CN104490749B - 甘草液体发酵物、含发酵物的化妆品及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物发酵领域，具体涉及甘草液体发酵物、含发酵物的化妆品及其制备方法和用途。本发明所解决的技术问题是以“生物转化理论”为指导，采用甘草与乳酸菌的液体发酵体系提供一种具有抗炎、抗过敏、止痒功效的产品。本发明甘草液体发酵物是培养基中加入甘草，然后与乳酸菌发酵所得的发酵液体混合物；其中，培养基中以生药重量计，含有重量百分比为5～20％的甘草；乳酸菌的接种量为1.0×10⁴～1.0×10⁸cfu/ml。

Description

甘草液体发酵物、含发酵物的化妆品及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及甘草液体发酵物、含发酵物的化妆品及其制备方法和用途。

背景技术

甘草是传统中医药学中一味补益类中草药，药用的甘草为豆科甘草属的根及根茎。中国药典记载甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛，调和诸药等功效。甘草主要化学成分为黄酮类、次酸类、甜素类等；西医药理发现，甘草剂有抗炎和抗变态反应的功能，因此在西医临床上主要作为缓和剂。化妆品中，甘草所含黄酮类成分具有美白和防晒等功效。

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，绝大部分都是人体内必不可少且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌发酵的主要产物为乳酸，乳酸是酸性的，因此可以应用于化妆品行业中用于ph值的调节；同时，由于乳酸是皮肤中天然保湿因子NMF的组成部分，因此，保湿是乳酸在化妆品中的一项重要用途。一般中和后的乳酸作为保湿成分使用。

但甘草和乳酸菌均未见有抗炎、抗过敏、止痒等功效的报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题是以“生物转化理论”为指导，采用甘草与乳酸菌的液体发酵体系提供一种具有抗炎、抗过敏、止痒功效的产品。

本发明所解决的第一个技术问题是提供甘草与乳酸菌的液体发酵所得的甘草液体发酵物。

本发明甘草液体发酵物，以甘草和水组成培养基，然后接种乳酸菌发酵所得的液体发酵混合物；其中，培养基以生药重量计，甘草重量百分比为5～20％；乳酸菌的接种量为1.0×10⁴～1.0×10⁸cfu/ml。

上述技术方案中，培养基以生药重量计，优选甘草重量百分比为10％。甘草为原生药材或甘草饮片。

上述技术方案中，乳酸菌的接种量优选为1.0×10⁶cfu/ml。

本发明所解决的第二个技术问题是提供本发明甘草液体发酵物的制备方法，包括以下步骤：

A、以甘草和水组成培养基，以生药重量计，甘草重量百分比为5～20％；

B、接种乳酸菌，接种量为1.0×10⁴～1.0×10⁸cfu/ml；

C、于30℃～40℃和0～200rpm的条件下培养1～5天，即得甘草液体发酵物。

上述技术方案中，培养基以生药重量计，优选甘草重量百分比为10％。

上述技术方案中，乳酸菌的接种量优选为1.0×10⁶cfu/ml。

上述技术方案中，于37℃和50rpm的条件下培养5天。

上述技术方案中，接种采用的乳酸菌菌种可以选择使用目前由各种常用方式培养得到的菌种，如用于制造泡菜、酸奶的乳酸菌种等。

其中，一种优选的菌种来源和培养方式为：

A、在固体培养基中培养乳酸菌菌种；

B、将步骤A培养的乳酸菌接种入乳酸菌液体培养基中；

C、在30℃～40℃和0～200rpm的条件下培养1～5天所得乳酸菌菌种。

上述技术方案中，步骤B所述乳酸菌液体培养基中含有乳酸菌常规发酵的碳源、氮源、微量元素和/或无机盐成分，其中：碳源成分为液体培养基总重量的0.5％～10％，氮源成分为0.5％～3％，微量元素和/或无机盐成分为0.01％～1％，其余为水，灭菌即可。其中所说的碳源、氮源都可以选择目前通用培养基中的常用成分，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、酵母膏等常规培养基组成成分。进一步优选所述灭菌为经115～121℃灭菌15～30min。

上述技术方案中，步骤A所述固体培养基是由步骤B中所述的乳酸菌液体培养基1000ml和琼脂10～20g组成，按同样方式作常规灭菌处理。培养条件为：在30-40℃和0-200rpm的条件下培养1-3天；优选培养条件为：在37℃和50rpm的条件下培养1天。

本发明所解决的第三个技术问题是提供本发明甘草液体发酵物的用途，具体表现为本发明甘草液体发酵物具有明显的抗炎、抗过敏、止痒作用。

本发明所解决的第四个技术问题是提供采用本发明甘草液体发酵物或其提取物为活性成分，加入化妆品上可接受的辅料制备而成的化妆品。

本发明制备的化妆品可为爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等常见的化妆品。

采用本发明甘草液体发酵物用于肌肤的护理，较单独采用甘草提取物或乳酸菌发酵物能够明显对抗二甲苯所致小鼠耳肿胀，抑制组胺所致小鼠皮肤毛细血管扩张，具有明显的抗炎作用；能够降低DNCB诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)，具有明显的抗过敏作用；能够明显减少4-氨基吡啶诱导的小鼠皮肤过敏性瘙痒的舔体次数，具有明显的止痒作用；具有明确的抗炎、抗过敏、止痒功效。本发明甘草液体发酵物按常规方法制备的化妆品也具有明确的抗炎、抗过敏、止痒功效。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。

实施例1液体培养基对乳酸菌的生长适应性影响试验

(1)按1.0×10⁵cfu/ml接种量将乳酸菌分别接种于含有5.0％、10.0％、15.0％、20.0％甘草(均以生药重量计，以下同)的液体培养基中，于37℃和50rpm条件下培养3～5天，采用平板涂布法检测发酵液中的乳酸菌菌落数。结果如表1所示。

表1结果显示，当甘草含量为10.0％时，乳酸菌的长势佳，且基本一致；当培养基中甘草的浓度大于10％以后，乳酸菌的生长受到抑制。因此在液体发酵基中，甘草最适含量为10％。

表1 甘草含量和发酵时间对乳酸菌培养的影响

由表1结果还可以看出，随着培养时间的延长，乳酸菌的菌落数逐渐增加，从生产成本考虑，确定本发明中乳酸菌的发酵时间为120h，即5天。

(2)按1.0×10⁴、1.0×10⁵和1.0×10⁶cfu/ml接种量将乳酸菌分别接种于含有10％甘草的液体培养基中，于37℃和50rpm条件下培养5天，采用平板涂布法检测发酵液中的乳酸菌菌落数。结果如表2所示

表2 接种量对乳酸菌培养的影响

由表2结果可以看出，发酵液中的活菌数随着接种量的增加而增加，因此，确定本发明中的接种量为1.0×10⁶cfu/ml。

实施例2甘草液体发酵物的功效试验及刺激性试验

以上述由以生药重量计的甘草按10.0％的百分比加入培养基中，按1.0×10⁶cfu/ml的量接种乳酸菌后，在37℃和50rpm条件下培养5天得到所说的甘草液体发酵物，进行下述的功效试验及刺激性试验。

一、二甲苯致小鼠耳肿胀试验

昆明种小鼠70只，雌性各半，18～22g，随机分为正常对照组，模型对照组，甘草液体发酵物高、中、低剂量组(10ml/kg，5ml/kg，2.5ml/kg)，甘草药材组(10％浓度，5ml/kg)，乳酸菌液体发酵物组(5ml/kg)，每组10只。除正常对照组外，其余各组小鼠分别在右耳前后两面涂二甲苯致炎(0.02ml/只)，正常对照组在右耳前后两面涂相同剂量生理盐水。致炎0.5，1，2小时后，分别用相应剂量的样品在右耳涂药。正常对照组合模型对照组同时涂生理盐水(5ml/kg)。4小时后，将小鼠颈椎脱臼处死，剪下双耳，用8mm打孔器分别在左右耳相同部位打下耳片，称重，以两耳片重量差为炎症肿胀度，并计算肿胀抑制率。

抑制率(％)＝(模型对照组肿胀度-给药组肿胀度)/模型对照组肿胀度×100

表3 各样品对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

注：与正常对照组比较，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

试验结果如表3所示，从试验结果可知，造模后模型对照组耳肿胀度增大，与正常对照组比较，差异有显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。各给药组小鼠耳肿胀度与模型对照组比较，甘草发酵物的高、中剂量组有明显的统计差异(P<0.05，P<0.01)，说明甘草发酵物较甘草药材和乳酸菌发酵物而言，对二甲苯所致小鼠的耳廓肿胀有显著的抑制作用。

二、组胺致小鼠皮肤血管渗透性试验

昆明种小鼠70只，雌性各半，18～22g，随机分为正常对照组，模型对照组，甘草液体发酵物高、中、低剂量组(10ml/kg，5ml/kg，2.5ml/kg)，甘草药材组(10％浓度，5ml/kg)，乳酸菌液体发酵物组(5ml/kg)，每组10只。用8％硫化钠酒精溶液背部脱毛(2cm×3cm)，将受试样品涂布于背部脱毛区，连续涂抹7天。模型对照组和正常对照组同时涂布相同剂量生理盐水。末次涂药1小时后于背部脱毛区皮下注射0.1％组胺(生理盐水配制)0.05ml/只，同时静脉注射0.5％伊文斯蓝生理盐水10ml/kg，正常对照组注射相同剂量生理盐水。30分钟后处死动物，剪下蓝斑皮肤，剪碎后用(1:1)丙酮生理盐水8ml浸泡24小时，离心取上清液，在610nm测定光密度，从而确定染料渗出量。通过对局部炎症部位渗出液中伊文斯蓝的含量来判断药物对组胺所致的皮肤血管渗透性的变化程度。

表4 各样品对组胺致小鼠皮肤血管扩张的影响

注：与正常对照组比较，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

试验结果如表4所示，从试验结果可知，造模后模型对照组与正常组比较，差异显著(P<0.01)，说明造模成功；各给药组与模型对照组比较，甘草发酵物的高、中剂量组有明显的统计差异(P<0.05，P<0.01)，说明甘草发酵物较甘草药材和乳酸菌发酵物而言，能够对抗组胺所致小鼠皮肤血管扩张，使其恢复到正常水平。

三、DNCB诱导的小鼠DTH试验

昆明种小鼠70只，雌性各半，18～22g，随机分为正常对照组，模型对照组，甘草液体发酵物高、中、低剂量组(10ml/kg，5ml/kg，2.5ml/kg)，甘草药材组(10％浓度，5ml/kg)，乳酸菌液体发酵物组(5ml/kg)，每组10只。用8％硫化钠酒精溶液背部、腹部脱毛(2cm×3cm)，24小时后，用5％DNCB(0.05ml/只)涂布于小鼠脱毛后的腹部皮肤致敏，次日强化1次，正常对照组涂布相同剂量生理盐水。致敏前1天开始皮肤涂布样品，每天1次，连续7天，模型对照组和正常对照组涂布生理盐水(5ml/kg)。末次给药40分钟后，用1％DNCB丙酮液(0.02ml/只)涂右耳激发过敏反应，正常对照组涂布相同剂量生理盐水，24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下双耳，用8mm打孔器分别在左右耳相同部位打下耳片，分析天平称重，以两耳片重量差为肿胀度，作为迟发型超敏反应(DTH)强度指标。

表5 各样品对DNCB诱导的小鼠DTH的影响

注：与正常对照组比较，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

试验结果如表5所示，从试验结果可知，造模后模型对照组耳肿胀度增大，与正常对照组比较，差异有显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。各给药组小鼠耳肿胀度与模型对照组比较，甘草发酵物的高、中剂量组有明显的统计差异(P<0.05，P<0.01)，说明甘草发酵物较甘草药材和乳酸菌发酵物而言，对DNCB所致小鼠迟发型超敏反应(DTH)所引起的耳廓肿胀有显著的对抗作用。

四、4-氨基吡啶诱导的小鼠过敏性皮肤瘙痒反应试验

昆明种小鼠70只，雌性各半，18～22g，随机分为正常对照组，模型对照组，甘草液体发酵物高、中、低剂量组(10ml/kg，5ml/kg，2.5ml/kg)，甘草药材组(10％浓度，5ml/kg)，乳酸菌液体发酵物组(5ml/kg)，每组10只。用8％硫化钠酒精溶液背部脱毛(2cm×3cm)，将受试样品涂布于脱毛区皮肤上，每天1次，连续7天。模型对照组和正常对照组涂布生理盐水(5ml/kg)。末次给药40分钟后颈背部皮下注射4-AP(4-氨基吡啶)(生理盐水配成0.02％)溶液0.01ml/g，正常对照组注射等量生理盐水。记录各组小鼠在10分钟内的舔体次数(以连续舔体至出现短暂停顿，做舔体1次计算)。

表6 各样品对4-AP诱导的小鼠过敏性皮肤瘙痒反应的影响

注：与模型对照组比较，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

试验结果如表6所示，从试验结果可知，造模后模型对照组舔体次数明显增加，说明造模成功。各给药组小鼠耳肿胀度与模型对照组比较，甘草发酵物的高、中剂量组有明显的统计差异(P<0.05，P<0.01)，说明甘草发酵物较甘草药材和乳酸菌发酵物而言，对4-AP诱导的小鼠皮肤瘙痒模型的舔体反应次数，说明甘草液体发酵物具有抑制小鼠过敏性皮肤瘙痒的作用。

五、甘草液体发酵物安全性试验

采用通行的化妆品原料检测中的“急性经口和急性经皮毒性试验”以及“皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性试验”，试验结果均显示甘草发酵物属于无毒、无刺激性、无腐蚀性的化妆品原料，可用于化妆品的配方中。

从上述试验结果可知，甘草液体发酵物较未发酵的甘草药材和单一发酵的乳酸菌发酵物而言，能够明显对抗二甲苯所致小鼠耳肿胀，抑制组胺所致小鼠皮肤毛细血管扩张，具有良好的抗炎作用；能够降低DNCB诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)，具有更好的抗过敏作用；能够明显减少4-氨基吡啶诱导的小鼠皮肤过敏性瘙痒的舔体次数，具有更好的止痒作用；说明甘草液体发酵物具有很强的抗炎、抗过敏、止痒功效。由甘草液体发酵物为原料，可以采用其发酵物原液或发酵物粉，按常规方法制备的爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等形式的化妆品也应具有明确的抗炎、抗过敏、止痒功效。

Claims (14)

1.甘草液体发酵物作为唯一活性成分在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：以甘草和水组成培养基，然后接种乳酸菌发酵所得的液体发酵混合物；其中，培养基以生药重量计，甘草重量百分比为5～20％；培养基中乳酸菌的接种量为1.0×10⁴～1.0×10⁸cfu/ml；发酵时间为1～5天。

2.根据权利要求1所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：培养基以生药重量计，甘草重量百分比为10％。

3.根据权利要求1所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：甘草为原生药材或甘草饮片。

4.根据权利要求1所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：培养基中乳酸菌的接种量为1.0×10⁶cfu/ml。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：所述甘草液体发酵物的制备方法步骤如下：

A、以甘草和水组成培养基；

B、接种乳酸菌；

C、于30℃～40℃和0～200rpm的条件下培养1～5天，即得甘草液体发酵物。

6.根据权利要求5所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：步骤C于37℃和50rpm的条件下培养5天。

7.根据权利要求5所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：乳酸菌菌种的培养方法包括如下步骤：

A、在固体培养基中培养乳酸菌菌种；

B、将步骤A培养的乳酸菌接种入乳酸菌液体培养基中；

C、在30℃～40℃和0～200rpm的条件下培养1～5天所得乳酸菌菌种。

8.根据权利要求7所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：步骤B所述乳酸菌液体培养基中含有乳酸菌常规发酵的碳源、氮源、微量元素和/或无机盐成分。

9.根据权利要求8所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：培养基中碳源成分为液体培养基总重量的0.5％～10％，氮源成分为0.5％～3％，微量元素和/或无机盐成分为0.01％～1％，其余为水。

10.根据权利要求7所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：步骤A所述固体培养基是由步骤B中所述的乳酸菌液体培养基1000ml和琼脂10～20g组成。

11.根据权利要求7所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：步骤A培养条件为：在30-40℃和0-200rpm的条件下培养1-3天。

12.根据权利要求11所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：步骤A培养条件为：在37℃和50rpm的条件下培养1天。

13.根据权利要求5-12任一项所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：是以所述甘草液体发酵物为活性成分，加入化妆品上可接受的辅料制备而成的化妆品。

14.根据权利要求13所述的甘草液体发酵物在制备具有抗炎、抗过敏、止痒功效的药物或化妆品中的应用，其特征在于：所述化妆品为爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜。