CN104479062A

CN104479062A - 一种亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104479062A
Application number: CN201410747595.7A
Authority: CN
Inventors: 李树白; 马迪; 张启蒙; 薛叙明; 陆敏; 姚晨; 赵昊昱; 刘英莉; 聂华丽
Original assignee: Changzhou Vocational Institute of Engineering
Current assignee: Changzhou Vocational Institute of Engineering
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-04-01

Abstract

本发明公开了一种亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法及其应用。本发明采用共聚-螯合金属离子的方法，将异丙基丙烯酰胺单体(AAm)和丙烯酸共聚合成了二元线型聚合物(PNIPAAm-co-AAm)，然后将PNIPAAm-co-AAm键合上铜离子，制得同时具有温度敏感性和亲和特性的聚合物(PNIPAAm-co-AAm-Cu)。用红外光谱、紫外-可见光谱对其进行表征；结果表明本发明制备的PNIPAAm-co-AAm-Cu具有很好的再生效果，这意味着PNIPAAm-co-AAm-Cu在多相体系的蛋白质分离中具有广阔的应用价值。

Description

一种亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及高分子聚合物领域，尤其涉及一种亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法及其应用。

背景技术

聚(N-异丙基丙烯酰胺)简称PNIPAAm，分子结构式如下：

由于其大分子侧链上同时具有亲水性的酰胺基基团(-CONH-)和疏水性的异丙基基团[-CH(CH₃)₂],使线型PNIPAAm的水溶液呈现出温度敏感的特性。人们对PNIPAAm的研究始于1956年，Sprecht等人于1967年首次观察到了线型的PNIPAAm水溶液具有临界相转变温度的温敏现象。八十年代初，日本学者Katayama等人合成了聚甲基-丙烯酰胺类高聚物，此后不少新的化合物也陆续被合成出来。1984年Hirokawa，Tanaka等人首次报道了非离子型的PNIPAAm在二甲基亚砜的水溶液中有体积相变发生。从此PNIPAAm以及N-烷基取代丙烯酰胺成为国际上高分子领域一个新的研究热点。此后人们发现了一系列可使此类高聚物发生相变的外界因素，例如溶液的pH值、离子强度、电场、磁场、光、化学物质等，预示了它在化学转换器、记忆元件开关、传感器、药物的控制释放、分子分离等方面都有潜在的应用价值。

亲和沉淀是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，该方法被认为是分离纯化酶及其它蛋白质的有效手段。其优点是可以较为经济的多次回收利用配基，可实现大规模、快速、特异性的分离纯化酶和其它目标蛋白质分子。它是利用了诸如金属离子、活性染料分子、核苷酸、抗体等双功能配基，这些配基一方面直接或通过“间隔壁”与载体分子连接，另一方面能与目标蛋白质的活性部位以非共价键的方式结合而发生沉淀，经离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂质。沉淀经适当的清洗后加入洗脱剂即可回收纯化的目标产物。

发明内容

本发明提供了一种亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法及其应用。

本发明采用二元线型聚合物PNIPAAm-co-AAm作为载体骨架，螯合金属铜离子作为亲和配基，得到一种新型的亲和沉淀载体PNIPAAm-co-AAm-Cu。在其完全溶解的条件下，与牛血清白蛋白(BSA)特异性结合。通过改变溶液的物理场(如pH值、离子强度和温度等条件)，使水溶性的聚合物亲和载体与目标分子共同沉淀。

本发明采用如下技术方案：

本发明的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法的具体步骤如下：(1)将N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶解在去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:50-150g/μl，N-异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:20-30g/ml，然后真空脱气10min，再加入N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为40-80:1μl/g，过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.1-1:1ml/g，通氮气鼓泡15min后密封，于50℃恒温水浴中反应2h；

(2)反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入去离子水将沉淀溶解，待沉淀完全溶解后，置于50℃恒温水浴中30min，离心收集聚合物沉淀，重复上述步骤3次，以去除未反应的单体，得到PNIPAAm-co-AAm聚合物，在真空干燥箱中将所得的聚合物在50℃干燥；

(3)然后将聚合物PNIPAAm-co-AAm加入到2.0g/L硫酸铜溶液中，PNIPAAm-co-AAm与硫酸铜溶液的重量体积比为0.1-0.5:2g/ml，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验1h，待吸附平衡后置于50℃的恒温水浴中，保温10min至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000rpm离心5min使之完全沉淀得到亲和温敏金属螯合聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu。

步骤(1)中，优选N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:100g/μl。

步骤(1)中，优选N-异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:25g/ml。

步骤(1)中，优选N,N,N’,N’-四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为60:1μl/g。

步骤(1)中，优选过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.6:1ml/g，过硫酸铵溶液的浓度为10％w/v。

步骤(3)中，优选PNIPAAm-co-AAm与硫酸铜溶液的重量体积比为0.2:2g/ml。

本发明的方法制备的亲和温敏金属螯合聚合物可以用在亲和沉淀中。

本发明的积极效果如下：

本发明制备的金属螯合温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu的再生效果非常好，在7次吸附、解吸附循环中，对BSA的吸附量和洗脱量均能保持基本不变。金属螯合温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu不仅解决了复杂性质的多相体系的分离难题，而且也可以多次循环利用，节省了很多资源，是一种环保、高效、性能优异的亲和分离介质。

附图说明

图1是本发明实施例3制备的聚合物PNIPAAm-co-AAm的红外特征吸收光谱图；

A.NIPAAm单体；B.丙烯酸单体；C.聚合物PNIPAAm-co-AAm的红外特征吸收光谱图。

图2是本发明实施例3制备的聚合物PNIPAAm-co-AAm的吸收光值A曲线。

图3是本发明实施例3制备的PNIPAAm-co-AAm-Cu在不同因素下的吸附曲线；

(a)pH，(b)温度，(c)NaCl，(d)BSA初始溶度。

图4是本发明实施例3制备的聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu的吸附和解吸附循环图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径得到。

实施例1

本发明的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法的具体步骤如下：

(1)将N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶解在去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:50g/μl，N-异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:20g/ml，然后真空脱气10min，再加入N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为40:1μl/g，过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.1:1ml/g，通氮气鼓泡15min后密封，于50℃恒温水浴中反应2h；

(3)然后将聚合物PNIPAAm-co-AAm加入到2.0g/L硫酸铜溶液中，PNIPAAm-co-AAm与硫酸铜溶液的重量体积比为0.1:2g/ml，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验1h，待吸附平衡后置于50℃的恒温水浴中，保温10min至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000rpm离心5min使之完全沉淀得到亲和温敏金属螯合聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu。

实施例2

本发明的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法的具体步骤如下：(1)将N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶解在去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:150g/μl，N-异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:30g/ml，然后真空脱气10min，再加入N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为80:1μl/g，过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为1:1ml/g，通氮气鼓泡15min后密封，于50℃恒温水浴中反应2h；

(3)然后将聚合物PNIPAAm-co-AAm加入到2.0g/L硫酸铜溶液中，PNIPAAm-co-AAm与硫酸铜溶液的重量体积比为0.5:2g/ml，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验1h，待吸附平衡后置于50℃的恒温水浴中，保温10min至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000rpm离心5min使之完全沉淀得到亲和温敏金属螯合聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu。

实施例3

本发明的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法的具体步骤如下：(1)将1.0g N-异丙基丙烯酰胺和100μl丙烯酸溶解在25ml去离子水中，置于100ml具塞磨口圆底烧瓶中，真空脱气10min，加入N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)(60μl)和0.6ml过硫酸铵溶液(10％，w/v)，通氮气鼓泡15min后密封，之后50℃恒温水浴反应2h。

(2)反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入50ml去离子水将沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50℃恒温水浴中30min，离心收集聚合物沉淀。重复上述步骤3次，以去除未反应的单体，在真空干燥箱中将所得的聚合物PNIPAAm-co-AAm 50℃干燥。

(3)然后将0.20g温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm加入到2ml 2.0g/L硫酸铜溶液中，调节pH至4.5，在室温下进行铜离子的吸附实验1h，待吸附平衡后置于50℃的恒温水浴中，保温10min至金属螯合温敏聚合物受热凝集沉淀，8000rpm离心5min使之完全沉淀得到PNIPAAm-co-AAm-Cu。

将实施例3制备的亲和温敏金属螯合聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu进行如下表征和性能测试：

1、红外表征：

采用KBr压片法，在傅里叶红外光谱仪上测定聚合物单体NIPAAm和AAm以及温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm在500～4000cm^-1的红外吸收。

如图1所示，聚合物PNIPAAm-co-AAm具有以下的特征谱带：3434cm^-1为仲酰胺(-NH)伸缩振动峰，1649cm^-1和1547cm^-1为酰胺I(C＝O)及酰胺II(NH)，1388cm^-1和1368cm^-1为异丙基上双甲基的对称变形振动耦合分裂而成的双峰，1172cm^-1和1130cm^-1为异丙基的骨架振动峰。3063cm^-1～2661cm^-1为羧酸中(-OH)伸缩振动峰，1724cm^-1为羧酸中羰基(-C＝O)的伸缩振动峰，是-COOH的特征峰。

经聚合物和两种单体的红外特征吸收光谱比较，发现在1622cm^-1的C＝C以及1434cm^-1的CH₂＝CH-特征吸收峰没有出现，而在聚合物PNIPAAm-co-AAm的图谱中出现了1724cm^-1羧酸中-COOH的特征峰，表明单体已经发生聚合，且共聚物中含有-COOH的结构，即采用自由基水溶液聚合法已经得到本发明的共聚物。

2、紫外-可见光谱法测定最低临界温度(LCST)：

将合成的聚合物配制成5mg/ml的水溶液，4℃下将聚合物完全溶解形成无色透明的均匀体系。将各溶液置入石英比色皿中，在Lambda35紫外/可见光光度计上测定不同温度下溶液的透光率。测定波长选定为500nm，样品池、参比池的升温速率为2℃/min，升温范围选定为0～70℃。

温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm由于其大分子侧链上同时具有亲水性的酰胺基基团(-CONH-)、羧酸基团(-COOH)和疏水性的异丙基基团[-CH(CH₃)₂],使PNIPAAm-co-AAm的水溶液呈现出温度敏感的特性。在常温下，聚合物PNIPAAm-co-AAm溶于水中形成均匀的溶液，当温度升高至30℃-35℃之间的某一温度时(因合成方法、合成条件等而异)，溶液发生相分离。由图2可知，在测定波长选定为500nm，样品池、参比池的升温速率为2℃/min，升温范围选定为0～70℃的条件下，温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm溶液的LCST为35.0℃。

3、螯合金属离子的含量测定：

将制得的PNIPAAm-co-AAm-Cu用电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测聚合物螯合铜离子的量。

通过电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测聚合物螯合铜离子的量，我们发现，温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm螯合铜离子的量45.3mg/g(聚合物干重)，而没有随机共聚AAm单体的均聚物PNIPAAm螯合铜离子的量仅为9.48mg/g(聚合物干重)。由此可以看出温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm螯合铜离子的能力明显强于聚合物PNIPAAm。在相同的吸附条件下，聚合物PNIPAAm-co-AAm对铜离子结合能力是聚合物PNIPAAm的5倍左右。这说明聚合物PNIPAAm与铜离子的结合方式主要是通过物理吸附，而且吸附能力很低。

4、亲和温敏金属螯合聚合物对BSA的静态吸附：

金属螯合亲和分离技术是基于蛋白质与固定金属离子之间的亲和作用进行分离的新型分离纯化技术。本实验采用牛血清白蛋白(BSA)为模型分子，探讨pH、温度、离子溶度和BSA的初始浓度对亲和温敏聚合物吸附量的影响。

选取pH 4.0-10.0作为研究BSA在金属螯合温敏聚合物上的最佳吸附pH值的范围，由图3(a)可见，pH值对金属螯合温敏聚合物吸附BSA的影响，其最大吸附量出现在pH 6.0-7.0。该结果表明缓冲液的pH值对BSA的吸附影响很大。在低pH时，升高pH会使组氨酸去质子化，从而加强其与金属离子的专一性结合，但当pH过高时，BSA的羧基解离形成阴离子以及构象发生转变，导致吸附量降低。另外pH过高会使金属离子沉淀，而影响金属离子沉淀的原因包括金属离子的Ksp和膜上吸附金属离子的量，根据这两点，金属离子的沉淀泄露发生在不同的pH，所以最终BSA的最佳吸附pH值确定为6.0。

从图3(b)的结果可知，在环境温度较低的情况下(4℃左右)，随着温度的升高，BSA的吸附量不断增加。原因是随着温度的升高，BSA分子的运动速度加快，蛋白质分子能量增大，与聚合物的有效碰撞增多，而且此时的聚合物大分子处于溶解状态，分子链是舒展的，亲水性的功能基团充分暴露出来，有利于金属离子亲和配基与蛋白质分子之间的相互作用。而随着环境温度的不断升高，接近聚合物的LCST时，聚合物大分子之间及分子内部的疏水作用加强，使得聚合物在溶液中出现了部分凝聚现象，这就在金属离子亲和配基与蛋白质分子之间产生了空间位阻；当环境温度上升至聚合物的LCST时，聚合物大分子之间及分子内部的疏水作用使得聚合物凝聚沉淀，亲水部分的功能基团被包含在大分子凝聚体的内部，不能与溶液中的蛋白质分子相互作用，聚合物对BSA的吸附量减少。另一方面，环境温度的升高，会影响到目标产物—蛋白质等生物大分子的活性。因此，介于这两方面的影响，对BSA的最优吸附温度为20℃。

由图3(c)实验结果表明，随着离子强度的(即NaCl浓度从0到0.60mol/L)增大，BSA在金属螯合亲和温敏聚合物上的吸附量显著减少。这种吸附量随着离子强度的增加而减少的现象可以解释为：随着盐浓度的增加，裸露的组氨酸残基与金属离子之间的亲和作用力以及带电蛋白质分子与带正电的金属离子之间的专一性静电结合作用力不会受影响；但是由于盐离子的存在使蛋白质的表面电荷被屏蔽，导致了蛋白质分子与金属亲和体系之间的静电作用降低了，同时盐浓度的增加还会改变蛋白质之间的疏水作用，这都会造成BSA的吸附量减少。

从图3(d)中的吸附曲线可以看出，BSA的吸附量随着溶液中的BSA的初始浓度的变化而变化的趋势。在BSA初始浓度较低时，聚合物对BSA的吸附量随着BSA初始浓度的上升而增加，由于聚合物大分子链上的结合位点是有限的，所以吸附量增加的速度却随着BSA初始浓度的增大而减慢。当BSA的初始浓度达到1.0mg/ml时，BSA分子与聚合物上的金属离子结合位点的结合达到了饱和，此时吸附量不再随着BSA初始浓度的增加而增加，达到了吸附饱和状态。由图3(d)可以看出，金属螯合温敏聚合物对BSA的最大吸附量为34.8mg/g。

4、亲和温敏金属螯合聚合物的再生性能研究

为了确定制备亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu的可以被多次重复使用，在同样的条件下进行7次吸附-解吸附循环，确定亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu的再生和循环使用能力。

图4为亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu的吸附和解吸附循环图。从图4可以明显看出，在亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu的7次吸附-解吸附的循环中，对BSA的吸附量和每次的洗脱量均能保持基本不变，说明亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu大分子链上的活性位点均是可逆的，也同时表明亲和温敏聚合物PNIPAAm-co-AAm-Cu作为亲和分离介质的稳定性和可循环使用性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1)将N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶解在去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:50-150g/μl，N-异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:20-30g/ml，然后真空脱气10min，再加入N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为40-80:1μl/g，过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.1-1:1ml/g，通氮气鼓泡15min后密封，于50℃恒温水浴中反应2h；

2.如权利要求1所述的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的重量体积比为1:100g/μl。

3.如权利要求1所述的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，N-异丙基丙烯酰胺和去离子水的重量体积比为1:25g/ml。

4.如权利要求1所述的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为60:1μl/g。

5.如权利要求1所述的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，过硫酸铵溶液与N-异丙基丙烯酰胺的体积重量比为0.6:1ml/g，过硫酸铵溶液的浓度为10％w/v。

6.如权利要求1所述的亲和温敏金属螯合聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，PNIPAAm-co-AAm与硫酸铜溶液的重量体积比为0.2:2g/ml。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法制备的亲和温敏金属螯合聚合物在亲和沉淀中的应用。