CH3C(＝O)CH2),164.60和164.30(MAn*-PO,OCOCH2),130.55和130.16(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),129.81和129.84(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),128.15,68.77(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),66.97(MAn*-PO,OCH(CH3)CH2),65.81(CH2CH2O),30.63(C(＝O)CH2CH2),25.08(CH3C(＝O)CH2)以及15.74(CH2CH(CH3)O)ppm；和SEC(THF)：Mn＝1.5kDa，Mw＝2.0kDa， 产率＝88％。
实施例8
用于异构化PPM的一般程序
将末端官能化聚(富马酸丙烯酯)溶解于氯仿中。将二乙胺添加至溶液中并且在氮气氛下回流24h。冷却至室温后，用磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)洗涤有机溶液并且通过从己烷中沉淀来回收聚合物。
实施例9
PPM的异构化
将末端官能化聚(马来酸丙烯酯)(11g，8mol当量烯烃)溶解于氯仿1125ml)中。将二乙胺10.01ml，0.15mol当量烯烃)添加至溶液中并且在氮气氛下回流24h。冷却至室温后，用磷酸盐缓冲溶液1350ml，pH；6)洗涤有机溶液并且通过从己烷中沉淀来回收PPF聚合物。(参见，图2)
实施例10
苄基官能化PPM的异构化
使用上面的实施例8和9中所示的方法并且如下面的方案12中所示那样将苄基官能化的聚(马来酸丙烯酯)异构化以形成苄基封端的聚(富马酸丙烯酯)。
方案12
聚(马来酸丙烯酯)的异构化以形成聚(富马酸丙烯酯)。
苄基官能化聚(马来酸丙烯酯)成为相应的苄基官能化聚(富马酸丙烯酯)的异构化通过1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)确认：δ＝7.32(m,Ar),6.87(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.36(m,CH2CH(CH3)O),5.09(s,C＝OOCH2Ar),4.04(m,CH2OC＝O),2.28(s,εCL CH2C＝OO),1.26(m,CH2CH(CH3)O),1.60和1.33(所有剩余的氢)ppm。
实施例11
炔丙基官能化的聚(富马酸丙烯酯)的异构化
使用上文所述的一般方法并且如下面的方案13中所示那样将炔丙基聚(马来酸丙烯酯)异构化以形成炔丙基封端的聚(富马酸丙烯酯)。
方案13
炔丙基聚(马来酸丙烯酯)形成炔丙基封端的聚(富马酸丙烯酯)的异构化通过1HNMR(300MHz，303K，DMSO-d6)确认：δ＝6.84-6.64(m,OC(＝O)H＝CH(＝O)O),5.27-5.07(m,CH2CH(CH3)O),4.85(s,HC≡CCH2O),4.78(s,HC≡CCH2O),4.44-4.14(m,CH2CH(CH3)O),2.32(s,HC≡C)和1.38-1.10(m,CH2CH(CH3)O)ppm。产率＝98％。图4中示出了炔丙基聚(富马酸丙烯酯)(顶部)与前体炔丙基聚(马来酸丙烯酯)(底部)的1H NMR波谱(300MHz，303K，DMSO-d6)比较。
实施例12
表面浓度测定的消减法
将PPF薄膜(1cm×1cm)浸入在染料溶液(0.5μM546-叠氮化物染料，2.5mgCuSO4，3.2mg抗坏血酸钠，在50％v/v EtOH/H2O溶液中)中，持续1h，并且使用荧光光谱测定溶液的浓度。将未使用的溶液用作标准物以测量与膜连接的染料。
实施例13
673-叠氮化物至炔丙基官能化PPF的铜介导的叠氮化物-炔烃环加成
将673-叠氮化物溶液(1mM染料，在50:50异丙醇:H2O的50％v/v溶液中，0.5mgCuSO4，1.5mg抗坏血酸钠)移取至PPF膜上并且保持1h，之后用异丙醇和H2O洗涤，以除去任何未系接的染料和催化剂。
实施例14
N3-GRGDS肽的合成
使用标准Fmoc化学条件(0.25mmol规模)在CEM Liberty1肽合成仪上通过微波辅助固相肽合成法(SPSS)合成GRGDS。添加6-溴己酸(1mmol)和GRGDS Wang树脂(0.25mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC，1.1mmol)和羟基苯并三唑(HOBt，1.1mmol)，并且使其反应2小时。然后使用15mL三氟乙酸、三异丙基硅烷和水(95:2.5:2.5体积％)的溶液将Br-官能化肽从树脂上裂解下来。在乙醚中进行三次研磨循环后，将所得的白色固体真空干燥过夜。然后将固体重新溶解于10％乙醇水溶液中。在微波合成后进行叠氮基的偶联。将NaN3(1.25mmol)和18-冠醚-6(0.0625mmol)添加至Wang树脂中并且使其反应12h以产生N3-GRGDS(C23H40N11O10的ESI m/z：[M+H]+计算值630.29；实测值630.157)。
实施例15
MC3T3-E1至聚(富马酸丙烯酯)盘上的接种
用氯仿、丙酮和乙醇洗涤炔丙醇引发的聚(富马酸丙烯酯)盘每种洗涤持续1h，然后在1×PBS中浸泡12小时。然后，通过在70％EtOH中浸泡1小时，然后对UV光暴露15min对膜进行灭菌。在细胞接种之前，将膜浸入α-MEM中2h，之后细胞接种。将小鼠颅骨干细胞(MC3T3-E1)在补充有10％胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素和100μg.mL-1链霉素的α-MEM培养基中培养，并且每3天传代一次。将第8代的MC3T3以250个细胞.mm-2接种，并且在细胞接种后48h进行所有后续实验。
实施例16
聚(富马酸丙烯酯)盘上的MC3T3细胞活力
使用LIVE/DEAD活力细胞毒性试剂盒在48h时评价细胞活力。简而言之，将5μL的4mM钙黄绿素-AM储备溶液和10μL的2mM乙锭同型二聚体-1(EthD-1)储备溶液添加至10mL的PBS中以制备活/死染色溶液。用1×PBS(1mL)洗涤样品三次。将储备溶液(200μL)添加至每个样品中并孵育15分钟。然后除去染色溶液，并且使用FITC和TRITC发射滤波器在IX81荧光显微镜下观察样品。为了分析，每个膜选择10个随机区域并且每个膜一式三份地进行。将值标准化为在载玻片上计算的细胞活力。
实施例17
聚(富马酸丙烯酯)盘上的MC3T3细胞铺展
细胞接种后48h通过细胞骨架肌动蛋白染色评价细胞铺展。将样品在3.7％多聚甲醛的CS缓冲溶液中预固定1小时，用1×PBS洗涤三次并且储存在-80℃直至染色。为了染色，将样品在0.5％v/v TritonX-100的CS缓冲溶液中孵育10分钟，并且用1×PBS洗涤三次。接下来，将样品在1×PBS溶液中的0.1重量％NaBH4溶液中孵育10分钟，并且用1×PBS洗涤三次。然后将罗丹明标记的鬼笔环肽(1:40v/v，在1×PBS中)添加至样品中并且孵育1小时。用1×PBS洗涤三次后，将DAPI溶液(6μL的在10mL PBS中的5μg.mL-1DAPI)添加至样品中并且孵育20分钟。用1×PBS洗涤3次后，使用荧光封固介质固定样品并且使用荧光显微镜成像。
用于实施例18至26的材料和装置
本文中使用的材料和装置在下面的表11和表12中列出。
表11
使用的材料
表12
用于实施例18至26的装置
用于实施例18至26的表征
使用瓦里安公司(Varian)Mercury-300NMR波谱仪记录质子(1H)NMR波谱。使用瓦里安公司Mercury-500NMR波谱仪记录碳(13C)NMR波谱。对于1H和13C NMR波谱，所有化学位移记录分别为相对于氯仿溶剂在δ＝7.26ppm和77.16ppm处的参考峰的百万分率(ppm)。使用东曹EcoSEC HLC-8320在PLgel混合的-C型柱上串联进行折射率(RI)检测，通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定分子量。使用由聚(苯乙烯)标准物测定的校准曲线计算重量，其中DMF(0.1％LiBr)作为洗脱液，流速为0.5mL.min-1，并且样品浓度为20mg mL-1。使用布鲁克UltraFlex III MALDI串联飞行时间(TOF/TOF)质谱仪记录MALDI-ToF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱。
实施例18
缩水甘油基炔丙基醚(GPE)的合成
如下面的方案14中所示那样合成缩水甘油基炔丙基醚(GPE)。
方案14
缩水甘油基炔丙基醚(GPE)的合成
在0℃下，将炔丙醇(7.6ml，0.135mol)滴加至搅拌的40％氢氧化钠水溶液(在85gH2O中的56.5g NaOH)中。将混合物搅拌30分钟。向反应体系中添加(±)-表氯醇(25g，0.27mol)、己烷(90ml)、四丁基硫酸氢铵(2.29g，6.75mmol)和H2O(12.5ml)的溶液。使反应温热至室温，并且在N2覆盖层下继续反应8h。用盐水(125ml)淬灭反应，并且用三份125mL二氯甲烷(DCM)萃取粗产物。将合并的有机层经Na2SO4干燥、过滤并且通过旋转蒸发浓缩。最终产物通过柱色谱法(1:3己烷/DCM至DCM)获得，产生产量为7.3g(48.1％)的GPE(方案3.1)。1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)：δ＝3.98(t,OCH2C≡CH),3.61-3.56(q,CHCH2OCH2),3.26-3.20(q,CHCH2OCH2),2.95-2.89(m,CHCH2OCH2),2.57-2.54(t,CH2(O)CHCH2O),2.39-2.35(m,CH2(O)CHCH2O,C≡CH)ppm。
实施例19
2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)的合成
如下面的方案15中所示那样合成2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。
方案15
2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)的合成
将邻硝基苄醇(10g，0.065mol)溶解于30mL 1,4-二噁烷中，然后添加四丁基硫酸氢铵(1.11g，3.27mmol)和40％氢氧化钠水溶液(12g H2O中的8g NaOH)。随后在0℃下将(±)-表氯醇(20mL，0.26mol)滴加至混合物中，然后使反应温热至室温。在N2下搅拌48h后，将反应混合物用两份50mL乙醚萃取。用过量的水、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤合并的醚级分。将合并的有机层经MgSO4干燥、过滤并且通过旋转蒸发浓缩。最终产物通过柱色谱法(5:3石油醚/乙醚)获得，产生产量为3.7g(27.2％)的NMMO(方案3.2)。1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)：δ＝7.95-7.32(m,Ar),4.85(s,ArCH2OCH2),3.84-3.79(q,CHCH2OCH2),3.45-3.39(q,CHCH2OCH2),3.16-3.11(m,CHCH2OCH2),2.74-2.71(t,CH2(O)CHCH2O),2.58-2.55(q,CH2(O)CHCH2O)ppm。
实施例20
2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚镁(Mg(BHT)2(THF)2)的合成
使用标准Schlenk线技术，使schlenk填充有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(6.66g，30mmol)并且溶解于通过套管转移添加的无水甲苯(30ml)中。在搅拌下将二正丁基镁(1M的己烷溶液，15ml，15mmol)滴加至反应物中。将反应再搅拌2小时，然后除去溶剂。将己烷(12.5ml)添加至反应容器中，然后添加四氢呋喃(THF)(2.5ml)。在N2下搅拌2小时后，可以除去溶剂，并且得到呈固体的最终产物(方案16)。
方案16
2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚镁(Mg(BHT)2(THF)2)的合成
实施例21
用于聚合官能化PPF的一般程序
使用标准Schlenk线技术，使安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2(121.4mg，0.2mmol)、苄醇(0.02mL，0.2mmol)、环氧化物(0.5mmol)和马来酸酐(490.3mg，0.5mmol)。将试剂溶解到甲苯中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在80℃下加热24h。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。离心后，将粗产物溶解于氯仿中，然后将二乙胺添加至混合物中，然后在N2下回流24小时。最后，用过量的磷酸盐缓冲盐水溶液(0.5M)洗涤混合物。合并有机层并干燥以回收聚合物。
实施例22
聚(表氯醇-co-马来酸酐)的合成
如下面的方案17中所示那样由(±)-表氯醇和马来酸酐合成聚(表氯醇-co-马来酸酐)。
方案17
表氯醇和马来酸酐的共聚和聚(ECH-co-MA)的异构化
使用标准Schlenk线技术，使安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2(121.4mg，0.2mmol)、苄醇(0.02mL，0.2mmol)、(±)-表氯醇(0.5mmol)和马来酸酐(490.3mg，0.5mmol)。将试剂溶解到甲苯中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在80℃下加热24h。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。离心后，将粗产物溶解于氯仿中，然后将二乙胺添加至混合物中，然后在N2下回流24小时。最后，用过量的磷酸盐缓冲盐水溶液(0.5M)洗涤混合物。合并有机层并干燥以回收聚合物。
通过1H NMR表征所得的聚合物并且在此处、在表5中和在图28中报告了结果。1HNMR(300MHz，303K，CDCl3)：δ＝7.36(m,Ar),6.86(m,COHC＝CHCO),5.35(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),5.22(s,ArCH2O),4.80-4.40(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),4.18(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),3.74(d,CH(CH2OCH2C≡CH)O),2.49(s,CH(CH2OCH2C≡CH)O)ppm。还通过13C NMR表征所得的聚合物并且在此处和在图29中报告了结果。13C NMR(125MHz，303K,CDCl3)：δ＝164.30(O-C＝O),130.03(HC＝CH),128.74(Ar C),71.28(OCH2CH),67.36((C6H5)CH2O),63.01(CH2CH(CH2Cl)O),41.89(CHCH2Cl)ppm。SEC(DMF)：Mn＝6.0kDa，Mw＝7.0kDa，还通过尺寸排阻色谱法(SEC)表征所得的聚合物并且在此处和在图30中报告了结果。SEC(DMF)：Mn＝6.0kDa，Mw＝7.0kDa，
实施例22的结果汇总于下表13中。
表13
P(ECH-co-MA)
实施例23
聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)的合成
如下面的方案18中所示的那样由缩水甘油基炔丙基醚(如上文在上面的实施例18中所示的那样制备的)和马来酸酐合成聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)。
方案18
缩水甘油基炔丙基醚和马来酸酐的共聚和聚(GPE-co-MA)的异构化
使用标准Schlenk线技术，使安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2(121.4mg，0.2mmol)、苄醇(0.02mL，0.2mmol)、缩水甘油基炔丙基醚(0.5mmol)和马来酸酐(490.3mg，0.5mmol)。将试剂溶解到甲苯中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在80℃下加热24h。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。离心后，将粗产物溶解于氯仿中，然后将二乙胺添加至混合物中，然后在N2下回流24小时。最后，用过量的磷酸盐缓冲盐水溶液(0.5M)洗涤混合物。合并有机层并干燥以回收聚合物。
通过1H NMR表征所得的聚合物并且在此处、在表14中和在图31中报告了结果。1HNMR(300MHz，303K，CDCl3)：δ＝7.36(m,Ar),6.86(m,COHC＝CHCO),5.35(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),5.22(s,ArCH2O),4.80-4.40(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),4.18(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),3.74(d,CH(CH2OCH2C≡CH)O),2.49(s,CH(CH2OCH2C≡CH)O)ppm。通过13CNMR表征所得的聚合物并且在此处和在图32中报告了结果。13C NMR(125MHz，303K，CDCl3)：δ＝164.20(O-C＝O),133.79(HC＝CH),79.12(H2C≡CH),75.57(H2C≡CH),71.17(OCH2CH),67.59(CH2OCH2C≡CH),63.51(CH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),58.76(CH2OCH2C≡CH)ppm。还通过尺寸排阻色谱法(SEC)表征聚合物。SEC(DMF)：Mn＝7.6kDa，Mw＝10.6kDa，实施例23的结果汇总于下表14中。
表14
P(GPE-co-MA)
实施例24
聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)(聚(GPE-co-MA))的合成7
使用标准Schlenk线技术，使安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2(121.4mg，0.2mmol)、苄醇(0.02mL，0.2mmol)、缩水甘油基炔丙基醚(0.58mL，0.5mmol)和马来酸酐(490.3mg，0.5mmol)。将试剂溶解到甲苯中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在80℃下加热24h。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。离心后，将粗产物溶解于氯仿中，然后将二乙胺添加至混合物中，然后在N2下回流24小时。最后，用过量的磷酸盐缓冲盐水溶液(0.5M)洗涤混合物，将有机层合并并且干燥，获得官能化聚(GPE-co-MA)(方案19)。
方案19
聚(缩水甘油基炔丙基醚-co-马来酸酐)(聚(GPE-co-MA))的合成和异构化
也通过1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)表征所得的聚合物：δ＝7.36(m,Ar),6.86(m,COHC＝CHCO),5.35(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),5.22(s,ArCH2O),4.80-4.40(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),4.18(m,OCH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),3.74(d,CH(CH2OCH2C≡CH)O),2.49(s,CH(CH2OCH2C≡CH)O)ppm和13C NMR(125MHz，303K，CDCl3)：δ＝164.20(m,O-C＝O),133.79(m,-C＝C-),79.12(s,-C≡CH),75.57(s,-C≡CH),71.17(s,-OCH2CH-),67.59(s,-CH2OCH2C≡CH),63.51(s,CH2CH(CH2OCH2C≡CH)O),58.76(s,-CH2OCH2C≡CH)ppm。(参见图30-32)
实施例25
聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)的合成
如下面的方案20中所示那样由制备的2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)(如上文在上面的实施例19中所述的)和马来酸酐合成聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)。
方案20
2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷和马来酸酐的共聚和聚(NMMO-co-MA)的异构化
通过1H NMR表征所得的聚合物并且在表15中和在图33中报告了结果。1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)：δ＝7.98-7.38(m,Ar),6.27(m,COHC＝CHCO),5.54-5.34(d,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O),4.86(s,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O),4.41(s,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O),3.76(m,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O)ppm。还通过13C NMR表征所得的聚合物并且在此处和在图34中报告了结果。13C NMR(125MHz，303K，CDCl3)：δ＝163.99(O-C＝O),147.47(Ar C),133.68(HC＝CH),129.19-124.76(m,Ar C),71.93-71.22(OCH2CH(CH2OCH2Ar)O),70.16(OCH2CH(CH2OCH2Ar)O),69.19-68.67(OCH2CH(CH2OCH2Ar)O),63.51(OCH2CH(CH2OCH2Ar)O)ppm。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)表征所得的聚合物。SEC(DMF)：Mn＝2.6kDa，Mw＝2.7kDa，
实施例25的结果汇总于下表15中。
表15
P(NMMO-co-MA)
实施例26
聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)(聚(NMMO-co-MA))的合成7
如下面的方案21中所示那样合成聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)(聚(NMMO-co-MA))。
方案21
聚(2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷-co-马来酸酐)(聚(NMMO-co-MA))的合成和异构化
使用标准Schlenk线技术，使安瓿填充有Mg(BHT)2(THF)2(121.4mg，0.2mmol)、炔丙醇(0.01mL，0.2mmol)、邻硝基苄醇(2.48mL，0.5mmol)和马来酸酐(490.3mg，0.5mmol)。将试剂溶解到甲苯中至总单体浓度为2M。将安瓿密封并在80℃下加热24h。通过在过量乙醚中沉淀回收所得的聚合物。离心后，将粗产物溶解于氯仿中，然后将二乙胺添加至混合物中，然后在N2下回流24小时。最后，用过量的磷酸盐缓冲盐水溶液(0.5M)洗涤混合物，将有机层合并并且干燥，产生聚(NMMO-co-MA)(方案21)。
通过1H NMR(300MHz，303K，CDCl3)表征所得的聚合物：δ＝7.98-7.38(m,Ar),6.27(m,COHC＝CHCO),5.54-5.34(d,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O),4.86(s,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O),4.41(s,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O),3.76(m,OCH2CH(CH2OCH2ArNO2)O)ppm。还通过13C NMR(125MHz，303K，CDCl3)表征所得的聚合物：δ＝163.99(m,O-C＝O),147.47(m,Ar),133.68(m,-C＝C-),129.19-124.76(m,Ar),71.93-71.22(d,OCH2CH(CH2OCH2Ar)O),70.16(s,OCH2CH(CH2OCH2Ar)O),69.19-68.67(d,OCH2CH(CH2OCH2Ar)O),63.51(d,OCH2CH(CH2OCH2Ar)O)ppm。
根据前述内容，应了解本发明通过提供以多种方式在结构上和功能上得到改善的官能化聚(富马酸丙烯酯)而显著推进本领域。虽然本文已经详细地公开本发明的具体实施方案，但是应该理解的是，本发明不限于所述具体实施方案或本领域一般技术人员由于本文中关于本发明的变体从而将会容易地理解本发明。应当根据以上的权利要求书来理解本发明的范围。

Claims (41)

1.一种末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物。
2.如权利要求1所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其包含马来酸酐单体的异构化残基和官能化环氧丙烷单体的残基。
3.如权利要求1或2所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其进一步包含官能化引发醇的残基。
4.如权利要求1或3所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其具有下式：
其中n是1至1000的整数，并且R是官能团、或包含所述官能团的烷基或芳基，其中所述官能团选自由以下组成的组：苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基及其组合。
5.如权利要求1、3或4所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其具有下式：
其中n是1至1000的整数。
6.如权利要求1、3、4或5所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其中所述官能化引发醇选自由以下组成的组：炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛炔醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯及其组合。
7.如权利要求2或3所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其中所述官能化环氧丙烷单体选自由以下组成的组：炔烃官能化的环氧丙烷、邻苄基官能化的环氧丙烷、2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)、缩水甘油基炔丙基醚、(±)-表氯醇及其组合。
8.如权利要求2、3、4、5或6所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其中所述官能化引发醇包含选自由以下组成的组的官能团：炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基及其组合。
9.如权利要求1-3、6、7或8所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其包含末端官能团和单体官能团二者。
10.如权利要求1、2、3、6、7、8或9所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其具有下式：
其中n是1至100的整数；R是第一官能团、或包含所述第一官能团的烷基或芳基，其中所述第一官能团选自由以下组成的组：炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基和聚(乙二醇)基团及其组合；并且R'为第二官能团、或包含所述第二官能团的烷基或芳基，其中所述第二官能团选自由以下组成的组：炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基、卤化物基团及其组合。
11.如权利要求1、2、3、6、7、8、9或10所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其具有选自以下的式：
以及
其中n是约1至约100的整数。
12.如权利要求1至11所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其具有约0.7kDa至约100,000kDa的数均分子量。
13.如权利要求1至12所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物，其具有约1.01至约1.8的多分散指数
14.一种用于形成如权利要求1-3、6-12和13所述的单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的官能化环氧丙烷单体，所述官能化环氧丙烷单体包含通过醚键连接至包含能够与相应的官能团进行点击反应的官能团的烷基或芳基的缩水甘油基。
15.如权利要求14所述的官能化单体，其中所述包含能够与相应的官能团进行点击反应的官能团的烷基或芳基选自由以下组成的组：炔基、烯基、羟基、受保护的羟基或其组合。
16.如权利要求14或15所述的官能化单体，其中所述官能化单体是缩水甘油基炔丙基醚。
17.如权利要求14-16所述的官能化单体，其具有下式：
18.如权利要求14或15所述的官能化单体，其中所述官能化单体是2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。
19.如权利要求14、15或18所述的官能化单体，其具有下式：
20.如权利要求14所述的官能化单体，其具有下式：
其中R是官能团、或包含官能团的烷基或芳基，其中所述官能团选自炔基、烯基、羟基、受保护的羟基、硫醇基、卤化物基团及其组合。
21.一种3D打印聚合物支架，其包含如权利要求1-13所述的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物。
22.如权利要求21所述的3D打印聚合物支架，其进一步包含与所述官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物键合的多种生物活性材料或功能性部分。
23.一种用于制备如权利要求1至13所述的末端或单体官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的方法，所述方法包括：
A.制备引发醇，所述引发醇进一步包含官能端基；
B.将所述引发醇、镁催化剂、马来酸酐和环氧丙烷在合适的容器中合并并且添加合适的溶剂；
C.密封然后加热所述容器以引起和/或保持由所述引发醇引发的所述马来酸酐与所述环氧丙烷之间的开环聚合反应，从而形成包含所述官能端基的聚(马来酸丙烯酯)聚合物；
D.收集和纯化包含所述官能端基的所述聚(马来酸丙烯酯)聚合物；以及
E.将包含所述官能端基的所述聚(马来酸丙烯酯)聚合物异构化以形成包含所述官能端基的聚(富马酸丙烯酯)聚合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中在步骤B的组合中所述引发醇与所述镁催化剂的摩尔比为约1:1。
25.如权利要求23所述的方法，其中在步骤B的组合中所述引发醇的摩尔数与所述马来酸酐和所述环氧丙烷的总摩尔数之比为约1:5至约1:1000。
26.如权利要求23所述的方法，其中在步骤B的溶液中所述马来酸酐和所述环氧丙烷的总浓度为约0.5M至约5.0M。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述合适的溶剂是甲苯或己烷。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述加热的步骤包括将所述容器加热至约40℃至约100℃的温度。
29.如权利要求23所述的方法，其中所述合适的溶剂是己烷并且所述加热的步骤包括将所述容器加热至约45℃的温度。
30.如权利要求23所述的方法，其中所述引发醇选自苄醇、炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛炔醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯及其组合。
31.如权利要求23所述的方法，其中所述引发醇的所述官能端基包括苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苄基环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤基、聚(乙二醇)基团及其组合。
32.如权利要求23所述的方法，其中所述镁催化剂包括Mg(BHT)2(THF)2。
33.一种用于制备如权利要求1-3、6-12和13所述的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物的方法，所述方法包括：
A.制备官能化环氧丙烷；
B.使所述官能化环氧丙烷与马来酸酐及引发醇在镁催化剂存在下反应以形成官能化聚(马来酸丙烯酯)聚合物；
C.通过使所述官能化聚(马来酸丙烯酯)聚合物与碱反应使所述官能化聚(马来酸丙烯酯)聚合物异构化以形成如权利要求1所述的官能化聚(富马酸丙烯酯)聚合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述官能化环氧丙烷选自炔烃官能化的环氧丙烷、邻苄基官能化的环氧丙烷、2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)、缩水甘油基炔丙基醚、(±)-表氯醇及其组合。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述引发醇是选自以下的官能化引发醇：苄醇、炔丙醇、烯丙醇、4-二苄基环辛炔醇、4-羟基丁-2-酮、3-羟基丙-2-酮、5-羟基戊-2-酮、6-羟基己-2-酮、7-羟基庚-2-酮、8-羟基辛-2-酮、5-降冰片烯-2-醇、α-溴代异丁酰基4-甲醇苄基甲酸酯及其组合。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述金属催化剂是2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚镁
(Mg(BHT)2(THF)2)。
37.一种制备如权利要求16或17所述的官能化单体的方法，所述方法包括：
A.将炔丙醇添加至含有选自由氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)及其组合组成的组的碱的水溶液中；
B.将(±)-表氯醇和四丁基硫酸氢铵溶解于合适的有机溶剂中；
C.将步骤B的溶液和H2O添加至步骤A的炔丙醇溶液中；以及
D.使反应在惰性气氛下进行，以产生缩水甘油基炔丙基醚。
38.如权利要求37所述的方法，其中：
添加炔丙醇的步骤(步骤A)包括在搅拌的同时将所述炔丙醇逐滴添加至温度为约-10℃至约30℃的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，其中所述氢氧化钠(NaOH)水溶液包含按重量计约20％至约50％的NaOH；
溶解步骤(步骤B)中的所述有机溶剂包括己烷；并且
使反应进行的步骤(步骤D)包括使反应温度增加至环境温度并且使所述反应在N2覆盖层下继续约1小时至约24小时。
39.如权利要求37或38所述的方法，所述方法进一步包括：
E.淬灭所述反应；
F.用合适的有机溶剂萃取粗产物；以及
G.通过柱色谱法或蒸馏来纯化步骤F的所述粗产物，以产生纯化的缩水甘油基炔丙基醚。
40.一种制备如权利要求18或19所述的官能化单体的方法，所述方法包括：
A.将邻硝基苄醇溶解于合适的有机溶剂中；
B.将四丁基硫酸氢铵和含碱的水溶液添加至步骤A的邻硝基苄醇溶液中，其中所述碱选自由氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)及其组合组成的组；
C.添加(±)-表氯醇；以及
D.使反应进行以产生2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。
41.如权利要求40所述的方法，所述方法进一步包括：
E)用合适的有机溶剂萃取粗产物；以及
F)通过柱色谱法或蒸馏来纯化步骤D的所述粗产物，以产生纯化的2-[[(2-硝基苯基)甲氧基]甲基]环氧乙烷(NMMO)。
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