CN104483300A - 一种检测循环肿瘤细胞的装置 - Google Patents

Abstract

一种检测循环肿瘤细胞的装置；包括硅基片以及封接在硅基片上方的聚合物盖板，还包括设置于硅基片下方的磁铁；所述聚合物盖板设有流体出口与入口，位于硅基片的一面设有流体存储腔，流体出口与入口通过流体通道分别与流体存储腔连通；所述硅基片位于聚合物盖板的一面，在对应于流体存储腔的位置，设置硅纳米线。本发明的装置实现循环肿瘤细胞的捕捉和富集，可进行成像和检测。首先硅纳米线阵列和磁场相结合显著地提高了捕捉CTC的效率。其次上转换荧光信号没有背景自发荧光干扰，极大的提高了CTC检测的灵敏度。最后本装置可以通过洗脱分离收集的CTC用于进一步的分子检测。

Description

一种检测循环肿瘤细胞的装置

技术领域

本发明涉及一种检测循环肿瘤细胞的装置。

背景技术

肿瘤的恶性化转移(metastasis)是造成癌症复发和治愈率低下的根本原因。通过血管壁进入外周血的肿瘤细胞通常也被叫做循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）。据估计每1000个CTC中就有1个能够形成转移癌，因此检测CTC具有重要的临床应用价值：能有效地对肿瘤转移进行早期诊断；能对化疗药物的疗效进行快速有效的评估，进而确定最佳的个体化治疗方案；能实现对治愈患者的长期跟踪及肿瘤复发监测等等。

然而由于外周血中CTC的数量极少（通常每毫升全血几百万白细胞和几十亿红细胞中仅存仅含1～10个CTC），利用传统的技术方法很难对其进行直接检测分析。因此随着现代生物医学和纳米科技发展，人们提出了一系列基于微米/纳米材料与结构的分离技术以实现对外周血CTC的富集和检测。其中最具代表性的是基于免疫磁珠富集技术的CellSearchTM系统，是目前唯一通过美国FDA和我国SFDA批准的CTC检测设备。该系统利用上皮细胞粘附因子（EpCAM）功能化的磁珠对7.5ml血液样品中的CTC进行特异性标记和富集，并结合免疫荧光标记技术进行分析检测，具有良好的再现性和较高的敏感性，已被用于转移性乳腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌的临床CTC检测，用来预测无进展生存期和总生存期。但是基于此种方法的CTC检测灵敏度依然有待于提高，据临床结果，利用此法仅有61%的乳腺癌患者中检测出了CTC。因此需要不断的发展高灵敏富集和检测CTC的方法。

现有技术用于分离和识别CTC 费时费力、成本高，而且缺乏准确性和可靠性。因此迫切需要研发新的检测装置以低成本、高灵敏度、高特异性、高效率、高便捷度、高速度进行CTC 检测。

发明内容

为了克服现有的CTC检测方法的不足，本发明提供了一种以硅纳米线阵列为基底的装置来检测循环肿瘤细胞的方法。该方法利用硅纳米线阵列高效捕捉CTC，可以高灵敏度的检测CTC，使得CTC的捕捉效率和检测灵敏度进一步得到了提升。

为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种检测循环肿瘤细胞的装置，包括硅基片以及封接在硅基片上方的聚合物盖板，还包括设置于硅基片下方的磁铁；所述聚合物盖板设有流体出口与入口，接触硅基片的一面设有流体存储腔，流体出口与入口通过流体通道分别与流体存储腔连通；所述硅基片接触聚合物盖板的一面，在对应于流体存储腔的位置，设置硅纳米线区域；所述磁铁的安装位置与硅纳米线区域对应。

硅基片、聚合物盖板材料为现有的。上述流体存储腔的面积为聚合物盖板面积的25%-35%。为了提高检测效率，可以在聚合物盖板位于硅基片的一面设置两个流体存储腔。那么硅基片位于聚合物盖板的一面，设置两个硅纳米线区域，以对应于流体存储腔。硅基片上的硅纳米线区域捕捉富集循环肿瘤细胞，为检测区域。所谓硅纳米线区域对应于流体存储腔是指硅纳米线区域与流体存储腔面积接近，最好一致。

优选的，流体通道包括平滑流道和鱼骨形流道。流入鱼骨形流道中的流体能够很好地混合均匀。

盖板与基片封接结合，盖板上的流体存储腔与通道形成封闭结构，盖板上流体存储腔形成的储液池可以用来存放试剂，通道用于流体的流通，需要在盖板上设置小孔，作为流体的出入口；本发明优选盖板具有1个流体出口与1个流体入口；在对角线位置。

优选的，所述磁铁为1000-2000高斯的磁铁。磁铁设置在硅纳米线区域的对应下方，可以增加细胞富集率。

上述检测循环肿瘤细胞装置的制备：

1、根据设计的流体出入口、流体通道与流体存储腔，绘制出所需图形，制出铬掩膜板；以P型单晶硅片为模板，通过涂胶、曝光、显影、坚膜、腐蚀和去胶、光刻，制备出模板；将聚合物浇注于模板上，加热固化，取下聚合物，为能通入细胞，并将其充分混合，再流入捕捉检测区域的聚合物盖板。

2、将硅片上除与聚合物盖板反应腔室对应区域的其他区域都用胶带掩蔽保护，再与刻蚀液置于密闭容器中，加热，刻蚀出硅纳米线；最后用10%硝酸及去离子水清洗干净；为带有硅纳米线区域的硅基片。

3、将聚合物盖板封接在硅基片上方，流体存储腔与硅纳米线区域对应；用空心管切割法打出流体入口及出口；在硅基片下方设置磁铁，为检测循环肿瘤细胞的装置。

在检测循环肿瘤细胞之前，先用去离子水及1%BSA、0.1% Tween20润洗检测装置，再以1毫升每小时的速度将样品通入，保证细胞被捕捉时的条件都相同。

由于上述技术方案的运用，本发明具有以下优点：

本发明首次基于硅纳米线阵列和磁场相结合制备了检测循环肿瘤细胞的装置，显著地提高了捕捉CTC的效率；上转换荧光信号没有背景自发荧光干扰，极大的提高了CTC检测的灵敏度；本装置可以通过洗脱分离收集到CTC，用于进一步的分子检测。

附图说明

图1为检测循环肿瘤细胞装置的结构示意图；

图2为实施例一聚合物盖板的结构示意图；

图3为实施例一硅基片的结构示意图以及硅纳米线阵列的扫描电镜图；

其中，1、硅基片，2、聚合物盖板，3、磁铁，21、流体入口，22、流体出口，23、流体存储腔，24、流体存储腔，25、流体通道，11、硅纳米线；

图4为实施例一中CTC在磁场作用下被捕捉在硅纳米线阵列中的扫描电镜照片图；

图5是肿瘤细胞BT474细胞在980nm激发下的上转换发光成像照片图；

图6是从硅基片上收集下来的CTC细胞（BT474细胞）经DAPI，anti-CK和anti-CD45标记后的荧光共聚焦显微镜照片图；

图7是模拟血样在通过检测装置时CTC在硅基片上的富集情况对比图；

图8是CTC的捕捉与释放效率的实验结果图；

图9 是已知数目的CTC信号图以及用本发明的装置检测到CTC的信号图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

附图1为检测循环肿瘤细胞装置的结构示意图，由硅基片1以及封接在硅基片上方的聚合物盖板2、设置于硅基片下方的磁铁3组成。两块磁铁分别对应于两个硅纳米线区域。

附图2为聚合物盖板的结构示意图，聚合物盖板设有流体入口21与出口22，设有两个流体存储腔23、24，流体出口与入口通过流体通道25分别与流体存储腔连通。流体通道包括平滑流道和鱼骨形流道。流入鱼骨形流道中的流体能够很好地混合均匀。箭头为流体运行方向。

附图3为硅基片的结构示意图以及硅纳米线阵列的扫描电镜图，在对应于聚合物盖板的流体存储腔的位置，设置硅纳米线11。硅纳米线高度在1-2微米，间距在0.1-1微米之间。

检测循环肿瘤细胞装置的制备：

1、根据设计的流体出入口、流体通道与流体存储腔，用Auto CAD绘制出所需图形，制出铬掩膜板；制备模板的单晶硅片为P型（100）6英寸，所用光刻胶为SU-8反胶，制备过程包括涂胶、曝光、显影、坚膜、腐蚀和去胶等芯片微加工基本过程；光刻处理好的硅片模板，用于浇注配制好的硅橡胶（PDMS），经65℃三小时热烘固化后，取下PDMS部分，作为捕捉循环肿瘤细胞的PDMS部分（2.5厘米×2.5厘米×4毫米）；能通入细胞，并将其充分混合，再流入捕捉检测区域的聚合物盖板。流体存储腔的尺寸为6毫米×6.5毫米×65微米（长×宽×高）。

2、硅基片相对于盖板的腔室区域制备成粗糙硅线而其他区域为光滑表面。此处所用硅片为P型（100）单抛片，电阻率为16-17 Ω·cm。将硅片切成2.5cm×2.5cm大小，并将除与两个流体存储腔（反应腔室）对应区域的其他区域都用胶带掩蔽保护起来。刻蚀出硅线的溶液为HF4.6M、 AgNO30.02M，硅片与刻蚀液置于密闭容器中并放置于52℃烘箱中35分钟，刻蚀结束后用10%硝酸及去离子水清洗干净。为带有硅纳米线区域的硅基片。

3、PDMS盖板封接于刻蚀好的硅基片之前，用空心管切割法打出流体的入口及出口。将洁净的PMDS盖板和硅片基片表面用等离子氧化处理（15秒），再将二者对应复合在一起，使得PDMS实现不可逆封接。再将此复合体置于65℃烘箱中12小时使之封接更牢固。在硅基片下方设置磁铁（1.5厘米×1厘米×0.5厘米），为检测循环肿瘤细胞的装置。

样品检测：

在用磁力及粗糙硅线捕捉之前，先用去离子水及1%BSA、0.1% Tween20润洗，再以1毫升每小时的速度将样品通入装置，保证细胞被捕捉时的条件都相同。

包括以下步骤：将血样中红细胞裂解，分离出白细胞和循环肿瘤细胞；之后加入一定量（200μg/ml）的抗体（herceptin）标记的光磁复合纳米材料，共孵育1h，未结合的纳米粒子通过低速离心（1000转/分钟，5分钟）的方法去除，得到细胞沉淀；处理后的细胞悬液以恒定的流速（1mL/h）加入检测循环肿瘤细胞装置的入口，先经过平滑流道，然后流入鱼骨形流道，流入鱼骨形流道中的流体能够很好地混合均匀，此段流道在鱼骨形混合之后再分别分支成4条分支（400微米宽，40微米高），以便流体同时匀速进入两个腔室中。

在装置底部恒定的磁场（1000-2000高斯）以及硅纳米线阵列的作用下，结合上复合纳米材料的CTC被纳米线阵列基底牢牢捕捉；捕捉在硅纳米线阵列基底的CTC可以洗脱下来用于进一步的分析。利用小动物成像系统（导入980nm光源和放置900nm短通滤光片）对捕获的CTC进行原位上转换荧光成像检测，成像条件为：980nm激发，光功率密度为10 W/cm²，检测波长为540 nm和650 nm双波长成像，曝光时间为30秒，通过荧光强度计算出CTC的捕获效率。

利用高温热分解方法制备NaYF₄:Yb,Tm上转换纳米粒子，进行聚丙烯酸(PAA 分子质量=1800)表面修饰改性，使表面带有-COOH基团；利用溶剂热合成方法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，并进一步对制备的油相Fe₃O₄纳米粒子进行多巴胺表面修饰改性，使表面带有-NH₂基团；通过共价结合的方式对NaYF4:Yb,Tm/NaYF4和Fe₃O₄这两种纳米粒子进行装配，获得稳定的磁光上转换复合纳米粒子；利用共价结合的方式将抗体分子(Herceptin)修饰到磁光上转换复合纳米粒子表面，为抗体标记的光磁复合纳米材料，以实现其对肿瘤细胞的特异性识别和标记。

附图4是CTC在磁场作用下被捕捉在硅纳米线阵列中的扫描电镜照片，显示了细胞被硅纳米线阵列基底牢牢的捕捉。

附图5是肿瘤细胞BT474细胞（Her2 高表达）在经过herceptin功能化的磁光上转换纳米粒子标记后，经外加强磁场的微流控芯片捕获富集后CTC在980nm激发下的上转换发光成像照片。可以看出随着细胞数目增加，BT474荧光信号强度逐渐增加，说明本装置对BT474具有很好的特异性标记和富集效果。

附图6是从硅基片上收集下来的CTC细胞（BT474细胞）经DAPI，anti-CK和anti-CD45标记后的荧光共聚焦显微镜照片，可以清楚的将CTC和白细胞区分开来。

实施例二

采用实施例一的装置与检测方法，流体流速分别为0.2 mL/h 、0.5 mL/h 、2 mL/h 、4 mL/h。

对比例一

将实施例一中装置上的硅基片中的硅纳米线去除，即硅基片为全部平滑表面；得到基片平滑的循环肿瘤细胞检测装置。采用实施例一的方法进行检测。

对比例二

将实施例一中装置上的磁铁去除，采用实施例一的方法进行检测。

对比例三

将对比例一中装置上的磁铁去除，采用实施例一的方法进行检测。

附图7是模拟血样在通过检测装置时CTC在硅基片上的富集情况对比。可以清楚看出CTC在硅纳米线中具有更高的富集效果，并且在外加磁场时CTC 的富集效果可以得到更近一步提高；远超过光滑基片的。由此证明，本发明的装置能够有效提高CTC在硅基片中的富集效率。

附图8是CTC的捕捉与释放效率的实验结果。可以清楚看出CTC在硅纳米线中具有更高的富集效果，并且在外加磁场时CTC 的富集效果可以得到更近一步提高；并且可以看出在1ml/h的流速下具有最高的捕获效率。表明了在不同的细胞数目下，本发明的装置均有良好的捕捉和释放效率。

实施例三

在血样中放置了已知不同数目的CTC，根据实施例一的方法检测CTC的信号。附图9 是在血样中放置了不同数目已知的CTC信号图以及用本发明的装置去检测CTC的信号图。可以看到本发明的装置捕捉到的信号和已知数目的细胞的信号有明显的相吻合的情况，证明本发明的装置有非常高的捕捉和检测效率。

实施例四

在实施例一的聚合盖板上设置两个流体入口与两个流体出口，入口和出口位于对角线位置，其余不变。测试装置对CTC细胞（BT474细胞）的富集效率为85%以上。

实施例五

利用高温热分解方法制备NaYF₄:Yb,Tm上转换纳米粒子，进行聚丙烯酸(PAA 分子质量=1800)表面修饰改性，使表面带有-COOH基团；利用共价结合的方式将抗体分子(Herceptin)修饰到磁光上转换复合纳米粒子表面，为抗体标记的纳米材料，以实现其对肿瘤细胞的特异性识别和标记。

采用实施例一的装置，测试装置对CTC细胞（BT474细胞）的富集效率为75%以上。

Claims (7)

1.一种检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述检测循环肿瘤细胞的装置包括硅基片以及封接在硅基片上方的聚合物盖板，还包括设置于硅基片下方的磁铁；所述聚合物盖板设有流体出口与入口，接触硅基片的一面设有流体存储腔，流体出口与入口通过流体通道分别与流体存储腔连通；所述硅基片接触聚合物盖板的一面，在对应于流体存储腔的位置，设置硅纳米线区域；所述磁铁的安装位置与硅纳米线区域对应。

2.根据权利1所述检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述流体存储腔的面积为聚合物盖板面积的25%-35%。

3.根据权利1所述检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述聚合物盖板接触硅基片的一面设置两个流体存储腔。

4.根据权利1所述检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述流体通道包括平滑流道和鱼骨形流道。

5.根据权利1所述检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述聚合物盖板具有一个流体出口以及一个流体入口。

6.根据权利1所述检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述磁铁为1000-2000高斯的磁铁。

7.根据权利1所述检测循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述硅纳米线区域内，硅纳米线的高度为1-2微米；硅纳米线之间的间距为0.1-1微米。