CN104478586A - 一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂及制备方法 - Google Patents

一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，原料按重量份计由如下成分组成：亚硒酸钠8-15份，动物血水解液50-65份，复合微量元素5-15份，磷酸二氢钾8-20份，尿素10-25份，蛋白胨8-20份，酵母粉4-10份，NaCl 8-20份，NaOH 8-15份，NaNO34-10份，NaCl 10-25份，NH4Cl 4-10份，K2HPO48-20份，牛肉膏4-10份，葡萄糖10-25份，淀粉10-25份，碳酸钙8-20份，氨基酸10-25份，硝酸钾2-6份，硫酸亚铁2-6份，硫酸镁10-25份，柠檬酸三钠25-40份，生化酶10-25份，混合菌液800-848份；本发明的富硒微生物制剂的制备方法，发酵时间短，通过增加发酵过程中微生物的增殖速度，菌剂的保存期可以延长至2年。

Description

一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂及制备方法
技术领域
本发明涉及一种富硒营养型微生物肥料，具体是一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂及制备方法，属于生物肥料技术领域。
背景技术
我国是一个缺硒大国。普查证明，我国70％以上的地区土壤中严重缺硒，我国95％以上的粮食和畜禽肉类中硒含量低于50μg/kg，属于贫硒大国。我国人均每天硒摄入量仅有39μg左右，不足成年人胜利需要最小量50μg/天的80％，距离健康需要量100～200μg/天相差更大；距离安全上线800μg更远。在我国，除少数地区外，90％的人口需要采用生物工程技术补充硒。不仅人要补充硒，畜禽也要补充硒。
我国是农业大国，化肥在我国农业生产中起到了重要的作用。但是，随着单位面积的化肥用量越来越高，出现了严重的土地“越喂越瘦”的情景。与之相伴的不仅仅是土壤的退化、农药施用量的增加与农产品品质的下降，还有近40％的地下水因为硝酸盐含量太高不能直接饮用。因此，开发环境友好型肥料是我国的发展战略。富硒微生物菌肥因其具有土壤性能改良、农作物增产、农产品品质改善、肥力持久及环境友好等优点，而受到广泛关注。微生物肥料迄今已有一百多年的历史，己在亚洲、美洲、欧洲和非洲等世界上60多个国家推广应用。近年来美、英、法、日等发达国家，加大了微生物菌肥的研发投入，得到了种类更加丰富，性能更加优良的功能化微生物菌肥，替代了大约40％的化肥使用量。我国也高度重视绿色肥料的开发与应用，微生物肥料产业取得了一定发展，生产企业超过800家，年产量近千万吨，年产值过百亿元，但是与同期化肥的产量和用量相比，仅占不足5％。但是随着人们对生活品质要求的提高，开发绿色无污染食品的呼吁越来越高，这种社会需求将导致微生物肥料的市场需求量越来越大。
硒为人体所必需的营养微量元素之一。人或动物缺少或摄入过量的硒，则会引起某些疾病，如缺硒地区的克山病、大骨节病、心肌病、癌症等发病率很高。研究和实践证明，硒元素对人体健康发挥着内在的关键作用，它是谷胱甘肽过氧化酶、硫氧还蛋白还原酶和减碘酶等内源性抗氧化剂的关键成分——激活剂。它对于调节人体免疫系统、抵御疾病、延缓衰老、预防和辅助治疗癌症等多种疾病发挥着重要作用，特别是在清除脂质自由基方面是其他抗氧化剂不可比拟和替代的。
硒是近几十年来才被发现的对人体健康极为重要的、不可缺少的、具有全局作用的内源性强抗氧化物质和自由基清除剂。联合国世界卫生组织WHO宣布：硒是人生命中必须的微量元素，硒被国内外医药界尊称为“生命的火种”，享有“长寿元素”、“抗癌之王”、“心脏守护神”、“天然解毒剂”等美誉。硒已被科技界公认为“有助于人类免除各种病痛的折磨，如不良情绪、胰脏疾病、糖尿病、生殖系统疾病、病毒感染和癌症等。”有报道，血液中含硒量最低的人死于心脏病的概率是含量高者的3倍。硒能使人体的免疫系统重新恢复活力。硒可排出体内重金属毒素,硒在体内是以硒氨酸的形式组成硒蛋白，硒蛋白遇到铅、汞、镉、砣等有害金属灰迅速结合变成无害化合物而排出体外。硒是体内碘的调节剂,它在甲状腺激素代谢过程中对碘起着非常重要的调节作用。与硒结合的还有一种非常重要的抗氧化酶——硫氧还蛋白还原酶，具有很多生物学功能，影响着核酸的合成。硒预防不孕不育，特别是预防男性死精、精子减少等症状，不少资料显示，今天不孕不育症与缺硒有直接关系。
人与动物摄入硒的途经主要靠含硒的食物来保证，因此，富硒壳聚糖微生物制剂的制备以及富硒产品的种植是极为重要的。
可以被人体所吸收的硒分为元素硒、无机硒和有机硒三种。硒的特点是生物活性和毒性之间范围极端狭窄，为此，各国科学家研究了许多硒化合物，试图寻找活性高、毒性低的硒形式。随着纳米技术的成熟，科学家采用先进的纳米技术，将零价硒(元素硒的一种)制成纳米颗粒硒--纳米硒。纳米硒与一般零价硒相比，发生了生物性质的突变。具体以下特点：1)具有抗氧化性；2)由于高活性的特性，因而对人体的危害性大大减少，可以补充低剂量硒相当于以前高剂量的营养含量，从而避免了给人体带来的副作用。所以纳米硒使硒的物质结构由原来分子态的化合物变成了纳米态的零价物质，不仅使人体充分吸收硒、降低了其毒性，而且还具备较好的生物活性。
中国专利文献CN 102348516A(申请号：201110205067.5)公开一种植物叶面吸收的高效浓缩富硒剂，其中含有高浓度硒溶液，氨基酸营养素，促吸收剂及至少为脲、磷酸盐、硫酸盐、葡萄糖、焦糖之一或几种组合的辅助营养物质；其中所述高浓度硒溶液为含硒化合物的水溶液,以硒元素质量百分含量计浓度为0.1％-30％M/V。应用实施本发明高效浓缩富硒剂,较之于现有普通富硒溶液在同等环境下叶面喷施的生产富硒农作物产品效率提高了50％；成本降低了30％；且产量增产3-8％；可使农作物产品含硒量提高到10-400μg/kg。但该富硒制剂中硒以无机硒盐形式存在，无机硒盐生物活性低，不具有抗氧化性，人体对无机硒盐吸收率很小，食用过量对人体有一定毒性，增加了对人体的危害性。
血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。其分为胎牛血清、干细胞培养胎牛血清、特殊用途胎牛血清、胎牛血清替代物、小牛血清、新生牛血清、加强型小牛血清、补铁小牛血清、成牛血清、供体马血清、兔血清、鸡血清、猪血清、马血清、其他动物血清、合成血清替代品。它主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分包括白蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白,甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶等。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。血清中含多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)、多种金属离子、激素、促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等、各种生长因子、转移蛋白、不明成分。
血清可以提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂及制备方法，本发明的富硒微生物制剂中含有单质硒，且单质硒为纳米级，无毒性，对人体没有危害，对有害重金属有拮抗作用，对于蔬菜中的硝酸盐有降解作用，可与其他肥料混用，稳定性好，加水施用于植物叶面，达到谷物、蔬菜、果实的富硒目的。而且其含有大量微生物以其生命活动及其代谢产物导致农作物得到特定肥料效应、生长调节效应、防病虫效应和土壤生物修复等效应的农业产品。这种富硒营养型微生物肥料，它能改良土壤，增加土壤微生物的数量，提高果蔬植物的抗病、抗逆能力，提高肥料利用率等优点。
本发明的技术方案如下：
一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，原料按重量份计由如下成分组成：
亚硒酸钠8-15份，动物血水解液50-65份，复合微量元素5-15份，磷酸二氢钾8-20份，尿素10-25份，蛋白胨8-20份，酵母粉4-10份，NaCl 8-20份，NaOH 8-15份，NaNO3 4-10份，NaCl 10-25份，NH4Cl 4-10份，K2HPO4 8-20份，牛肉膏4-10份，葡萄糖10-25份，淀粉10-25份，碳酸钙8-20份，氨基酸10-25份，硝酸钾2-6份，硫酸亚铁2-6份，硫酸镁10-25份，柠檬酸三钠25-40份，生化酶10-25份，混合菌液800-848份；
所述的动物血水解液是以未凝固的动物血为原料，经升温至75-80℃，加入水解酶水解8-15h；水解后升温至120℃，保温1-2h进行灭酶；灭酶后，降温至常温后制得，所述的混合菌液为解淀粉芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌液、苏云金芽孢杆菌菌液和胶质芽孢杆菌菌液的混合液。
本发明优选的，一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，原料按重量份计由如下成分组成：
亚硒酸钠12-13份，动物血水解液60-62份，复合微量元素8-10份，磷酸二氢钾10-15份，尿素15-18份，蛋白胨10-15份，酵母粉6-8份，NaCl 10-15份，NaOH 10-12份，NaNO36-8份，NaCl 15-20份，NH4Cl 4-10份，K2HPO4 12-18份，牛肉膏6-8份，葡萄糖15-20份，淀粉15-20份，碳酸钙12-18份，氨基酸16-20份，硝酸钾3-5份，硫酸亚铁3-5份，硫酸镁13-22份，柠檬酸三钠30-35份，生化酶18-25份，混合菌液820-830份。
本发明优选的，所述混合菌液是通过以下方法制备得到：
(1)将解淀粉芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，制得解淀粉芽孢杆菌菌液；发酵液原料组成：8-10％大豆粉，4-7％糖蜜，3-5％淀粉，余量为水，按重量百分比计；
(2)将枯草芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得枯草芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：大豆粉4-7％，葡萄糖4-8％，磷酸氢二钾1-2％，酵母膏1-2％，硫酸镁0.02-0.05％，碳酸钙0.3-0.6％，余量为水，按重量百分比计；
(3)将地衣芽孢杆菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得地衣芽孢杆菌液；所述发酵液原料组成：糖蜜12-20％，玉米淀粉8-12％，葡萄糖5-8％，余量为水，按重量百分比计；
(4)将苏云金芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得苏云金芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：糖蜜12-18％，氢氧化钾3-5％，磷酸2-4％，尿素1-3％，牛肉膏0.5-2％，硫酸镁0.1-0.2％，硫酸锌0.1-0.2％，余量为水，按重量百分比计；
(5)将胶质芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得胶质芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：玉米淀粉8-12％，牛肉膏1-2％，葡萄糖1-3％，蛋白胨0.5-1％，碳酸钙0.5-1％，磷酸氢二钾0.5-1％，硫酸镁0.02-0.05％，余量为水，按重量百分比计；
(6)按体积比将解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液按(1-6)：(1-3)：(1-2)：(1-2)：(1-2)的比例混合混匀，即得混合菌液。
进一步优选的，解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液的体积比为：(2-4)：(2-3)：2：2：2。
进一步优选的，步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中使用的发酵液均于110℃～120℃下灭菌2～3小时，冷却后再进行接种。
本发明优选的，步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中有氧发酵时间45-48h。
本发明优选的，所述的解淀粉芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～150亿个/ml，枯草芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～160亿个/ml，地衣芽孢杆菌液中活菌含量为120～150亿个/ml，苏云金芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～150亿个/ml，胶质芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～150亿个/ml。
本发明优选的，所述的水解酶为动物蛋白水解酶，动物蛋白水解酶的用量为1000kg动物血添加3-4kg的动物蛋白水解酶，动物蛋白水解酶南宁庞博生物工程有限公司有售。
本发明优选的，所述复合微量元素，是由等质量的下述物质混合而成：硫酸锰，硫酸亚铁，硼酸，硫酸铜，硫酸锌，钼酸铵。
本发明优选的，所述的生化酶为磷酸葡萄糖激酶PEK、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、谷氨酸脱氢酶、氨甲酰磷酸合酶Ⅰ或氨甲酰磷酸合酶Ⅱ。
本发明还提供一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的制备方法，包括步骤如下：
将原料亚硒酸钠、动物血水解液、复合微量元素、磷酸二氢钾、尿素、蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、NaNO3、NaCl、NH4Cl、K2HPO4、牛肉膏、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、氨基酸、硝酸钾、硫酸亚铁、硫酸镁、柠檬酸三钠、生化酶、混合菌液混合均匀后，调节pH至7～7.5，得混合物料，将混合物料于30～35℃在无氧条件下经发酵24-48h，当混合物料的颜色从淡黄色变到红色，即制得富硒壳聚糖营养型微生物肥料，所述的富硒壳聚糖营养型微生物肥料制剂含单质硒0.3～0.4g/L，所述硒为纳米级，平均粒径为60～150nm，活性菌总数≧150亿个/mL。
本发明优选的，混合物料在发酵过程中通入惰性气体维持无氧环境，所述的惰性气体为氮气或氩气。
本发明制得的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂呈液体状态，溶液呈红色表明硒纳米粒子的存在。
上述采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的应用，用于缺硒、贫硒地区的农作物种植施肥用，包括根部施肥和叶面施肥，根部施肥时将富硒壳聚糖营养型微生物肥料直接施用，叶面施肥时将富硒壳聚糖营养型微生物肥料稀释2～5倍施用。
本发明优选的，所述的农作物为葡萄，苹果，西葫芦，辣椒，黄瓜，白菜油菜，西红柿，茄子。
进一步优选的，所述的根部施肥富硒制剂直接均匀地布洒在农作物根部周围土壤中，再覆土盖严，或者以农作物根部为中心等分若干条沟或穴坑，将稀释后的富硒制剂均匀布洒在条沟或穴坑内，再覆土盖严，施肥量：每棵施5～10斤稀释后的富硒制剂。
本发明使用的解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，胶质芽孢杆菌均为现有技术中已有的常规菌种，可常规市场购买得到，本发明所用菌种均购自中国农业科学院农业微生物菌种保藏管理中心(公开出售)，其中，解淀粉芽孢杆菌的编号为ACCC10167，枯草芽孢杆菌的编号ACCC04177，地衣芽孢杆菌的编号为ACCC02936，苏云金芽孢杆菌的编号为ACCC11075，胶质芽孢杆菌的编号为ACCC10013。
本发明所涉及的发酵液中的组分均为现有技术中已有的常规组分，均按照常规方法制备得到，比如，大豆粉，玉米淀粉，糖蜜，酵母膏，牛肉膏等。
本发明所使用的亚硒酸钠购自济南庄盟生物技术有限公司。
本发明的动物血水解液中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成(称为必需氨基酸)，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等)；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10％～20％的血清，动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。针对长期以来微生物菌剂发酵液中菌体数量难以提高的问题，根据微生物的生理特性及生长特征，在发酵过程中，通过尝试采用动物血清类等不同来源的氨基酸溶液，利用动物血清类氨基酸改善培养基营养组份结构，实现了微生物的高效增殖及活性保持，有效提高了活菌数量及存活周期，显著提高了微生物菌剂的增殖率，微生物菌剂的含菌量达到了200亿/mL，并取得了经济作物增产10-15％的优异效果。通过增加发酵过程中微生物的增殖速度，菌剂的保存期可以延长至2年。
有益效果
本发明的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂优点如下：
1、本发明的富硒微生物制剂的制备方法，发酵时间短，仅需24-48h，大大提高了富硒微生物制剂的使用效率，节约了成本。
2、本发明的动物血水解液中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成(称为必需氨基酸)，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等)；
3、本发明的动物血水解液中还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10％～20％的血清，动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。
4、针对长期以来微生物菌剂发酵液中菌体数量难以提高的问题，根据微生物的生理特性及生长特征，在发酵过程中，通过尝试采用动物血清类等不同来源的氨基酸溶液，利用动物血清类氨基酸改善培养基营养组份结构，实现了微生物的高效增殖及活性保持，有效提高了活菌数量及存活周期，显著提高了微生物菌剂的增殖率，微生物菌剂的含菌量达到了200亿/mL，并取得了经济作物增产10-15％的优异效果。通过增加发酵过程中微生物的增殖速度，菌剂的保存期可以延长至2年。
5，本富硒微生物制剂使用的枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，胶冻样芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌胶质芽孢杆菌菌种，不仅可以提高富硒微生物制剂的发酵速度，而且使硒纳米颗粒的粒径更加均匀，更有益于植物对此富硒微生物制剂的吸收。
6，本富硒微生物制剂使用的枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，胶冻样芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌胶质芽孢杆菌菌种，会对土壤中的微生物带来有益影响，它可以增加土壤中微生物的数量及提高土壤中微生物的活性。此类菌种以其生命活动及其代谢产物导致农作物得到特定肥料效应，生长调节效应，防病虫效应和土壤生物修复等效应的农业产品。
7、本发明的富硒制剂对于农作物病虫害有抗逆作用，其所含的枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，胶冻样芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌胶质芽孢杆菌对有害重金属有拮抗作用，对于蔬菜中的硝酸盐有降解作用，可以减少农药施用量。
附图说明
图1为本发明采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的电镜扫描照片，
图2为本发明采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的xps谱图(a)，
图3为本发明采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的xps谱图(b)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，原料重量份如下：
亚硒酸钠8份，动物血水解液60份，复合微量元素5份，磷酸二氢钾8份，尿素10份，蛋白胨8份，酵母粉4份，NaCl 8份，NaOH 8份，NaNO3 4份，NaCl 10份，NH4Cl 4份，K2HPO4 8份，牛肉膏4份，葡萄糖10份，淀粉10份，碳酸钙8份，氨基酸10份，硝酸钾2份，硫酸亚铁2份，硫酸镁10份，柠檬酸三钠25份，生化酶10份，混合菌液800份；
所述混合菌液是通过以下方法制备得到：
(1)将解淀粉芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在35℃下有氧发酵45h，制得解淀粉芽孢杆菌菌液；发酵液原料组成：8％大豆粉，4％糖蜜，3％淀粉，余量为水，按重量百分比计；
(2)将枯草芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在35℃下有氧发酵45h，即得枯草芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：大豆粉4％，葡萄糖4％，磷酸氢二钾1％，酵母膏1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.3％，余量为水，按重量百分比计；
(3)将地衣芽孢杆菌种以体积比为0.25％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在35℃下有氧发酵24h，即得地衣芽孢杆菌液；所述发酵液原料组成：糖蜜12％，玉米淀粉8％，葡萄糖5％，余量为水，按重量百分比计；
(4)将苏云金芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在35℃下有氧发酵45h，即得苏云金芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：糖蜜12％，氢氧化钾3％，磷酸2％，尿素1％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.1％，余量为水，按重量百分比计；
(5)将胶质芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在35℃下有氧发酵45h，即得胶质芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：玉米淀粉8％，牛肉膏1％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，碳酸钙0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，余量为水，按重量百分比计；
(6)步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中使用的发酵液均于120℃下灭菌2小时，冷却后再进行接种，按体积比将解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液按4：3：2：2：2的比例混合混匀，即得混合菌液。
所述的动物血水解液是以未凝固的动物血为原料，经升温至80℃，加入动物蛋白水解酶水解12h；水解后升温至120℃，保温1h进行灭酶；灭酶后，降温至常温后制得，动物蛋白水解酶的用量为1000kg动物血添加4kg的动物蛋白水解酶。
所述复合微量元素，是由等质量的下述物质混合而成：硫酸锰，硫酸亚铁，硼酸，硫酸铜，硫酸锌，钼酸铵。
所述的生化酶为磷酸葡萄糖激酶PEK。
制备方法：
将原料亚硒酸钠、动物血水解液、复合微量元素、磷酸二氢钾、尿素、蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、NaNO3、NaCl、NH4Cl、K2HPO4、牛肉膏、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、氨基酸、硝酸钾、硫酸亚铁、硫酸镁、柠檬酸三钠、生化酶、混合菌液混合均匀后，调节pH至7.5，得混合物料，将混合物料于32℃通入氮气保持无氧条件下经发酵30h，当混合物料的颜色从淡黄色变到红色，即制得富硒壳聚糖营养型微生物肥料，所述的富硒壳聚糖营养型微生物肥料制剂含单质硒0.3～0.4g/L，所述硒为纳米级，平均粒径为100nm，活性菌总数≧150亿个/mL。
图1为本发明采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的扫描电镜照片，从图中可以看出，纳米级单质硒的平均粒径在100nm。
图2(a)显示，XPS光谱下，溶液中C1s，O1s的，N1s和Se3d的存在。但Se3d在XPS光谱中不明显，即它的发射峰的强度非常弱，这可能是由于硒纳米颗粒容易被芽孢杆菌的蛋白质分泌物捕获。
图3(b)显示，XPS光谱下，溶液中的Se3d结合能在55.74eV，它是硒元素本身的特征峰。C，N，O的存在可能是由于样品中蛋白质和其他生物大分子污染的存在。
我们可以从XPS光谱中得出如下结论，此反应合成硒元素，而且是被芽孢杆菌的蛋白质分泌物覆盖的小尺寸的纳米硒颗粒。M-Se的形成过程中中蛋白质起重要作用。
实施例2
如实施例1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，不同之处在于，原料重量
份如下：
亚硒酸钠10份，动物血水解液62份，复合微量元素8份，磷酸二氢钾10份，尿素15份，蛋白胨12份，酵母粉6份，NaCl 10份，NaOH 10份，NaNO36份，NaCl 15份，NH4Cl 4份，K2HPO4 12份，牛肉膏6份，葡萄糖15份，淀粉15份，碳酸钙12份，氨基酸16份，硝酸钾3份，硫酸亚铁3份，硫酸镁13份，柠檬酸三钠30份，生化酶18份，混合菌液820份。
混合菌液中解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液的体积比为：6：3：2：2：2。
制备方法同实施例1。
实施例3
如实施例1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，不同之处在于，原料重量
份如下：
亚硒酸钠12份，动物血水解液58份，复合微量元素12份，磷酸二氢钾18份，尿素20份，蛋白胨18份，酵母粉8份，NaCl 15份，NaOH 12份，NaNO3 8份，NaCl 20份，NH4Cl 10份，K2HPO4 18份，牛肉膏8份，葡萄糖20份，淀粉20份，碳酸钙18份，氨基酸20份，硝酸钾5份，硫酸亚铁5份，硫酸镁22份，柠檬酸三钠35份，生化酶25份，混合菌液830份。
混合菌液中解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液的体积比为：1：1：1：1：1。
实施例4
如实施例1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，不同之处在于，原料重量
份如下：
亚硒酸钠15份，动物血水解液65份，复合微量元素15份，磷酸二氢钾20份，尿素25份，蛋白胨20份，酵母粉10份，NaCl20份，NaOH 15份，NaNO310份，NaCl 25份，NH4Cl10份，K2HPO4 20份，牛肉膏10份，葡萄糖25份，淀粉25份，碳酸钙20份，氨基酸25份，硝酸钾6份，硫酸亚铁6份，硫酸镁25份，柠檬酸三钠40份，生化酶25份，混合菌液848份。

Claims (10)

1.一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，原料按重量份计由如下成分组成：
亚硒酸钠8-15份，动物血水解液50-65份，复合微量元素5-15份，磷酸二氢钾8-20份，尿素10-25份，蛋白胨8-20份，酵母粉4-10份，NaCl 8-20份，NaOH 8-15份，NaNO34-10份，NaCl 10-25份，NH4Cl 4-10份，K2HPO48-20份，牛肉膏4-10份，葡萄糖10-25份，淀粉10-25份，碳酸钙8-20份，氨基酸10-25份，硝酸钾2-6份，硫酸亚铁2-6份，硫酸镁10-25份，柠檬酸三钠25-40份，生化酶10-25份，混合菌液800-848份；
所述的动物血水解液是以未凝固的动物血为原料，经升温至75-80℃，加入水解酶水解8-15h；水解后升温至120℃，保温1-2h进行灭酶；灭酶后，降温至常温后制得，所述的混合菌液为解淀粉芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌液、苏云金芽孢杆菌菌液和胶质芽孢杆菌菌液的混合液。
2.根据权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，其特征在于，原料按重量份计由如下成分组成：
亚硒酸钠12-13份，动物血水解液60-62份，复合微量元素8-10份，磷酸二氢钾10-15份，尿素15-18份，蛋白胨10-15份，酵母粉6-8份，NaCl 10-15份，NaOH 10-12份，NaNO36-8份，NaCl 15-20份，NH4Cl 4-10份，K2HPO412-18份，牛肉膏6-8份，葡萄糖15-20份，淀粉15-20份，碳酸钙12-18份，氨基酸16-20份，硝酸钾3-5份，硫酸亚铁3-5份，硫酸镁13-22份，柠檬酸三钠30-35份，生化酶18-25份，混合菌液820-830份。
3.根据权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，其特征在于，所述混合菌液是通过以下方法制备得到：
(1)将解淀粉芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，制得解淀粉芽孢杆菌菌液；发酵液原料组成：8-10％大豆粉，4-7％糖蜜，3-5％淀粉，余量为水，按重量百分比计；
(2)将枯草芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得枯草芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：大豆粉4-7％，葡萄糖4-8％，磷酸氢二钾1-2％，酵母膏1-2％，硫酸镁0.02-0.05％，碳酸钙0.3-0.6％，余量为水，按重量百分比计；
(3)将地衣芽孢杆菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得地衣芽孢杆菌液；所述发酵液原料组成：糖蜜12-20％，玉米淀粉8-12％，葡萄糖5-8％，余量为水，按重量百分比计；
(4)将苏云金芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得苏云金芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：糖蜜12-18％，氢氧化钾3-5％，磷酸2-4％，尿素1-3％，牛肉膏0.5-2％，硫酸镁0.1-0.2％，硫酸锌0.1-0.2％，余量为水，按重量百分比计；
(5)将胶质芽孢杆菌菌种以体积比为0.25％-0.5％的接种量接入装有发酵液的发酵罐中，在30-38℃下有氧发酵24-48h，即得胶质芽孢杆菌菌液；所述发酵液原料组成：玉米淀粉8-12％，牛肉膏1-2％，葡萄糖1-3％，蛋白胨0.5-1％，碳酸钙0.5-1％，磷酸氢二钾0.5-1％，硫酸镁0.02-0.05％，余量为水，按重量百分比计；
(6)按体积比将解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液按(1-6)：(1-3)：(1-2)：(1-2)：(1-2)的比例混合混匀，即得混合菌液。
4.根据权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌菌液：地衣芽孢杆菌液：苏云金芽孢杆菌菌液：胶质芽孢杆菌菌液的体积比为：(2-4)：(2-3)：2：2：2，步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中使用的发酵液均于110℃～120℃下灭菌2～3小时，冷却后再进行接种，步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中有氧发酵时间45-48h，所述的解淀粉芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～150亿个/ml，枯草芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～160亿个/ml，地衣芽孢杆菌液中活菌含量为120～150亿个/ml，苏云金芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～150亿个/ml，胶质芽孢杆菌菌液中活菌含量为120～150亿个/ml。
5.根据权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，其特征在于，所述的水解酶为动物蛋白水解酶，动物蛋白水解酶的用量为1000kg动物血添加3-4kg的动物蛋白水解酶。
6.根据权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，其特征在于，所述复合微量元素，是由等质量的下述物质混合而成：硫酸锰，硫酸亚铁，硼酸，硫酸铜，硫酸锌，钼酸铵。
7.根据权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂，其特征在于，所述的生化酶为磷酸葡萄糖激酶PEK、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、谷氨酸脱氢酶、氨甲酰磷酸合酶Ⅰ或氨甲酰磷酸合酶Ⅱ。
8.权利要求1所述的一种采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的制备方法，包括步骤如下：
将原料亚硒酸钠、动物血水解液、复合微量元素、磷酸二氢钾、尿素、蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、NaNO3、NaCl、NH4Cl、K2HPO4、牛肉膏、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、氨基酸、硝酸钾、硫酸亚铁、硫酸镁、柠檬酸三钠、生化酶、混合菌液混合均匀后，调节pH至7～7.5，得混合物料，将混合物料于30～35℃在无氧条件下经发酵24-48h，当混合物料的颜色从淡黄色变到红色，即制得富硒壳聚糖营养型微生物肥料，所述的富硒壳聚糖营养型微生物肥料制剂含单质硒0.3～0.4g/L，所述硒为纳米级，平均粒径为60～150nm，活性菌总数≧150亿个/mL。
9.根据权利要求8所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的制备方法，其特征在于，混合物料在发酵过程中通入惰性气体维持无氧环境，所述的惰性气体为氮气或氩气。
10.权利要求1所述的采用动物血清发酵制备的富硒微生物制剂的应用，用于缺硒、贫硒地区的农作物种植施肥用，包括根部施肥和叶面施肥，根部施肥时将富硒壳聚糖营养型微生物肥料直接施用，叶面施肥时将富硒壳聚糖营养型微生物肥料稀释2～5倍施用，所述的农作物为葡萄，苹果，西葫芦，辣椒，黄瓜，白菜油菜，西红柿，茄子。
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