CN104458989B - 基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法 - Google Patents
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Abstract
基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法,是采用HPLC‑FTICR‑MS,寻找猪皮明胶酶解混合物的特征性质谱峰;通过同位素标记技术对特征峰进行标记,实现质谱峰的质荷比偏移,以同位素标记后的特征性质谱峰为内标,借助特征峰偏移前后的峰强度的不同,准确计算猪皮明胶添加量。本发明FTICR‑MS具有的高分辨率特性,能准确地判断可作为猪皮明胶定量检测的特征峰,提供了猪皮明胶定量检测的前提;利用同位素标记技术和HPLC‑FTICR‑MS能有效定量检测猪皮明胶添加量,误差范围在10%以内,可为相关部门监控食品提供依据;用胰蛋白酶酶解溶于H2 18O中的猪皮明胶,可一步完成蛋白质酶解过程和多肽的18O标记过程,缩短了猪皮明胶定量检测所需的时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪皮明胶的定量检测方法,具体涉及一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法。
背景技术
明胶具有凝胶性、乳化性、起泡性、成膜性等多种功能特性,被广泛应用于食品、医药、照相等领域。目前,商业上大约95%的明胶来源于哺乳动物,如猪皮、牛皮。然而,犹太教和伊斯兰教人不吃与猪相关的食物,因此,为了鉴别食品中猪皮明胶的添加与否,数量多少,需要寻找一种能够准确定量检测食品中猪皮明胶添加量的方法。
本发明采用高效液相色谱-傅立叶变换离子回旋共振质谱(HPLC-FTICR-MS),寻找猪皮明胶酶解混合物的特征性质谱峰;通过同位素标记技术对特征峰进行标记,实现质谱峰的质荷比偏移,以同位素标记后的特征性质谱峰为内标,借助特征峰偏移前后的峰强度的不同,准确计算食品中的猪皮明胶添加量。本发明采用胰蛋白酶酶解、HPLC-FTICR-MS和同位素标记技术确定猪皮明胶添加量,国内外未有文献进行相关报道。
发明内容:
本发明旨在提供一种猪皮明胶的定量检测方法,以猪皮明胶为对象,采用胰蛋白酶酶解、同位素标记、HPLC-FTICR-MS检测,有效确定猪皮明胶的添加量。
其具体工艺方案如下:
1、溶液的配制
(1)碳酸氢氨溶液的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制10-100 mM的碳酸氢氨溶液;
(2)酶的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制 0.01-1 mg/ml 的胰蛋白酶溶液;
(3)猪皮明胶溶液的配制:用H2 16O和H2 18O配制的10-100 mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶,分别得到溶于H2 16O和H2 18O的0.1-10 mg/ml 的猪皮明胶溶液。
2、同位素标记
(1)加酶:将H2 16O配制的胰蛋白酶加入H2 16O配制的猪皮明胶中,胰蛋白酶和猪皮明胶质量比mg/mg 为1:200-1:10,将H2 18O配制的胰蛋白酶加入H2 18O配制的猪皮明胶中,胰蛋白酶和猪皮明胶质量比mg/mg 为1:200-1:10;
(2)酶解和标记:酶解和标记过程同时进行,反应温度为15-50 ℃,反应时间为4-30 h;
(3)终止反应:将酶解液置于70-100 ℃中 5-30min。
3、HPLC-FTICR-MS检测
(1)标记物和未标记物的混合:以H2 18O中的猪皮明胶水解物为内标,与H2 16O中的猪皮明胶水解物按照质量比mg/mg为1:50-50:1混合;
(2)上样检测:混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中,对经过HPLC分离的猪皮明胶水解物进行检测,上样量为0.5-20 μg。
4、数据分析
(1)根据氨基酸序列,寻找猪皮明胶的特征峰;
(2)分析并记录特征峰在标记前后的峰强度;
(3)定量方法的准确性分析:通过比较标记物/未标记物即18O/16O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性,18O/16O按照如下公式计算:
其中,I0, I2 和 I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰强度,质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度;M0, M2 和 M4分别代表未标记即16O的特征肽在理论上的单一同位素峰强度,质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度。
所述实现特征性质谱峰的质荷比偏移,具体为:
未标记时,胰蛋白酶处理后的猪皮明胶酶解物中特征峰为925.42212+-925.46212+,相应的氨基酸序列为GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK(*表示P被羟基化),经18O标记后,特征峰的质荷比变成927.42212+-927.46212++,氨基酸序列GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替。
或者,所述实现特征性质谱峰的质荷比偏移,具体为:
未标记时,胰蛋白酶处理后的猪皮明胶酶解物中特征峰为929.46232+-929.50232+,相应的氨基酸序列为IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK(*表示P被羟基化),经18O标记后,特征峰的质荷比变成931.46232+-931.50232+,氨基酸序列IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替。
本产品的特征:采用胰蛋白酶酶解溶于H2 18O中的猪皮明胶,制备的18O标记的特征性肽作为猪皮明胶定量检测内标,将未标记即16O和18O标记的猪皮明胶酶解物按照一定比例混合,利用HPLC-FTICR-MS检测,通过特征峰的峰强度计算猪皮明胶含量。本发明可为食品中猪皮明胶的定量检测提供了有利依据。
本发明的有益效果:1、FTICR-MS(傅立叶变换离子回旋共振质谱)具有的高分辨率特性,能非常准确的判断可作为猪皮明胶定量检测的特征峰,提供了猪皮明胶定量检测的前提;2、利用同位素标记技术和HPLC-FTICR-MS(高效液相色谱-傅立叶变换离子回旋共振质谱)能准确定量检测食品中的猪皮明胶添加量,误差范围在10%以内,可为相关部门监控食品提供依据;3、用胰蛋白酶酶解溶于H2 18O中的猪皮明胶,可一步完成蛋白质酶解过程和多肽的18O标记过程,缩短了猪皮明胶定量检测所需的时间。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例一
1、溶液的配制:(1)碳酸氢氨溶液的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制10 mM的碳酸氢氨溶液;(2)酶的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制 1 mg/ml 的胰蛋白酶溶液;(3)猪皮明胶溶液的配制:用H2 16O和H2 18O配制的10 mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶,分别得到溶于H2 16O和H2 18O的1 mg/ml 的猪皮明胶溶液。
2、同位素标记:(1)加酶:按照酶和猪皮明胶质量比1:50(mg/mg)将H2 16O配制的胰蛋白酶加入H2 16O配制的猪皮明胶中,按照酶和猪皮明胶质量比1:50(mg/mg)将H2 18O配制的胰蛋白酶加入H2 18O配制的猪皮明胶中;(2)酶解和标记:酶解和标记过程同时进行,反应温度为37 ℃,反应时间为24 h;(3)终止反应:将酶解液置于100 ℃中 5min。
3、HPLC-FTICR-MS检测:(1)标记物和未标记物的混合:以H2 18O中的猪皮明胶水解物为内标,与H2 16O中的猪皮明胶水解物按照1: 1(mg/mg)混合;(2)上样:将混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中,上样量为3 μg;(3)检测:利用FTICR-MS设备对经过HPLC的猪皮明胶水解物进行检测。
4、数据分析:(1)寻找特征峰:找到猪皮明胶的特征峰925.44212+,相应的氨基酸序列为GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK(*表示P被羟基化);(2)分析特征峰标记前后比例:计算得到的标记物/未标记物为0.99,误差范围小于10%。
实施例二
1、溶液的配制:(1)碳酸氢氨溶液的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制10 mM的碳酸氢氨溶液;(2)酶的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制 1 mg/ml 的胰蛋白酶溶液;(3)猪皮明胶溶液的配制:用H2 16O和H2 18O配制的10 mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶,分别得到溶于H2 16O和H2 18O的1 mg/ml 的猪皮明胶溶液。
2、同位素标记:(1)加酶:按照酶和猪皮明胶质量比1:20(mg/mg)将H2 16O配制的胰蛋白酶加入H2 16O配制的猪皮明胶中,按照酶和猪皮明胶质量比1:20(mg/mg)将H2 18O配制的胰蛋白酶加入H2 18O配制的猪皮明胶中;(2)酶解和标记:酶解和标记过程同时进行,反应温度为37 ℃,反应时间为24 h;(3)终止反应:将酶解液置于100 ℃中 5min。
3、HPLC-FTICR-MS检测:(1)标记物和未标记物的混合:以H2 18O中的猪皮明胶水解物为内标,与H2 16O中的猪皮明胶水解物按照1: 1(mg/mg)混合;(2)上样:将混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中,上样量为5 μg;(3)检测:利用FTICR-MS设备对经过HPLC的猪皮明胶水解物进行检测。
4、数据分析:(1)寻找特征峰:找到猪皮明胶的特征峰925.44212+,相应的氨基酸序列为GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK(*表示P被羟基化);(2)分析特征峰标记前后比例:计算得到的标记物/未标记物为1.02,误差范围小于10%。
Claims (4)
1.一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法,其特征是:
A、溶液的配制
(1)碳酸氢氨溶液的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制碳酸氢氨溶液;
(2)酶溶液的配制:分别用H2 16O和H2 18O配制胰蛋白酶溶液;
(3)猪皮明胶溶液的配制:用H2 16O和H2 18O配制碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶,分别得到溶于H2 16O和H2 18O的猪皮明胶溶液;
B、同位素标记
(1)加酶:将H2 16O配制的胰蛋白酶溶液加入H2 16O配制的猪皮明胶溶液中,将H2 18O配制的胰蛋白酶溶液加入H2 18O配制的猪皮明胶溶液中;
(2)酶解和标记:酶解和标记过程同时进行;
(3)终止反应;
C、HPLC-FTICR-MS检测
(1)标记物和未标记物的混合:以H2 18O中的猪皮明胶酶解物为内标与H2 16O中的猪皮明胶酶解物进行混合;
(2)上样检测:混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中,对经过HPLC分离的猪皮明胶水解物进行检测,上样量为0.5-20μg;
D、数据分析:
(1)根据氨基酸序列,寻找猪皮明胶的特征峰;
同位素标记实现特征性质谱峰的质荷比偏移,具体为:
未标记时,胰蛋白酶处理后的猪皮明胶酶解物中特征峰为925.42212+-925.46212+,相应的氨基酸序列为GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK,*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成927.42212+-927.46212++,氨基酸序列GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替;
或者,未标记时,胰蛋白酶处理后的猪皮明胶酶解物中特征峰为929.46232+-929.50232 +,相应的氨基酸序列为IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK,*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成931.46232+-931.50232+,氨基酸序列IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替;
(2)分析并记录特征峰在标记前后的峰强度;
(3)定量方法的准确性分析:通过比较标记物/未标记物即18O/16O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性,18O/16O按照如下公式计算:
其中,I0、I2和I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰强度,质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度;M0、M2和M4分别代表未标记即16O的特征肽在理论上的单一同位素峰强度,质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法,其特征是:
步骤A中,配制的碳酸氢氨溶液浓度为10-100mM;配制的胰蛋白酶溶液浓度为0.01-1mg/ml;
猪皮明胶溶液的配制是用10-100mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶,分别得到0.1-10mg/ml的猪皮明胶溶液。
3.根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法,其特征是:所述步骤B同位素标记当中,H2 16O配制的胰蛋白酶溶液和猪皮明胶溶液的质量比为1:200-1:10mg/mg,H2 18O配制的胰蛋白酶溶液和猪皮明胶溶液的质量比为1:200-1:10mg/mg;
所述酶解和标记反应温度为15-50℃,反应时间为4-30h;
所述终止反应条件为将酶解液置于70-100℃中5-30min。
4.根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法,其特征是:以H2 18O中的猪皮明胶酶解物为内标与H2 16O中的猪皮明胶酶解物按照质量比mg/mg为1:50-50:1混合。
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