CN104447651B - 总状蕨藻中α–生育螺醌的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种化合物α–生育螺醌提取方法。该化合物是从总状蕨藻中采用提取、减压浓缩、萃取、硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法纯化而得到的α–生育螺醌，其结构是由理化常数测定及波谱数据分析而确定的。经初步的活性筛选试验证明：该化合物对β淀粉样蛋白25–35(Aβ25-35)损伤的SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用，可用于制备神经保护剂和防止阿尔茨海默症药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种从总状蕨藻中提取α–生育螺醌的方法；本发明还涉及该化合物为对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用的活性成分，从而它可用于制备神经保护药物和防止阿尔茨海默症药物。
背景技术
总状蕨藻 Caulerpa racemosa (Forsskål) J. Agardh系绿藻门 (Chlorophyta) 绿藻纲 (Chlorophyceae) 管藻目(Siphonales) 蕨藻科 (Caulerpaceae) 蕨藻属（Caulerpa）海洋植物，主要分布于热带和亚热带海域，生长在潮间带以下的岩石、珊瑚礁上或者中、低潮带的沙地上。在我国海域也有广泛分布，主要集中于福建东山、台湾、海南、西沙、广东沿海。国内外研究表明，总状蕨藻中含有倍半萜类、二萜类、甾体类、甘油酯类、芳香类、酰胺类及生物碱类等成分 (Alarif, W. M. et al, Clean: Soil, Air,
Water, 2010, 38(5-6), 548–557；Wang, H. et al, Botanica Marina, 2007, 50(3), 185–190; Ayyad,
S.-E. N. et al, Alexandria Journal of
Pharmaceutical Sciences, 1994, 8(3), 217–219; Anjaneyulu, A. S. R. et al, Journal of Natural
Products, 1992, 55(4), 496–499)。其中多数萜类化合物含有天然界罕见的1,4-二乙酰氧基（醛基）丁二烯结构片断，而生物碱类则为结构奇特的双吲哚类化合物。现代药理学研究表明，从总状蕨藻中发现的次级代谢产物经常表现出很强的抗菌、抗炎、抗病毒、杀虫、抗肿瘤及毒鱼等多样的生物活性（Anjaneyulu, A. S. R. et al, Phytochemistry, 1991,
30(9), 3041-3042; Anjaneyulu, A. S. R. et al, Journal of the Indian Chemical
Society, 1991, 68(8), 480; Capon, R. J. Phytochemistry, 1983, 22(6), 1465-1467; Nielsen, P. G. et al, Phytochemistry, 1982, 21(7), 1643–1645; Doty, M. S. et al, Nature, 1966, 211(5052), 990）。
发明内容
本发明在于提供一种化合物α–生育螺醌及其制备方法和用途。该化合物是从总状蕨藻中采用提取、减压浓缩、萃取、硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法纯化而得到的α–生育螺醌，其结构是由理化常数测定及波谱数据分析而确定的。经药理试验研究表明，该化合物对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用。
因此，本发明的一个目的是提供一种从总状蕨藻中制备化合物α–生育螺醌的方法。
本发明的另一个目的是提供化合物 α–生育螺醌的用途。具体地说，该化合物对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用，可用于制备神经保护剂和防止阿尔茨海默症的药物。
根据本发明的第一个目的，本发明提供一种从总状蕨藻中采用提取、减压浓缩、萃取、硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法制备化合物α–生育螺醌的方法，具体步骤如下：
1）制备提取物浸膏
将冷冻的总状蕨藻（C .
racemosa）常温下解冻，用乙醇按常规渗漉提取三次，每次24小时，得提取液，将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏；
2）分离纯化
(1) 将上述粗浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取三次，所得萃取液浓缩分别得到石油醚提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏和正丁醇提取浸膏；
(2) 将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分A、B、C、D、E；其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析（以二氯甲烷/甲醇洗脱）、硅胶柱层析（以石油醚/二氯甲烷体积比为6:4—4:6梯度洗脱），得到化合物α–生育螺醌，化学名为α-tocospirone，化学结构式为：
在上述制备方法中，在制备提取物浸膏步骤中，所述提取采用的乙醇为95%乙醇。
在上述制备方法中，在分离纯化步骤中，所述Sephadex LH-20凝胶柱层析中用的二氯甲烷/甲醇洗脱浓度为体积比1:1。
根据本发明的第二个目的，本发明提供了α–生育螺醌的用途。
本发明采用MTT法测试了α–生育螺醌拮抗Aβ25-35引起的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞存活率下降的活性。实验证实，α–生育螺醌对上述模型中的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用。
因此，本发明的α–生育螺醌可用作制备保护神经细胞 (例如，经Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞) 的药物，进而可用作制备神经保护药物和防止阿尔茨海默症药物。
附图说明
图1：α–生育螺醌在不同浓度下对Aβ25-35诱发的SH-SY5Y 细胞损伤的细胞存活率柱状图。
具体实施方式
实施例1 α–生育螺醌的制备
(1) 将冷冻的中国总状蕨藻（C . racemosa）（采自广东湛江沿海）5 kg（干重）分别用30 L 95%乙醇渗漉提取三次，每次渗漉1天，合并提取液；
(2) 将上述提取液在温度≤45℃减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏350g；将该提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚（1.5L）、乙酸乙酯（1.5L）和正丁醇（1L）分别萃取三次，所得萃取液减压浓缩分别得到石油醚提取浸膏（38g）、乙酸乙酯提取浸膏（160g）和正丁醇提取浸膏（120g）；
(3) 将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分（A-E）；其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析（二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱）、硅胶柱层析（石油醚/二氯甲烷体积比为6:4—4:6梯度洗脱），得到化合物α–生育螺醌。
实施例2 α–生育螺醌对Aβ25-35诱导SH-SY5Y胞损伤的保护作用
1、实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中制备的纯品化合物α–生育螺醌。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供药理活性测试。
细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用SH-SY5Y 细胞系 (购自美国ATCC (American type culture
collection))。用含10％ FBS 的DMEM 培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞活性测试方法 (MTT 法)：本发明采用MTT 法，测试评价了被测试样品对Aβ25-35导致SH-SY5Y细胞活力下降的保护作用。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5- 二甲基噻唑)-2，5- 二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲簪 (formazan)，甲簪的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解被测样品对细胞的影响。
活性测试时，取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用新鲜的DMEM 培养基配制成密度为每毫升5×104个细胞的细胞悬液，按每孔100μL 接种于96孔板中，培养24h后加入药液10μL/孔，对每个浓度均设六个复孔，另设空白对照和模型组。细胞在37℃、5％二氧化碳条件下培养2h 后，除空白对照组外，每孔加入Aβ25-35 (最终浓度为1μM)损伤细胞，37℃、5％CO2条件下培养24h后，每孔加入MTT溶液10μL (5mg/mL)，继续培养4h后，仔细去上清，加入DMSO100μL/孔，然后用酶标仪测OD570/630值。按下列公式计算被测物对细胞的保护作用：
存活率%=100×给药组OD/对照组OD
结果评价：被测样品组的存活率越高，测试样品对细胞的保护作用越强。
2、实验结果
α–生育螺醌对Aβ25-35诱导SH-SY5Y胞损伤的保护作用活性结果见图1。（##P ＜ 0.01 相比于空白对照组，**P ＜ 0.01 相比于模型组)：α–生育螺醌在10 μM 浓度时对Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞损伤有明显的保护作用。
3、结论
α–生育螺醌在低浓度下对神经母细胞瘤细胞具有明显的保护作用，从而可用作制备神经保护药物和防止阿尔茨海默症药物。
实施例3
取实施例1所得化合物，添加常用药物辅料，制成片剂、胶囊、口服剂等剂型。
Claims (1)
1.一种从总状蕨藻中提取α–生育螺醌的方法，其特征在于按下列步骤进行：
(1) 将冷冻的中国总状蕨藻干重5 kg分别用30 L 95%乙醇渗漉提取三次，每次渗漉1天，合并提取液；
(2) 将上述提取液在温度≤45℃减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏350g；将该提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚1.5L、乙酸乙酯1.5L和正丁醇1L分别萃取三次，所得萃取液减压浓缩分别得到石油醚提取浸膏38g、乙酸乙酯提取浸膏160g和正丁醇提取浸膏120g；
(3) 将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分A、B、C、D、E；其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱、硅胶柱层析，石油醚/二氯甲烷体积比为6:4—4:6梯度洗脱，得到化合物α–生育螺醌。
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