CN104447949A - 多肽和药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽，该多肽的结构如式（1）所示，其中，m为1-3的整数，n为3-20的整数。本发明还提供了一种药物组合物及其制备方法，该方法包括将药物化合物溶液与本发明所述的多肽接触，得到接触后的物料。通过本发明提供的制备药物组合物的方法获得的药物组合物能够同时实现载药效果好、释药速度适中、稳定性好且生物相容性好。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体地，涉及一种多肽和一种药物组合物及其制备方法。
背景技术
近年来纳米药物载体的开发研究受到了广泛的关注。纳米药物载体具有很多优势，例如：纳米颗粒易于制备、修饰加工且可控性好，可保护药物、基因或功能性分子免受机体或一些酶类的降解作用等。某些纳米颗粒在充当“载体”角色的同时，还具有免疫佐剂的功能。
分子自组装，是利用分子与分子或分子中某一片段与另一片段之间的分子识别,通过如氢键、范德华力、静电力、疏水作用、π-π堆积作用等非共价的弱相互作用力形成具有特定排列顺序的分子聚集体的过程。利用自组装技术制备纳米材料具有以下几方面的优势：尺寸可控，分散性好；纯度高，废物少；产物较稳定，不易发生团聚现象；操作仪器简单，但对条件的控制要求精确。
由于多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质、具有良好的生物相容性和可控的生物降解性，降解后的短肽和氨基酸还能被人体吸收；因此，相对于其他自组装体系，多肽自组装有着更为广阔的应用前景。
但是，现有的多肽纳米载体不能同时实现载药效果好、释药速度适中、稳定性好且生物相容性好。
发明内容
本发明的目的是克服现有纳米药物载体不能同时实现载药效果好、释药速度适中、稳定性好且生物相容性好的缺陷，提供一种能够同时实现载药效果好、释药速度适中、稳定性好且生物相容性好的多肽自组装纳米药物载体。
为了实现上述目的，本发明提供了一种多肽，该多肽的结构如式（1）所示：
其中，m为1-3的整数，n为3-20的整数。
本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，该方法包括将药物化合物溶液与本发明如上所述的多肽接触，得到接触后的物料。
本发明还提供了由如上所述的药物组合物的制备方法制备的药物组合物，所述药物组合物为一种纳米药物载体。
通过本发明提供的药物组合物的制备方法制备的药物组合物能够同时实现载药效果好、释药速度适中、稳定性好且生物相容性好。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1表示通过透射电镜观察测试实施例1中药物组合物的形貌的图。
图2表示通过透射电镜观察测试实施例1中药物组合物的粒径测定结果的图。
图3表示实施例1中药物组合物在吸附抗体前后的表面电势变化的图。
图4表示测试实施例1中药物组合物在吸附抗体后的电势稳定性测试结果的图。
图5表示测试实施例1的药物组合物中的药物化合物阿霉素的释放曲线的图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“溶液”的范围并不限于分散质的粒子直径小于1nm的分散系（真溶液），而是泛指均一的液态混合物，可以包括胶状分散体（胶体溶液）。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，液体的体积数值均为标准状态下的数值。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，所述的接触或混合可以在搅拌的条件下进行。搅拌的速度可以为常规的选择。本发明的发明点在于结构如式（1）所示的多肽以及由此多肽与药物及蛋白接触和/或混合所获得的药物组合物及其制备方法。本发明所述的药物组合物的制备方法中接触和/或混合的方式并不是本发明的发明点，本领域的技术人员可以采用本领域内常规使用的手段进行接触和/或混合，只要能够获得本发明所述的药物组合物即可，例如本发明的实施例中采用透析的方法实现多肽与药物及蛋白接触和/或混合以获得本发明所述的药物组合物。
本发明提供了一种多肽，该多肽的结构如式（1）所示：
其中，m为1-3的整数，例如可以为1、2或3，n为3-20的整数，例如可以为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
具体地，所述多肽的结构为3-20个精氨酸通过肽键连接成多聚精氨酸片段，多聚精氨酸片段的N端通过肽键连接1-3个甘氨酸，甘氨酸的N端与胆固醇的羟基之间通过甲酸酯基连接，构成式（1）所示结构的多肽。
根据本发明提供的如式（1）所示的多肽，其中，对本发明的所述多肽的合成方法没有特别的限定，可以为本领域内常规的多肽合成的方法，例如可以通过固相合成法合成如式（1）所示的多肽。
根据本发明提供的如式（1）所示的多肽，优选情况下，式（1）所示结构中的m为1，n为8或9。
本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，该方法包括将药物化合物溶液与本发明如上所述的式（1）所示的多肽接触，得到接触后的物料。
在本发明中，对上述接触的方式没有特别的限定，可以为本领域内为制备纳米药物组合物常规使用的各种方法，只要能够使得所述药物化合物溶液与式（1）所示的多肽形成药物组合物即可。优选情况下，如上所述的将药物化合物溶液与本发明如上所述的式（1）所示的多肽接触的条件可以包括：pH值为6-8，温度为4-45℃，时间为12-48小时。优选情况下，所述接触的条件包括：pH值为6.5-7.5，温度为20-42℃，时间为20-30小时。例如所述接触可以通过透析的方式实现。
根据本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物的制备方法包括将药物化合物溶液与本发明如上所述的式（1）所示的多肽混合后，用透析袋进行透析，没有被包埋的药物化合物在此过程中被清除，由此得到药物组合物。透析袋例如可以使用截留分子量为1kDa的透析袋。所述透析优选在磷酸缓冲液（如pH值为7.4，150毫摩尔/升）中进行，进一步优选每3-5h换一次磷酸缓冲液，透析进行20-30h。
根据本发明提供的一种药物组合物的制备方法，相对每重量份的如上所述的式（1）所示的多肽，所述药物化合物的用量为0.05-1重量份。优选情况下，相对每重量份的如上所述的式（1）所示的多肽，所述药物化合物的用量为0.1-0.5重量份。
其中，所述药物组合物中包载的药物化合物的浓度可以为5-100微摩尔/升。优选情况下，所述药物组合物中包载的药物化合物的浓度为10-50微摩尔/升。
根据本发明提供的一种药物组合物的制备方法，其中，对本发明所述药物化合物溶液中的药物化合物没有特别的限定，只要所述药物化合物能够用来治疗肿瘤等疾病，例如可以为阿霉素、紫杉醇和喜树碱中的至少一种。优选为阿霉素。
而且，对本发明所述药物化合物溶液中的溶剂也没有特别的限定，只要所述溶剂能够溶解药物且能和水互溶即可，例如可以为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。优选为二甲基亚砜。
其中，所述药物化合物溶液为将上述任意一种或多种药物化合物与上述任意一种或多种溶剂混合均匀形成的溶液。
其中，所述接触后的物料中可以含有粒径为60-100nm之间的纳米颗粒，且所述纳米颗粒可以带有电荷。本发明所述的接触后的物料可以为溶液。
根据本发明提供的一种药物组合物的制备方法，该方法还可以包括：将所述接触后的物料与蛋白进行混合。
其中，将如上所述的接触后的物料与蛋白进行混合的条件可以包括：pH值为6-8，温度为4-45℃，时间为0.5-30小时。
在本发明中，对上述混合的方式没有特别的限定，可以为本领域内为制备纳米药物组合物常规使用的各种方法，只要能够使得所述药物化合物溶液与式（1）所示的多肽形成本发明所述的药物组合物即可。例如所述混合可以通过透析的方式实现。根据本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物的制备方法包括将接触后的物料与蛋白混合后，用透析袋进行透析，没有被包埋的药物化合物在此过程中被清除，由此得到药物组合物。透析袋例如可以使用截留分子量为1kDa的透析袋。所述透析优选在磷酸缓冲液（如pH值为7.4，150毫摩尔/升）中进行，进一步优选每3-5h换一次磷酸缓冲液，透析进行20-30h。
其中，相对每重量份的如上所述的多肽，所述蛋白的用量可以为0.05-0.5重量份。优选情况下，所述蛋白的用量为0.1-0.2重量份。
其中，所述蛋白可以为与所述纳米颗粒带有相反电荷的蛋白。
具体地，所述蛋白可以为靶向肿瘤间质细胞的抗体、靶向肿瘤细胞的抗体和靶向肿瘤血管的抗体中的至少一种。优选情况下，所述蛋白为靶向肿瘤间质细胞的抗体。
根据本发明提供的一种药物组合物的制备方法，对如上所述的接触后的物料与蛋白进行混合的方法没有特别的限定，例如可以将上述蛋白加入到上述接触后的物料中并搅拌均匀，还可以将上述蛋白与接触后的物料混合后通过透析的方法获得本发明所述的药物组合物。
本发明还提供了如上所述的药物组合物的制备方法制备的药物组合物。
根据本发明提供的一种药物组合物，所述药物组合物的粒径可以为50-200nm。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。其中，在没有特别说明的情况下，所用的试剂均为市售品。
制备例1
本制备例用于合成本发明所提供的多肽。
根据文献（Lihong Liu等，Nature nanotechnology），2009，Vol4，July）提供的方法，合成如式（1）所示的多肽，所不同的是本制备例中合成的多肽的m为1，n为9，多肽的C末端氨基酸为精氨酸，且该多肽序列中不含酪氨酸。经质谱（飞行时间质谱，MALDI-TOF，BRUKER，microflex.LRF，USA）鉴定，其分子量为1878Da，与式（1）所示的多肽（m为1，n为9）的分子量完全相符，命名该式（1）所示的多肽（m为1，n为9）为AP。
制备例2
本制备例用于获得本发明所述的药物化合物溶液。
按照文献（Eun Seong Lee等.可控释放杂志(J.Control.Release)2005,103,405）提供的方法，将2mg盐酸阿霉素溶解在1mL二甲基亚砜中，混合60μL三乙胺，室温条件下避光反应8h。得到疏水性阿霉素二甲亚砜溶液。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的药物组合物及其制备方法。
取5mg制备例1所得的AP，加入到500μL制备例2所得疏水性阿霉素二甲亚砜溶液中，用截留分子量为1kDa的透析袋在磷酸缓冲液（pH值为7.4，150毫摩尔/升）中透析，每4h换一次磷酸缓冲液，没有被包埋的阿霉素在此过程中被清除。24h后得到内包有阿霉素的多肽自组装纳米颗粒，其表面电势约为+50毫伏，如图3所示。常温下，按照质量比1（靶向肿瘤间质细胞的抗体）：10（AP）将靶向肿瘤间质细胞的抗体与AP混合搅拌2h，制备的纳米颗粒药物组合物为大小较均一、稳定的球形结构，平均粒径约为60nm，分散指数（PDI）为0.157，表面电势约为-10毫伏，如图3所示。命名此药物组合物为APNPs-1。
实施例2
本实施例用于说明本发明所述的药物组合物及其制备方法。
采用实施例1所述的方法制备药物组合物，所不同的是靶向肿瘤间质细胞的抗体与AP的质量比为1：5，制备的纳米颗粒药物组合物为大小较均一、稳定的球形结构，平均粒径为60nm，PDI为0.162，表面电势约为-15毫伏，命名此药物组合物为APNPs-2。
实施例3
本实施例用于说明本发明所述的药物组合物及其制备方法。
采用实施例1所述的方法制备药物组合物，所不同的是靶向肿瘤细胞的抗体与AP的质量比为1：8，制备的纳米颗粒药物组合物为大小较均一、稳定的球形结构，平均粒径为60nm，PDI为0.165，表面电势约为-8毫伏，命名此药物组合物为APNPs-3。
实施例4
本实施例用于说明本发明所述的药物组合物及其制备方法。
采用实施例1所述的方法制备药物组合物，所不同的是，取100μL制备例2所得疏水性阿霉素二甲亚砜溶液。靶向肿瘤血管的抗体与AP的质量比为1：10。制备的纳米颗粒药物组合物为大小较均一、稳定的球形结构，平均粒径为60nm，PDI为0.159，表面电势约为-10毫伏，命名此药物组合物为APNPs-4。
实施例5
本实施例用于说明本发明所述的药物组合物及其制备方法。
采用实施例1所述的方法制备药物组合物，所不同的是，取2mg制备例1所得的AP。制备的纳米颗粒药物组合物为大小较均一、稳定的球形结构，平均粒径为60nm，PDI为0.158，表面电势约为-10毫伏，命名此药物组合物为APNPs-5。
测试例1
本测试例用于测定药物化合物的包封率。
通过透射电镜（美国FEI，Tecnai G220S-TWIN，200kV）观察实施例1得到的药物组合物APNPs-1，实施例1得到的药物组合物具有如图1所示的显微形态，其粒径测试结果如图2所示，为60nm左右。
将药物组合物APNPs-1溶解在2mL二甲基亚砜/盐酸（1000：1）的混合液中，利用紫外分光光度计测定阿霉素的浓度（吸收峰设在481nm）。根据溶液中阿霉素的浓度计算药物组合物APNPs-1中阿霉素的包封率。
药物组合物对阿霉素的包封率%=（阿霉素浓度×溶液体积/阿霉素原始加入量）×100%。
测得药物组合物APNPs-1中阿霉素的包封率为21.2%。
同样的方法测得实施例2-5药物组合物APNPs2-5中阿霉素的包封率分别为21.3%、20.5%、37.5%、11.9%。
测试例2
本测试例用于说明药物组合物中药物化合物阿霉素的释放曲线。
将实施例1中制备的药物组合物APNPs1用截留分子量为1kDa的透析袋在1L中性磷酸缓冲液（pH7.4，150mM）中透析48h，在不同时间点取出1mL磷酸缓冲液，利用紫外分光光度计测定阿霉素浓度（吸收峰设在481nm）。为确保透析液体积不变，再将取出的1mL磷酸缓冲液倒回透析液中。
阿霉素的释放率%=（Mt/M）×100%
其中，Mt是时间t时透析液中的阿霉素积累量，M是药物载体中包封的阿霉素的总量，所述药物载体中包封的阿霉素的总量通过药物载体中阿霉素的包封率计算得到。
重复释放测试3次，取计算平均值并制作曲线，如图5所示。结果显示，在中性环境中，阿霉素在16h内释放速度较快，随后释放速度减慢，在24h时释放率达到最大，之后基本维持平衡。
同样的方法测得实施例2-5药物组合物APNPs2-5中药物化合物阿霉素的释放效果与药物组合物APNPs1相似。
测试例3
本测试例用于说明吸附抗体后的药物组合物的稳定性。
在测试上述实施例1中的药物组合物APNPs1的释药过程中，另设一组，在不同时间取出各药物组合物，并测定其表面电势。
如图4所示，释药过程中，纳米颗粒表面电势没有明显变化，说明抗体并没有从纳米颗粒上脱落，在此过程中，纳米颗粒较为稳定。
对实施例2-5得到的药物组合物APNPs2-5进行如上相同的测试，得到与如上基本相同的检测结果。
通过以上测试例1-3可以得知，本发明提供的药物组合物载药效果好、释药速度适中、稳定性好且生物相容性好。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种多肽，其特征在于，该多肽的结构如式（1）所示：
其中，m为1-3的整数，n为3-20的整数。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，式（1）所示的结构中m为1，n为8或9。
3.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，该方法包括将药物化合物溶液与权利要求1或2所述的多肽接触，得到接触后的物料。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，相对每重量份的多肽，所述药物化合物的用量为0.05-1重量份。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，接触的条件包括pH值为6-8，温度为4-45℃，时间为12-48小时。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述药物化合物溶液的浓度为5-100微摩尔/升，所述药物化合物溶液中的药物化合物为阿霉素、紫杉醇和喜树碱中的至少一种。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的方法，该方法还包括：将接触后的物料与蛋白进行混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，相对每重量份的多肽，所述蛋白的用量为0.05-0.5重量份。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述蛋白为靶向肿瘤间质细胞的抗体、靶向肿瘤细胞的抗体和靶向肿瘤血管的抗体中的至少一种。
10.权利要求3-9中任意一项所述的方法制备得到的药物组合物。
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