CN104498024A - 一种基于芘的铜离子比率型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于芘的铜离子比率型荧光探针及其制备方法和应用，该Cu²⁺荧光探针的结构式为 ，该荧光探针的制备包括以下步骤：（1）1-芘甲醛与二乙烯三胺在无水乙醇中反应得到中间产物1-芘甲醛缩二乙烯三胺；（2）1-芘甲醛缩二乙烯三胺与噻吩-2-甲醛在无水乙醇中反应得到Cu²⁺荧光探针。本发明提供了一种合成步骤简单，响应迅速，可裸眼识别，能实现可逆操作，可循环利用的基于芘结构新颖的Cu²⁺比率型荧光探针分子及其制备方法，可以应用于中性条件下的水环境体系中Cu²⁺的测定；尤其是，该探针以两个不同的发射波长处荧光强度的比值I₄₆₀/I₃₇₅为信号参数，显著提高了检测的特异性与灵敏性，在0.2-20 μM对Cu²⁺有很好的线性关系；此外，该探针对Cu²⁺具有良好的选择性，与其它的金属离子作用时荧光强度比值I₄₆₀/I₃₇₅基本不变。

Description

一种基于芘的铜离子比率型荧光探针及其制备方法和应用

本发明涉及金属离子检测的荧光探针技术领域，尤其涉及一种基于芘的定量测定铜离子浓度的比率型荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

铜是生命体系中重要的微量元素和必要营养素。在各种过渡金属和重金属离子中，除了锌和铁，铜是人体中第三个最丰富的元素，并且其在生物体的各种基本生理过程中具有重要的作用，所以每天摄入一定量的铜对我们的健康是必不可少的。但是根据世界卫生组织（WHO）的报道，一个成年人每天摄入的铜不能超过10-12毫克，如果细胞中铜离子的浓度超标，会导致抑制神经性疾病，如阿尔茨海默（Alzheimes）病、缅克斯（Menkes）综合症和肝豆状核变性（Wilsons）病等。此外，铜被广泛的运用到工业和农业中，所以它也是一种严重的环境污染物。因此，寻找一种简便、快捷检测方法对铜离子的分析检测具有重要意义。现有测定铜离子的方法主要是原子吸收光谱法和分光光度法，但前者需要相对复杂的仪器和操作熟练的技术人员才能得到可靠的分析结果，并且检测费用高昂；而后者也需要繁琐的操作（如化学转化、掩蔽、分离、萃取等消除干扰的预处理过程），所以都不是理想的识别和检测铜离子浓度的方法。荧光探针作为一种灵敏度高、用样量少、方便快捷且具有实用价值的检测方法是检测重金属离子的有效手段。

目前关于铜离子荧光探针的研究中，大多是基于单信号发射强度改变的荧光探针，比如荧光淬灭(文献1：F.-J. Huo, C.-X. Yin, Y.-T. Yang, J. Su, J.-B. Chao, D.-S. Liu, Anal. Chem. 84 (2012) 2219-2223；文献2：K.C. Ko, J.-S. Wu, H.J. Kim, P.S. Kwon, J.W. Kim, R.A. Bartsch, J.Y. Lee, J.S. Kim, Chem. Commun. 47 (2011) 3165-3167；文献3：H.S. Kumbhar, U.N. Yadav, B.L. Gadilohar, G.S. Shankarling, Sens. Actuators B: Chem. 203 (2014) 174-180.)或荧光增强型的荧光探针（文献1：H. Qin, J. Ren, J. Wang, E. Wang, Chem. Commun. 46 (2010) 7385-7387；文献2：M. Li, Q. Liang, M. Zheng, C. Fang, S. Peng, M. Zhao, Dalton Trans. 42 (2013) 13509-13515；文献3：M. Li, H.-S. Lv, J.-Z. Luo, J.-Y. Miao, B.-X. Zhao, Sens. Actuators B: Chem. 188 (2013) 1235-1240；文献4：S. Pu, L. Ma, G. Liu, H. Ding, B. Chen, Dyes Pigments 113 (2015) 70-77；M. Saleem, K.-H. Lee, J. Lumin. 145 (2014) 843-848；文献5：H.S. Kumbhar, U.N. Yadav, B.L. Gadilohar, G.S. Shankarling, Sens. Actuators B: Chem. 203 (2014) 174-180.）。这些基于单波长发射的荧光探针易受一些因素的影响，比如：光漂白、探针分子的浓度、探针分子周围的微环境和光照射下的稳定性等。而比率型的测定方法能够克服上述因素的影响。荧光比率法是通过记录两个荧光发射峰的比率来实现对金属离子的检测的，它有利于增加响应范围，减少环境因素的影响。但是迄今为止，文献已经报道了一些比率型的铜离子荧光探针（文献1：Y. Zhou, F. Wang, Y. Kim, S.-J. Kim, J. Yoon, Org. Lett. 11 (2009) 4442-4445；文献2：C. Kar, M.D. Adhikari, A. Ramesh, G. Da, Inorg. Chem. 52 (2013) 743-752；文献3：M.H. Lee, H.J. Kim, S. Yoon, N. Park, J.S. Kim, Org. Lett. 10 (2008) 213-216；文献4：L. Yuan, W. Lin, B. Chen, Y. Xie, Org. Lett. 14 (2009) 432-435），但这些比率型荧光探针大多都是基于荧光共振能量转移（FRET）的机理来对铜离子进行检测的。一般来说，这种基于荧光共振能量转移机理来检测金属离子的荧光探针都需要两种不同的荧光基团，所以其合成比较复杂，因此迫切需要设计和合成一个只具有单荧光基团的比率型铜离子荧光探针。

芘具有荧光量子产率高、化学性质稳定和荧光寿命长的优点，特别是芘可以表现出单体和激基缔合物的双重荧光，并且在芘的功能化系统中，芘从激基缔合物发射变为单体发射的荧光强度比率的改变是很灵敏的，因此芘是一个设计比率型荧光探针理想的荧光母体。而基于单个芘的铜离子比率型荧光探针报道甚少。由此可见，发明一种基于单芘的铜离子比率型荧光探针具有非常重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种高灵敏度，高选择性，能裸眼识别，能实现可逆操作，可循环利用的基于芘结构新颖的Cu²⁺比率型荧光探针分子及其制备方法。

本发明的技术方案是，一种基于芘的铜离子比率型荧光探针，其结构式如下：

一种基于芘的铜离子比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）1-芘甲醛缩二乙烯三胺的合成：将1-芘甲醛和二乙烯三胺按摩尔比1：5混合于无水乙醇溶液中，氮气保护下，60～80 ℃下磁力搅拌回流5～10 h；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到1-芘甲醛缩二乙烯三胺；

（2）铜离子比率型荧光探针的制备：将1-芘甲醛缩二乙烯三胺和噻吩-2-甲醛按摩尔比1：1混合于无水乙醇溶液中，氮气保护下，60～80 ℃下磁力搅拌回流8～15 h；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品后，用硅胶柱色谱提纯，得到铜离子比率型荧光探针。

一种基于芘的铜离子比率型荧光探针的应用，用于测定体系中Cu²⁺的含量。

本发明的有益效果是：以芘为荧光母体，利用芘的单体和激基缔合物的转变实现荧光强度比率的增大和减小，实现了探针分子的可逆操作，可循环利用；对铜离子的检测伴随明显的可视性颜色变化，达到裸眼识别的效果；该荧光探针合成步骤简单，量子产率高，化学稳定性好，响应速度快，光稳定性强，可以使用于中性条件下的水环境体系中Cu²⁺的测定；尤其是，以两个不同的发射波长处荧光强度的比值I₄₆₀/I₃₇₅为信号参数，显著提高了检测的特异性与灵敏性，在0.2-20 μM对Cu²⁺有很好的线性关系；此外，该探针对Cu²⁺具有良好的选择性，与其它的金属离子作用时荧光强度比值I₄₆₀/I₃₇₅基本不变。

附图说明

图1为铜离子比率型荧光探针与不同浓度的Cu²⁺作用后的荧光光谱图。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；Cu²⁺荧光探针的浓度均为10 μM，Cu²⁺浓度分别为：0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、20.0 µM。荧光激发波长为342 nm。插图为Cu²⁺比率型荧光探针在发射波长为460 nm，375 nm处的的荧光比率随Cu²⁺浓度变化的关系曲线图。

图2为铜离子比率型荧光探针与不同浓度的Cu²⁺作用后的紫外可见吸收光谱图。横坐标为波长，纵坐标为吸光度；Cu²⁺荧光探针的浓度均为10 μM，Cu²⁺浓度分别为：0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0 µM。

图3为铜离子比率型荧光探针的选择性图。

图4为pH对铜离子比率型荧光探针的影响图。

图5为铜离子比率型荧光探针在体系中含有不同浓度的Cu²⁺（0.5、1、2、8 μM）时，溶液在460 nm处的荧光强度随时间变化关系曲线图。

图6为当有Cu²⁺（20 µM）和EDTA（20 µM）存在时铜离子比率型荧光探针的荧光光谱图。

图7为在pH = 7.0的Tris-HNO₃中加入不同的金属阳离子后荧光探针在日光灯下的光学照片(a)及在365 nm紫外光照射下的光学照片(b)。Mx为K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺和Al³⁺的混合溶液。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

Cu²⁺比率型荧光探针的合成，基本操作过程如下：

1．1-芘甲醛缩二乙烯三胺的合成

将2.0 g的1-芘甲醛（8.7 mmol）和5.0 mL的二乙烯三胺（43.5 mmol）溶于50 mL的无水乙醇中，在氮气保护下，75 ℃搅拌回流6 h，减压蒸出溶剂，粗产品用硅胶柱色谱提纯，得黄色固体产物，收率为75%；

2．Cu²⁺比率型荧光探针的制备

将2.0 g的1-芘甲醛缩二乙烯三胺（6.3 mmol）和0.6 mL的噻吩-2-甲醛（6.3 mmol）溶于50 mL的无水乙醇中，在氮气保护下，75 ℃搅拌回流10 h，减压蒸出溶剂，粗产品用硅胶柱层析分离，用体积比为5：1的石油醚-二氯甲烷进行洗脱，得到比率型荧光探针，收率为45%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ2.41 (s, 1H), 1.69 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.21 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.99 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.92 (s, 1H), 8.07-8.10 (m, 4H), 8.16-8.23 (m, 4H), 8.46 (d, J = 7.8 Hz, 1H) , 8.62 (d, J = 8.0 Hz, 1H). MS (TOF) m/z 410.1. 结果表明，所得产物结构正确。

实施例2：

荧光探针1与铜离子作用的溶液配制

10 mL的容量瓶中，加入5.0 mL 浓度为2×10^{– 5} mol∙L^-1的铜离子比率型荧光探针的乙醇水溶液（乙醇/水=1:1，v/v），1.0 mL 1×10^{– 3} - 1×10^{– 7} mol∙L^-1 Cu²⁺的水溶液，用Tris-HNO₃缓冲溶液定容。这样得到的待测溶液中含有1×10^{– 5} mol∙L^-1 的荧光探针1和1×10^{– 3} - 1×10^{– 8} mol∙L^-1 的Cu²⁺。待测溶液在4 ℃下避光保存。荧光探针1的空白溶液在相同的条件下制得，但不加入Cu²⁺。实验中配制溶液所用水都为二次蒸馏水。

实施例3：

荧光探针1与Cu²⁺作用的荧光光谱性质的测定

用pH值为7.0的Tris-HNO₃缓冲溶液为溶剂测定了荧光探针1与Cu²⁺作用的荧光光谱，结果如图1。荧光探针1的浓度为1.0×10^-5 mol/L，Cu²⁺的浓度依次为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、20.0 µM，激发波长为342 nm，狭缝宽度为10 nm/10 nm。从图1可以看出此荧光探针1的一个显著特征是与Cu²⁺结合前后其荧光发射峰表现出了较大位移，随着Cu²⁺浓度的增大，460 nm处荧光强度显著增加，而375 nm处的荧光强度逐渐减弱，荧光光谱发生了红移。荧光探针1与铜离子作用后其在460 nm，375 nm处的荧光比率I₄₆₀/I₃₇₅随铜离子浓度的增大而增大并且在0.2-20 μM的范围内呈线性关系，如图1插图所示。所用的荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 55荧光分光光度计。

实施例4：

荧光探针1与Cu²⁺作用的紫外可见吸收光谱性质的测定

图2为Cu²⁺比率型荧光探针与不同浓度的Cu²⁺作用后的紫外可见吸收光谱图，Cu²⁺的加入量依次为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0 µM。从图2中可以看出，在326 nm和342 nm处可以观察到芘单体的两个特征吸收峰，随着Cu²⁺浓度的增加，其326 nm和342 nm处的吸光度逐渐降低，而400 nm处的吸光度逐渐增加，吸收光谱发生了红移。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为Perkin Elmer Lambda 25型分光光度计。

实施例5：

荧光探针1对Cu²⁺测定的选择性

相同反应条件下，在荧光探针1溶液中分别加入20 μM 的Cu²⁺以及1 mM的其他常见金属离子如：K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和Cr³⁺。测定了不同金属离子对荧光探针1在460，375 nm处荧光比率的影响，结果如图3。从图3可以看出，加入Cu²⁺后，溶液的荧光比率明显增大，而加入其它的金属离子如：K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和Cr³⁺对荧光探针1的荧光强度比率影响很小。这些结果表明：荧光探针1对Cu²⁺有较好的选择性。

实施例6：

溶液pH值对荧光探针1测定Cu²⁺的荧光性质的影响

我们研究了pH值对荧光探针1和荧光探针1+Cu²⁺的影响，结果如图4。我们考察了pH值在1.0到11.0之间对荧光强度比率的影响。在pH（1.0-11.0）范围内，pH对荧光探针1基本无影响。而在Cu²⁺（浓度为2×10^{– 5} mol∙L^-1）存在的情况下，在强酸性条件下（pH < 3.0），随着pH值的降低，荧光探针1的荧光强度比率逐渐减小。当pH值大于7.0时，随pH值的增大，荧光探针1的荧光强度比率逐渐减小。而当pH在3.0至7.0之间，荧光探针1对Cu²⁺的检测不受pH的影响，并且荧光探针1的荧光比率相对较大，这为该探针用于实际样品中Cu²⁺的测定提供了有利条件。

实施例7：

荧光探针1与Cu²⁺作用的响应时间的测定

在荧光探针1溶液中分别加入0.5、1、2、8 μM的Cu²⁺，将Perkin Elmer LS 55荧光分光光度计设定在时间模式下，然后分别测得含不同浓度的Cu²⁺溶液在设定的发射波长在460 nm处，其荧光强度随时间变化关系，结果如图5。

实施例8：

荧光探针1对Cu²⁺识别过程的可逆性

如图6，在荧光探针1溶液中加入20 μM的Cu²⁺，荧光探针1在375 nm和395 nm处的发射峰消失，在460 nm处出现了一个新的发射峰。向1-Cu²⁺复合物体系中加入20 μM的EDTA，荧光探针1的荧光得到恢复，即375 nm和395 nm处的发射峰重新出现，460 nm处的发射峰消失。由此可见荧光探针1对于Cu²⁺的识别过程是可逆的。

实施例9：

荧光探针1加入不同的金属阳离子后的颜色(a)和荧光(b)的变化

图7（a）为在荧光探针1溶液中加入含不同金属离子水溶液后在日光灯下的光学照片；图7（b）为在荧光探针1溶液中加入含不同金属离子水溶液后在365 nm紫外光照射下的光学照片。从图6可以看出，在水溶液中加入1 mM的K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和Cr³⁺的水溶液后，探针溶液无明显变化，仍为无色，365 nm紫外光照射下不出现荧光；在探针溶液中加入20 μM的Cu²⁺的水溶液后，探针溶液颜色由无色变为浅绿色，365 nm紫外光照射下出现强烈的青色荧光。

实施例10：

荧光探针1的实际应用

将所制荧光探针用于水样（湘江水和池塘水）中Cu²⁺回收率的测定。将所有水样经简单处理后用所制得的探针测定，得知水样中不含Cu²⁺，然后分别加入不同浓度的Cu²⁺样品溶液。结果列于表1。从表中可以看出，探针对所有水样中Cu²⁺回收率的测定结果令人满意，看来所制探针可有效的应用于实际样品中Cu²⁺的分析测定。

（表1）

^a 三次测定的平均值，^b 标准偏差。

Claims (3)

1. 一种基于芘的铜离子比率型荧光探针，其特征在于，其结构式如下： 。

2.根据权利要求1所述的一种基于芘的铜离子荧光探针的制备方法，其特征在于它的具体制备步骤为：

（1）1-芘甲醛缩二乙烯三胺的合成：将1-芘甲醛和二乙烯三胺按摩尔比1：5混合于无水乙醇溶液中，氮气保护下，60～80 ℃下磁力搅拌回流5～10 h；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到1-芘甲醛缩二乙烯三胺；

（2）铜离子比率型荧光探针的制备：将1-芘甲醛缩二乙烯三胺和噻吩-2-甲醛按摩尔比1：1混合于无水乙醇溶液中，氮气保护下，60～80 ℃下磁力搅拌回流8～15 h；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品后，用硅胶柱色谱提纯，得到铜离子比率型荧光探针。

3.根据权利要求1所述的一种基于芘的铜离子比率型荧光探针，其特征在于：所述荧光探针应用于测定体系中Cu²⁺的含量。