CN104450909A - 一种用于检测微小核糖核酸的检测方法及相应的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的主要内容是一种基于催化发卡放大和RNA转录联合放大技术检测miRNA（微小核糖核酸）的方法，以及包含该方法所需试剂的试剂盒。本发明所述的检测方法的要点为以两种简单混合时不发生杂交反应、在待测miRNA存在的情况下会迅速杂交的探针发卡结构为基础，在待测miRNA引发下，发生催化发卡放大和RNA转录，产生两次连续的放大过程；本发明所述的试剂盒由上述过程中的特征试剂组成。本检测方法和本试剂盒具有高特异性、高灵敏度检测miRNA的优点。

Description

一种用于检测微小核糖核酸的检测方法及相应的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物化学分析领域，主要内容为一种检测微小核糖核酸（miRNA）的方法以及包含该方法所涉及的特征性试剂的试剂盒。所述方法基于催化发卡放大、RNA转录级联信号放大、孔雀石绿与适体结合产生荧光三个过程原理。

背景技术

微小核糖核酸是本发明所述的检测方法和相应试剂盒的目标检测物。微小核糖核酸（以下简称miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性的、非编码但具有调控功能的核糖核酸，长约20~25个核苷酸，名称中的“微小”即来源于上述尺寸与转移核糖核酸和核糖体核糖核酸的尺寸的对比。miRNA的基本作用为参与核糖核酸诱导的沉默作用实现对生物体内蛋白质合成过程的调控，也参与其他多种过程的调节，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等；最近的研究指出，大约50%得到注解的微小核糖核酸在基因组上的位置为与肿瘤相关的脆性位点，提示多种微小核糖核酸的表达与多种肿瘤发生过程存在正相关关系。因此，检测人体组织和细胞内微小核糖核酸的存在并测定其含量具有重要的意义。另外，人体内存在着序列相近但功能不同的微小核糖核酸，使得检测方法区分微小核糖核酸的能力（或称特异性）成为重要的指标。

本发明采用催化发卡放大和核糖核酸转录（以下简称“RNA转录”）联合级联反应作为miRNA识别及信号放大技术。在已报道的研究中，催化发卡放大是以单链寡聚核苷酸链为催化剂，催化一套两种人为设计的寡聚脱氧核苷酸链发卡结构发生大规模杂交的过程。RNA转录则是以带有启动子片段的寡聚脱氧核苷酸链为模板，在RNA聚合酶的催化下产生聚核苷酸新链的过程；其中启动子片段为双链是必要条件，而除启动子片段之外的其他序列部分为双链时，RNA转录的效率较高。

催化发卡放大和RNA转录在生命分析化学研究中都可用作信号放大技术。以往没有这两种过程联合使用的报道；本发明注意到通过人为设计，催化发卡放大的产物可以充当RNA转录过程的模板，因此可以将这两种信号放大机制连接起来形成一个效率更高的双重放大机制，这是本发明的创新点之一。

本发明采用孔雀石绿与其适体结合后产生的荧光作为输出信号。孔雀石绿是三苯甲烷类有机染料，已知给定序列的孔雀石绿单独存在时荧光信号相当低；而一个具有特定序列的寡聚核糖核酸短链可以与孔雀石绿特异性结合，这段短链被称为孔雀石绿的适体。孔雀石绿在与适体结合后会产生显著的荧光，与结合前的荧光信号有显著的差距，可以作为分析化学中定量测定的基础。

发明内容

本发明的主要内容为一种用于检测微小核糖核酸的（miRNA）方法，以及包含用于实施该方法的特征性试剂的试剂盒。

     本发明中的miRNA检测方法的技术要点为：

1.        待测miRNA：本发明（对于不同的检测实施例而言）适用于检测多种长度、任意序列的miRNA；但在一次具体的检测实施例中，仅能检测核苷酸序列预先给定的miRNA。

上述对于整个发明内容来说序列可变、对于一次具体实施例来说序列预先给定的被检测的miRNA，以下以“待测miRNA”指称。

2.        探针：本方法使用两种人为构建的含有发卡结构的寡聚脱氧核糖核酸链作为所有检测反应的基础，本发明文件将其合称为探针。探针的脱氧核苷酸序列，对于每个具体的检测实施例而言，根据待测miRNA的序列人为设计构建。探针包括：

a)        探针发卡A，其核苷酸序列按如下功能片段设计构建：RNA聚合酶的启动子片段、识别待测miRNA序列的发卡结构（以下记为发卡结构a）；发卡结构a的序列设计为可以与待测miRNA通过杂交结合，使发卡结构打开；

b)        探针发卡B，包含如下片段：与发卡结构a序列互补的发卡结构（以下记为发卡结构b）、序列与孔雀石绿适体互补的反义转录模板片段；发卡结构b的序列设计为：发卡结构a与待测miRNA结合打开后，可以再去与发卡结构b杂交结合

3.        待测miRNA和两种探针发卡组合起来具有如下性质：探针发卡A和发卡结构B混合、没有待测miRNA存在时，两者在检测实验的时间段内（约3~5小时）不会发生可检测的杂交结合；而当有待测miRNA存在时，在待测miRNA的催化下，两者会发生显著的结合，结合量与待测miRNA的浓度正相关。

4.        其他配合的组分和试剂包括：

a)        核酸杂交缓冲液；

b)        脱氧核糖核酸聚合体系：包括DNA聚合酶、四种脱氧三磷酸核苷酸混合物、脱氧核糖核酸聚合缓冲液；

c)        核糖核酸聚合体系：包括RNA聚合酶、四种三磷酸核苷酸混合物、核糖核酸聚合缓冲液；

d)        孔雀石绿。

5.        检测方法在原理层面上由以下步骤组成。这些步骤根据其特征依次叙述如下，并示意于附图1中：

a)        识别和引发。探针发卡A与待测miRNA特异性杂交结合，打开，打开的探针发卡A作用于探针发卡B，结果为两种探针发卡杂交，待测miRNA被替换释放。

b)        发卡杂交的循环、DNA聚合和转录模板的形成。上一步中待测miRNA被替换释放，即可引发未反应的一对探针发卡A和探针发卡B发生杂交，自身再被释放。如此循环往复，一条miRNA链可以引发大量探针发卡链发生杂交，而自身被重复循环利用，类似于催化反应。由此产生信号放大。

探针发卡链的杂交产物在DNA聚合体系的催化下发生双向聚合，产生带有双链启动子序列的杂交DNA结构，成为转录模板。

c)        转录产生RNA孔雀石绿适体。上述转录模板在核糖核酸聚合体系的作用下发生转录，产生与探针中的转录模板链互补的寡聚核糖核苷酸链，功能上是孔雀石绿适体。根据转录的性质，一个转录模板可以重复产生多条孔雀石绿适体。

d)        信号的产生和检测。转录产生的孔雀石绿适体与孔雀石绿结合，产生荧光信号。

e)        miRNA浓度的定量。，因而通过测定最终的荧光响应，从中扣减孔雀石绿单独存在时的荧光响应，即可对待测miRNA的浓度进行定量。

6.        检测方法在实际操作层面上具有如下特征：

a)        上述原理步骤中的1) ~3）步可以同时发生、互不干扰，在实际操作中可以在同一个操作步骤和同一个反应体系中完成。

附图1：两种探针发卡及检测过程原理示意图

本专利所包含的试剂盒，是包含本检测方法所使用的多种特征试剂的实体产品，再配合普通生物化学实验室常备试剂和具有足够灵敏度的荧光分光光度计即可完成上述检测过程。试剂盒中包含探针发卡A，包含如下片段：转录启动子片段、识别待测miRNA序列的发卡结构（以下记为发卡结构a）；探针发卡B，包含如下片段：与发卡结构a序列互补的发卡结构（以下记为发卡结构b）、转录模板片段。脱氧核糖核酸聚合体系：包括DNA聚合酶、四种脱氧三磷酸核苷酸混合物、脱氧核糖核酸聚合缓冲液；核糖核酸聚合体系：包括RNA聚合酶、四种三磷酸核苷酸混合物、核糖核酸聚合缓冲液；孔雀石绿。

Claims (2)

1.一种基于催化发卡放大和RNA转录联合自动放大的用于检测miRNA（微小核糖核酸）的方法，其特征在于：

1) 使用催化发卡放大和RNA转录两种过程首尾连接构成两级放大，能够实现这一连接的原因在于，通过人为的方法设计，催化发卡放大的产物可以作为RNA转录的起始模板；

2) 催化发卡放大过程同时可以进行信号放大和对待测miRNA序列的高特异性识别；

3) 使用两种人为设计的发卡结构的寡聚核糖核酸链作为所有检测反应的基础，这两种发卡结构简单混合时不发生杂交反应，而在待测miRNA存在时，在其催化下，少量miRNA即可引起大量发卡结构杂交，形成信号放大；

4) 上述发卡结构的寡聚核糖核酸链，可以通过人为设计改变序列，从而使本方法适用于任意序列和多种长度的miRNA的检测。

2.按照权利要求1所述的方法，用于检测miRNA（微小核糖核酸）的试剂盒，其特征在于：试剂盒中包含探针发卡A，包含如下片段：转录启动子片段、识别待测miRNA序列的发卡结构（以下记为发卡结构a）；探针发卡B，包含如下片段：与发卡结构a序列互补的发卡结构（以下记为发卡结构b）、转录模板片段；脱氧核糖核酸聚合体系：包括DNA聚合酶、四种脱氧三磷酸核苷酸混合物、脱氧核糖核酸聚合缓冲液；核糖核酸聚合体系：包括RNA聚合酶、四种三磷酸核苷酸混合物、核糖核酸聚合缓冲液；孔雀石绿。