CN104497104A - 肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和 Nikkoxin F及其制备方法，属于生物医药领域。本发明通过将尼可霉素的生物合成基因簇进行突变后导入到多氧霉素工业菌株中进行异源表达。经过质谱和核磁共振检测，确定产生了两种氧霉素与尼可霉素杂合的核苷类抗生素。这两种杂合抗生素对人类或植物病原真菌具有更加显著的抗菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制备方法，属于生物医药领域。
背景技术
多氧霉素与尼可霉素是核苷类抗生素的典型代表，其作用机理在于能够特异性地抑制几丁质合成酶的活性，从而破坏真菌细胞壁的合成，实现抑制真菌的作用。多氧霉素与尼可霉素不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。但由于体外活性很难转化为体内活性，这两个抗生素未能在临床上得到广泛应用。
深部真菌感染又称为侵袭性真菌感染，近年来随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、糖皮质激素和免疫抑制剂的应用，器官移植和导管介入等新型治疗手段大规模普及，恶性肿瘤、艾滋病等临床严重疾病的发生率持续上升，导致念珠菌血症之类的深部真菌感染的发病率不断增多。然而临床抗真菌药物的长期运用使得真菌耐药性也越来越严重，这给深部真菌感染的预防和治疗造成巨大困难，因此目前亟待需要研发出新型的抗真菌药物来应对日益严重的深部真菌感染问题。
从化学结构上来看，多氧霉素与尼可霉素在上具有很大的相似性。如上所示，它们都是由一个核苷骨架与一个或两个肽基组合而成。两者核苷骨架部分相同，但是多氧霉素的核苷骨架的碱基部分是尿嘧啶或其5位置被甲基、羟甲基或羧基取代的尿嘧啶，其中甲基和羟甲基取代的组分含量最高，而尼可霉素核苷骨架的碱基部分也可以是尿嘧啶，但其5位置无取代基修饰。
多氧霉素与尼可霉素结构上也存在很多不同点。对肽基部分来说，两者结构上的不同点最为为明显。多氧霉素在R2位置的肽基可以是聚肟酸(POIA)，另一个肽基是氨甲酰多氧聚草氨酸(CPOAA)，尼可霉素在R2位置肽基是羟基吡啶同型苏氨酸(HPHT)。
由于尼可霉素与多氧霉素有相同的核苷骨架，因而它们的负责核苷骨架生物合成的蛋白有较高的同源性。与核苷骨架生物合成相关的蛋白包括PolA、PolD、PolH、PolI、PolJ、PolK都在尼可霉素生物合成酶系中负责合成核苷骨架的NikI、NikJ、NikK、NikL、NikM、NikO、NikP1、NikP2、NikQ以及NikR中具有较高同源性。此外，负责多氧霉素核苷骨架与肽基的组装与多氧霉素运输的蛋白都有同源的尼可霉素生物合成蛋白相对应。
多氧霉素与尼可霉素化学结构上有一定的相似性，但有所不同；而且两者的生物合成基因簇中相关基因同源性也较高。这也就意味着一方面可以基于两个抗生素结构上的不同点设计一系列杂合抗生素，另一方面由于化学结构相近，基因同源性较高，因而生物合成蛋白对于底物的选择也可能有一定的宽容性。因而可以通过对多氧霉素与尼可霉素的生物合成基因簇进行改造而产生杂合抗生素。
多氧霉素与尼可霉素结构上也有很多不同点。就核苷骨架的碱基部分来说，尼可霉素除了可以使用尿嘧啶外还可以使用4-甲酰-4-咪唑-2-酮。对肽基部分来说，两者结构上的不同点更为明显。多氧霉素在R1位置的肽基可以是聚肟酸(POIA)，而尼可霉素在该位置可以是谷氨酸；多氧霉素的另一个肽基是氨甲酰多氧聚草氨酸(CPOAA)，尼可霉素的另一个肽基是羟基吡啶同型苏氨酸(HPHT)。
多氧霉素与尼可霉素具有相同的核苷骨架，其根本原因在负责核苷骨架生物合成的蛋白有较高的同源性。PolA、PolD、PolH、PolI、PolJ、PolK是多氧霉素中与核苷骨架生物合成途径相关的蛋白，这些蛋白在尼可霉素生物合成酶系中都有同源性较高的蛋白，负责多氧霉素生物合成调控的PolR也有同源的尼可霉素生物合成蛋白相对应。
从化学结构来看，多氧霉素与尼可霉素化有一定的相似性，但有所区别；生物合成基因簇生物信息学分析发现两者相关基因的同源性较高，这两点为定向产生杂合抗生素鉴定了基础。一方面结构的相似性表明相近或相似的结构(模块)可以相互替换，具有将实现优势结构的组合定向产生杂合抗生素的可能性；另一方面基因的同源性较高，暗示着生物合成蛋白对于底物的选择存在一定的宽容性，意味着负责组装的蛋白可以将不同来源模块催化组装在一起，产生杂合抗生素。因而可以通过对多氧霉素与尼可霉素的生物合成基因簇进行改造而定向产生杂合抗生素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供基于多氧霉素与尼可霉素的两个肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F，其结构式如下所示。
本发明还提供了两个杂合抗生素的制备方法，具体包括：
1)重组菌株LSY4的构建
将质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ通过接合转移入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3，通过apramycin抗性筛选，得到重组菌株LSY4；所述质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP中和聚肟酸生物合成关键基因polF中依次插入硫连丝菌素(tsr)抗性基因而得到的双突变菌株；
2)重组菌株LSY4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化
将重组菌株LSY4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH调节值至3.0，离心过滤后将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0.1M氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和Nikkoxin F。
以皮状丝孢酵母为指示菌进行生物测定实验，与突变株Li3(附图3A-III)相比，LSY4恢复了抗真菌活性(附图3A-IV)。发酵液用离子交换法纯化后进行HPLC-UV分析，在保留时间43.6min和48.2min分别检测到了两个新峰(附图3B中标记的1和2)，紫外光谱最大吸光值为262nm表明其核苷骨架的尿嘧啶发生了甲基或羟甲基的取代，而不是4-甲酰-4-咪唑-2-酮或者尿嘧啶本身。对两个新峰进行HR-MS检测表明分子量与Nikkoxin E和Nikkoxin F的预测分子量([M+H]+ions)m/z 510.1831和m/z 526.1780一致(附图4)。
本发明还提供了另外一种两个杂合抗生素的制备方法，具体包括:
1)重组菌株LSY4的构建
将质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ通过接合转移入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3，通过apramycin抗性筛选，得到重组菌株LSY4；所述质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP中和聚肟酸生物合成关键基因polF中依次插入硫连丝菌素(tsr)抗性基因而得到的双突变菌株；
2)高产菌株QL4的构建
将nikS通过NdeI和EcoRI酶切位点克隆到载体pJTU968上，再通过MfeI和EcoRI进行双酶切获得含有红霉素(Erythromycin)启动子的nikS片段，然后再将该片段通过EcoRI酶切位点载体pPM927上获得质粒pPM927/nikS，以接合转移方式将质粒pPM927/nikS转入重组菌株LSY4，通过streptomycin抗性筛选，得到高产菌株QL4；
3)高产菌株QL4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化
将高产菌株QL4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH调节值至3.0，离心过滤后将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0.1M氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和Nikkoxin F。
将QL4和LSY4进行同样条件发酵后，以皮状丝孢酵母为指示菌用QL4和LSY4的发酵液进行生物测定实验发现QL4发酵液抑菌圈明显增大(附图5A)。将发酵液经过相同的预处理后进行HPLC-UV定量分析(附图5B)，发现QL4中Nikkoxin E和Nikkoxin F的产量有大幅度增加，其中Nikkoxin E由88mgL-1(LSY4)增长到299mgL-1(QL4)，产量增长率为240％；Nikkoxin F由96mgL-1(LSY4)增长到416mgL-1(QL4)，产量增长率为333％(附图5C)。
作为几丁质合成酶的特异性抑制剂，尼克霉素不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。球孢子菌病(Valley Fever)是美国西南部的地方性流行病，2014年10月2日尼克霉素Z(Nikkomycin Z)作为治疗球孢子菌病的抗真菌药物正式进入美国FDA快速通道(http://www.jrn.com/kgun9/news/FDA-fast-tracks-UA-researched-Valley-Fever-drug--27810006 2.html)。但是一直以来试图通过化学方法对尼克霉素Z核苷骨架的C-5位进行修饰未能实现，本发明提供的Nikkoxin E和Nikkoxin F实现了尼克霉素Z核苷骨架C-5的甲基化和羟甲基化修饰，并且相对尼克霉素Z，Nikkoxin E和Nikkoxin F对某些致病真菌活性明显提高。
近年来，随着抗生素在农业和医药卫生行业的大规模使用，我们对相应的抗生素的数量和活性的要求在不断地增加。然而从微生物资源中挖掘天然抗生素的高速增长阶段已经过去，一方面可供挖掘抗生素的微生物资源越来越少，另一方面新颖结构的抗生素越来越难发现，抗生素的研发和应用陷入困境。对抗生素进行合理改造以提高其产量或者活性是破解当前困局的必要手段，是满足日益增加的市场需求的重要方法。发展杂合抗生素是合理改造抗生素的基本途径。
本发明通过对多氧霉素和尼克霉素进行改造获得肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F，从生物合成的角度实现了尼克霉素Z核苷骨架C-5的甲基化和羟甲基化修饰。对重组菌株LSY4进一步工程化改造获得了Nikkoxin E和Nikkoxin F的高产菌株QL4。这一研究体系为Nikkoxin E和Nikkoxin F的生物合成和工厂化生产提供了坚实的理论基础和可行的操作方案。
附图说明
图1，突变质粒pJTU5701/ΔnikO与pJTU5701/ΔnikOΔnikQ的构建示意图。
图2，突变株Li3的构建示意图与PCR验证。
图3，重组菌株发酵产物生物测定和HPLC-UV分析和杂合抗生素HR-MS确认。
图4，肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和FHR-MS确认。
图5，QL4菌株与LSY4菌株产生Nikkoxin E和F的产量比较。
图6，肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和F的二级质谱及解析。
具体实施方式
以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
1.尼可霉素生物合成基因簇改造
pJTU5701包含了完整的尼可霉素生物合成基因簇。nikO是负责生物合成Nikkomycin Z核苷骨架部分的关键基因，通过PCR-targeting的方法将pJTU5701上的nikO基因同框缺失就可以阻断核苷骨架的生物合成。构建示意图及电泳验证见附图1。
4-甲酰-4-咪唑-2-酮是NikkomycinX核苷骨架的碱基，其生物合成由NikP1、NikP2和NikQ三个蛋白负责。从pJTU5701/ΔnikQ出发，用PCR-targeting的方法将nikQ基因同框缺失就可以同时阻断核苷骨架和4-甲酰-4-咪唑-2-酮的生物合成。构建示意图及PCR验证见附图1。
2.多氧霉素工业菌株突变株构建
以多氧霉素工业菌株S.aureochromoges YB172基因组为模板，以OPdele-LarmF和OPdele-LarmR为左臂的引物，以OPdele-RarmF和OPdele-RarmR为右臂的引物，用KOD-plus高保真酶进行PCR扩增得到两段大约1.5-kb的DNA左右臂片段。将左臂片段用XbaI和BamHI酶切后克隆到pOJ446的XbaI和BamHI位点，将形成的质粒用BamHI和HapI酶切后与用BamHI酶切过的右臂片段相连，形成含左右臂的质粒。然后将该质粒用BamHI酶切，然后将两端含BglII位点的tsr片段插入该质粒中(方向与polO，polP的转录方向一致)，构建成polO，polP的中断载体为pWHU1062。验证正确后，将其导入到CXR3中(CXR3是从多氧霉素工业菌株S.aureochromoges YB172出发，通过对polF基因进行同框缺失得到的突变株)，构成了多氧霉素工业菌株氨甲酰多聚草氨酸(CPOAA)和肽基聚肟酸(POIA)生物合成通路都被阻断的突变株Li3。构建示意图及PCR验证见附图2。
3.杂合抗生素的制备
接种重组菌株QL4的孢子接于TSB中，在转速为200r/m的30℃摇床上培养30h左右，按照4％的接种量接种到发酵摇瓶中，继续置于200r/m的30℃摇床上培养70h左右，然后用0.5M的草酸溶液调节发酵液的pH值至6.0左右，每隔8h调节一次共调节3次。发酵完成后的发酵液用草酸调节pH值至3.0，然后置于70℃烘箱中放置30min左右后过虑，滤液用阳离子交换树脂Dowex50W×8，树脂用量与发酵液的比例为1:3，吸附完全后用蒸馏水洗涤至pH值至中性左右；用0.1M NH3·H2O洗脱，选择性收集组分旋转蒸发浓缩。
浓缩液过滤后进行使用岛津分析型液相LC-20A进行HPLC-UV分析，方法如下：
表1.流动相比例
| 时间(time) | 0.15％TFA | 甲醇 |
| 0 | 95 | 5 |
| 30 | 70 | 30 |
| 50 | 50 | 50 |
| 51 | 95 | 5 |
| 80 | 95 | 5 |
按同样的条件，在安捷伦制备型液相1260以3ml/min的流速进行分离并收集目标抗生素。
对制备所得的肽基核苷类杂合抗生素用Thermo ScientificLTQOrbitrap进行HR-MS分析，其中干燥气流速：10L/min，干燥气温度：275℃，雾化气压力：40psi。
4.杂合抗生素的结构确定
将分离到杂合抗生素纯品进行高分辨率质谱分析，杂合抗生素所分别产生的离子峰([M+H]+ions)m/z 510.1832和526.1779与相对应的分子量理论值[M+H]+ions510.1831(nikkoxin E,C21H27N5O10)和526.1780(nikkoxin F,C21H27N5O11)非常吻合。二级质谱所产生的分子碎片与这两个化合物理论推测断裂的方式也基本一致，见附图6。
将杂合抗生素Nikkoxin E和F溶于重水后在BrukerAV400MHz核磁共振仪上进行1D 1H谱、13C谱和相关2D谱的检测进一步确认了结构，详见表2和表3。
表2 Nikkoxin E以重水为溶剂在600MHz(δin ppm,mult.,J in Hz)时的13C和1H化学位移
| Position | 13C(δ) | 1H(δ,mult.,J) |
| 2 | 151.66 | |
| 4 | 166.29 | |
| 5 | 111.61 | |
| 6 | 137.95 | 7.39(s,1H) |
| 7 | 11.4 | 1.86(s,3H) |
| 1' | 90.29 | 5.82(dd,J＝1.3,4.6Hz,1H) |
| 2' | 72.22 | 4.56(dd,J＝8.2,3.5Hz,1H) |
| 3' | 69.84 | 4.40(dd,J＝7.6,3.0Hz,1H) |
| 4' | 82.4 | 4.30(t,J＝4.0Hz,1H) |
| 5' | 54.86 | 4.81(overlapped with H2O) |
| 6' | 171.78 | |
| 1″ | 168.55 | |
| 2″ | 56.44 | 4.45(d,J＝2.9Hz,1H) |
| 3″ | 39.55 | 2.76(m,1H) |
| 4″ | 5.86 | 0.78(d,3H) |
| 5″ | 70.67 | 5.50(s,1H) |
| 2″' | 128.32 | 8.25(d,J＝2.2Hz,1H) |
| 3″' | 155.36 | |
| 4″' | 133.76 | 8.02(dd,J＝8.9,2.2Hz,1H) |
| 5″' | 125.15 | 7.83(d,J＝8.9Hz,1H) |
| 6″' | 146.34 |
表3 Nikkoxin F以重水为溶剂在400MHz(δin ppm,mult.,J in Hz)时的13C和1H化学位移
| Position | 13C(δ) | 1H(δ,mult.,J) |
| 2 | 151.35 | |
| 4 | 164.66 | |
| 5 | 113.73 | |
| 6 | 139.91 | 7.51(s,1H) |
| 7 | 56.25 | 4.29(s,2H) |
| 1' | 90.9 | 5.76(d,J＝4.3Hz,1H) |
| 2' | 72.22 | 4.46(d,J＝1.5Hz,1H) |
| 3' | 69.58 | 4.38(dd,J＝7.6,3.0Hz,1H) |
| 4' | 82 | 4.26(m,1H) |
| 5' | 54.15 | 4.82(d,J＝3.8Hz,1H) |
| 6' | 171.58 | |
| 1″ | 168.66 | |
| 2″ | 56.35 | 4.42(d,J＝3.9Hz,1H) |
| 3″ | 39.47 | 2.69(m,1H) |
| 4″ | 5.61 | 0.72(d,J＝7.1Hz,3H) |
| 5″ | 70.68 | 5.46(d,J＝1.5Hz,1H) |
| 2″' | 128.14 | 8.19(d,J＝2.5Hz,1H) |
| 3″' | 155.34 | |
| 4″' | 133.74 | 7.96(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H) |
| 5″' | 125.08 | 7.77(d,J＝9.0Hz,1H) |
| 6″' | 146.18 |
4.杂合抗生素的活性检测
为了研究这两种肽基核苷类杂合抗生素对人类或植物病原性真菌的抗菌活性，我们选取了六个有代表性的指示菌进行最小抑菌浓度的测试，包括：白色念珠菌Candida albicans(人体致病真菌)、皮状丝孢酵母T.cutaneum(条件致病真菌)、构巢曲霉Aspergillus nidulans(条件致病真菌)、立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKtihn(水稻纹枯病原菌)以及灰梨孢菌Magnaporthe grisea(稻瘟病原菌)长柄链格孢菌Alternaria alternate(烟草赤星病原菌)。同时选用结构上具有一定对应性的多氧霉素J组分和B组分以及尼可霉素Z组分作为对照。
将待测试抗生素称量后稀释成256μg ml-1的母液，然后将其对半稀释成0.5-256μg ml-110个浓度梯度的测试药液。对于丝状真菌，将10μl的药液加入到已注入100μl PDA培养基的96孔板中，置于4℃过夜保证抗生素扩散均匀。真菌接种在培养基的表面，在28℃下培养48个小时后观察结果。对于酵母菌，将10μl的药液加入到已注入100μl YEME培养基的96孔板中，其中培养基中已加入1-5×102CFU的酵母。在28℃下培养24个小时后观察结果。
表4.抗生素的产量与最小抑菌浓度(μg ml-1)
根据最小抑菌浓度的测试结果，杂合抗生素的展现出了多样化的抗真菌活性，有些甚至与对照组活性相比有显著提高。对于人类病原菌皮状丝孢酵母(T.cutaneum)，NikkoxinE(MIC＝0.5μg/ml)展现出良好抗真菌活性；比对照的尼可霉素Z和多氧霉素J和B有明显提升，同样Nikkoxin F(MIC＝0.5μg/ml)对植物病原真菌立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKtihn)表现出强烈的抑菌作用；对于长柄链格孢菌，Nikkoxin F(MIC＝1μg/ml)的抑菌活性对对照组的天然抗生素和杂合抗生素Nikkoxin F都有一定的提升；对于构巢曲霉，测试中用到的抗生素都不是特别灵敏。整体比较而言两个肽基核苷类杂合抗生素的抑菌能力较为接近Nikkomycin Z但都并优于Nikkomycin Z。具体实验结果见表4。
Claims (4)
1.两种肽基核苷类杂合抗生素的Nikkoxin E和Nikkoxin F，其结构如下所示：
2.权利要求1所述肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F的制备方法，包括以下步骤：
1)重组菌株LSY4的构建
将质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ通过接合转移导入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3，通过apramycin抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株LSY4；所述质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP和聚肟酸生物合成关键基因polF中插入硫连丝菌素抗性基因而得到的双突变菌株；
2)重组菌株LSY4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化
重组菌株LSY4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH值调节至3.0，离心过滤后将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0.1M氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和Nikkoxin F。
3.权利要求1所述肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F的制备方法，包括以下步骤：
1)重组菌株LSY4的构建
将质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ通过接合转移导入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3，通过apramycin抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株LSY4；所述质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP和聚肟酸生物合成关键基因polF中依次插入硫连丝菌素抗性基因而得到的双突变菌株；
2)高产菌株QL4的构建
将nikS通过NdeI和EcoRI酶切位点克隆到载体pJTU968上，再通过MfeI和EcoRI进行双酶切获得含有红霉素启动子的nikS片段，然后再将该片段通过EcoRI酶切位点载体pPM927上获得质粒pPM927/nikS，以接合转移方式将质粒pPM927/nikS转入重组菌株LSY4，通过streptomycin抗性筛选和PCR验证，得到高产菌株QL4；
3)高产菌株QL4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化
高产菌株QL4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH值调节至3.0，离心过滤后将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0.1M氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和Nikkoxin F。
4.权利要求1所述的肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F在制备抗真菌药物中的应用。
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| 翟李鹏: ""多氧霉素与尼可霉素的代谢工程与组合生物合成研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑 （月刊 ） 》 * |
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