CN104441668A - 一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医用人工骨移植材料的技术领域，目前，骨移植广泛分布于矫形、口腔及颅面等多个领域。但人工骨移植材料的各种制备方法均存在制造周期长，成品率低，未能天然骨精确解剖学形态等问题。本发明的目的是提供一种生物活性好、力学性能优良，且具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架，采用选择性激光烧结技术，将聚己内酯与羟基磷灰石作为原料，按照设计的模型和设定的参数进行层层烧结，最终得到具有类似天然骨结构的人工骨支架。本发明的人工骨支架具有出色的生物相容性，细胞在该人工骨支架上具有较高的增殖率，同时支架保持良好的生物力学性能。

Description

一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用人工骨移植材料的技术领域，具体涉及一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架及其制备方法。

背景技术

目前，骨移植已经成为仅次于输血的人体组织移植，广泛分布于矫形、口腔及颅面等多个领域。人们已利用聚己内酯（poly-e-caprolactone，PCL）构建三维骨组织工程多孔支架并获得成功，这些可降解材料被证明具有良好的生物相容性。而羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有良好生物相容性和生物活性，植入骨组织后能在界面上和骨形成很强的化学性键合，具有骨传导和骨诱导性。HA块状陶瓷已用于临床上骨的修复替换，但其脆性、不容易吸收的缺点大大制约了其应用的范围。最新的文献报道了PCL与HA混和后对骨传导及成骨细胞增殖、分化的促进作用，同时增加了支架的力学性能（参见文献[1]Ma PX,Zhang R,Xiao G,Franceschi R.Engineering new bonetissue in vitro onhighly porous poly(alpha-hydroxyl acids)/hydroxyapatite composite scaffolds.JBiomed Mater Res,2001;54:284–93；[2]Ishaug SL,Crane GM,Miller MJ,et al.Bone formation by three-dimensional stromal osteoblast culture in biodegradablepolymer scaffolds.J Biomed Mater Res1997;36:17–28）。因此将生物可降解材料和生物陶瓷联合应用，借用两种材料的优势，来制作人工骨支架材料，是当今全世界的研究热点之一。

天然骨是一种具有梯度结构的纳米级多孔复合材料，外层是起支撑作用的密质骨，逐渐向髓腔过渡是孔径从几百微米到几毫米的松质骨，天然骨的这种梯度结构，使其具有良好的生物力学性能。目前已证实，在一定的范围内，随着孔径的增大，细胞增殖数目也会随之上升，但材料的生物力学强度却会相对下降，因此整体的孔径大小基本一致的人工骨支架，在细胞增殖和生物力学性能上势必产生矛盾。

在支架构建方法方面，近年来发展了很多制备和加工组织工程支架材料的方法，这些技术和方法中，研究者更多地致力于致孔方法和孔结构的研究，对支架外形成型的方法的关注相对较少，文献报道的多为膜、圆柱、立方体等简单的支架。而在组织工程中应用更多的是与特定组织或器官相匹配的具有一定复杂外形的三维多孔支架，另外上述各方法存在制造周期长，成品率低的问题。如何在短时间内制造出既有精确解剖学形态，又具有适当尺寸的孔隙及孔隙率的三维立体结构的支架，是医学界一直在探索的问题。目前国内外工程界飞速发展的快速成型技术有望使这个问题得到彻底解决。

做为快速成型技术的一种，激光选区烧结技术（Selective Laser Sintering,SLS）与传统的方法相比，有以下明显的优势：①SLS技术通过层层烧结来构建支架，能构建出具有复杂内部与外部几何形状的支架；②任何一种粉状物质，只要在激光束下能熔化且不分解，都可用来构建支架；③SLS技术不需要有机溶剂，不会造成有机溶剂在成品中的残留；④能够构建出多种几何形状共存的复杂二相性支架。另外，SLS使同一支架中包含不同的物质成为可能，构建迅速，价效比良好，因此是构建组织工程支架的较为理想的技术（参见文献[3]Williams JM,Adewunmi A,Schek RM,Flanagan CL,Krebsbach PH,Feinberg SE,Hollister SJ,Das S.Bone tissue engineering using polycaprolactone scaffoldsfabricated via selective laser sintering.Biomaterials.2005,26(23):4817-27;[4]TanKH,Chua CK,Leong KF,Cheah CM,Gui WS,Tan WS,Wiria FE.Selective lasersintering of biocompatible polymers for applications in tissue engineering.BiomedMater Eng.2005;15(1-2):113-24）。

目前尚无文献报道以羟基磷灰石/聚己内酯混合粉末为原材料，利用选择性激光烧结技术来制备类似天然骨结构的纳米人工骨支架。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物活性好、力学性能优良，且具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架。

本发明的另一目的是提供上述类似天然骨结构的纳米人工骨支架的其制备方法。

为了解决传统制备方法制得的人工骨支架在细胞增殖和生物力学性能上所产生的问题，本发明在制作过程中，对制作方法进行了创新和改进。

本发明采用选择性激光烧结(SLS)技术，将微米级别的聚己内酯(PCL)粉末与纳米级别的羟基磷灰石(nano-HA)粉末相互混合均匀，然后将混合均匀的粉末倒入SLS机器中，按照设计的模型和设定的参数进行层层烧结，最终得到nano-HA/PCL复合材料。这样就获得了具有类似天然骨结构的人工骨支架。

本发明提供一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架的制备方法，如图1所示，采用“选择性激光烧结(SLS)技术”，分别使用nano-HA与PCL为原材料，将纳米级别的羟基磷灰石(nano-HA)粉末与微米级别的聚己内酯(PCL)粉末相互混合均匀，然后将混合均匀的粉末倒入SLS机器中。再通过三维图形软件设计出具有类似天然骨结构的计算机辅助设计(COMPUTER AIDED DESIGN,CAD)三维模型，后将模型文件输送到SLS机器中，按照设定的参数进行对混合粉末进行层层烧结，最终得到nano-HA/PCL复合材料。这样就获得了具有类似天然骨结构的人工骨支架。整个制备过程中，完全可以通过三维图形软件对模型文件的修改，来达到控制和调整人工骨支架形状、几何结构及孔径大小等方面的目的。

本发明的一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架的制备方法，其具体步骤如下：

（Ⅰ）利用深冷粉碎技术将直径约为3～5mm的聚己内酯颗粒粉碎为110±20μm的颗粒备用；

（Ⅱ）将粒径为40±10nm大小的羟基磷灰石颗粒与步骤（Ⅰ）所制得的110±20μm的聚己内酯颗粒混合，得到质量比为10%～30%:90%～70%的纳米羟基磷灰石/聚己内酯混合材料；

（Ⅲ）将步骤（Ⅱ）所得的混合粉末，倒入V型混合机中，正转及反转各1小时，使两种粉末均匀混合在一起；

（Ⅳ）根据实际需要，利用三维造型软件设计出CAD三维模型，然后由切片软件处理后保存为STL文件，将STL文件的数据信息输送到选择性激光烧结机器中；

（Ⅴ）将步骤（Ⅲ）得到的混合均匀的羟基磷灰石/聚己内酯混合粉末，放入选择性激光烧结机器中，按照设定好的参数进行加工。烧结完成后，将烧结好的样品在加工舱中冷却1小时，而后取出，同时去除样品上残留的原材料粉末，得到最终的纳米人工骨支架样品。

步骤（Ⅱ）所述的羟基磷灰石/聚己内酯复合材料中，HA与PCL的比例较佳地为：羟基磷灰石为10%，聚己内酯为90%；羟基磷灰石为20%，聚己内酯为80%；羟基磷灰石为30%，聚己内酯为70%。

所述的V型混合机，由V型容器与发动机组成，将nano-HA与PCL混合粉末倒入V型容器中，正转（顺时针）与反转（逆时针）各1小时后，即可得到混合均匀的nano-HA/PCL混合材料。

所述的SLS机器由容器、激光器、铺粉装置及控制台组成。

步骤（Ⅴ）中，烧结过程中最佳的参数设定应为，先将混合粉末预热到49℃，然后利用直径为150um，内部扫描线功率为4.5-5.5W、边框扫描线功率为3-4.125W、支撑扫描线功率为3-4.125W的激光束，采用1.25m/s的扫描速度，按层厚为150um来构建纳米人工骨支架。

本发明还提供了根据上述方法制得的一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架。

按照本发明的方法，通过改变HA与PCL的比例和三维图形软件对模型文件的修改，可以制备出不同比例（HA含量10%～30%，PCL含量90%～70%）、不同形状、不同几何结构以及不同孔径的多孔nano-HA/PCL人工骨支架。

本发明解决了传统制备方法制得的人工骨支架在细胞增殖和生物力学性能上所产生的问题，制得的支架不存在有机溶剂溶剂残留的现象，使得该支架在具有出色的生物相容性的同时，还具有不错的生物力学强度。

本发明经检测：能制造出类似天然骨结构的nano-HA/PCL人工骨支架。且制得的人工骨支架具有出色的生物相容性，细胞在该人工骨支架上具有较高的增殖率，同时支架保持良好的生物力学性能。制作方法较简单，制作原材料较易获得。

附图说明

图1是本发明的具体制作流程图

图2是将nano-HA与PCL颗粒混合均匀后的电镜扫描图。

图3是实例1的纳米人工骨三维模型图，其中A为整体模型图，B为横截面图，C为纳米人工骨模型1/4结构图，D为纳米人工骨模型纵截面图。

图4是采用本发明制得的实例1的顶面图。

图5是采用本发明制得的实例1的侧面图。

图6是采用本发明制得的实例1的截面电镜扫描图。

图7是实例1（A）、2（B）、3（C）分别与相应的单孔径及无孔纳米人工骨材料对比的抗压强度图。

其中a：类似天然骨结构的纳米人工骨材料；

b：无孔结构支架；

c：100～300μm孔径，73.2%孔隙率；

d：300～600μm孔径，79.8%孔隙率；

e：600～1000μm孔径，87.5%孔隙率。

图8是使用分光光度计测量实例2与相应的单孔径及无孔纳米人工骨材料在490nm处的吸光值(A490)随培养时间的变化图；

其中曲线a：类似天然骨结构的纳米人工骨材料；

曲线b：无孔结构支架；

曲线c：100～300μm孔径，73.2%孔隙率；

曲线d：300～600μm孔径，79.8%孔隙率；

曲线e：600～1000μm孔径，87.5%孔隙率；

曲线f：空白对照组（细胞培养孔板中不放置纳米人工骨材料）；

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：制备10%HA的类似天然骨结构的纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架

使用液氮作为冷冻剂，利用深冷粉碎技术将直径约为3～5mm的聚己内酯颗粒粉碎为110±20μm的颗粒备用。将粒径为40±10nm大小的nano-HA粉末1kg与制备的PCL粉末9kg混合，得到HA质量比为10%的nano-HA/PCL混合粉末10kg。将nano-HA/PCL混合粉末倒入V型混合机的容器中，正转（顺时针）与反转（逆时针）各1小时，得到混合均匀的nano-HA/PCL混合粉末（参见图2）。在计算机上使用三维图形设计软件（Unigraphics NX4.0，美国EDS公司），设计计算机辅助设计(COMPUTER AIDED DESIGN,CAD)三维模型，该支架模型为圆柱状，底面直径5mm，高12mm，且具有类似天然骨结构的人工骨支架模型（参见图3），其中最外层为类似骨皮质样的致密结构，不带有孔状结构；往内一层为100～300μm大小的孔结构；再往内一层为300～600μm大小的孔结构，最内层为最内层为600～1000μm大小的孔结构。CAD模型文件由切片软件（Magics9.51，比利时Caterpillar公司）处理后保存为STL文件，将STL文件的数据信息输送到选择性激光烧结机器（SLS）中。将混合均匀的nano-HA/PCL混合粉末，放入SLS机器中，然后利用直径为150um，内部扫描线功率为4.5W、边框扫描线功率为3W、支撑扫描线功率为3W的激光束，采用内部扫描速度为1.25m/s、边框扫描速度为0.55m/s、支撑扫描速度为1.33m/s，按层厚为150um来进行加工。烧结完成后，将烧结好的样品在加工舱中冷却1小时，而后取出，同时吹风法去除样品上残留的原材料粉末，得到最终的具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架样品。（参见图4到图6）

实施例2：制备20%HA横向梯度孔结构的纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架。

使用液氮作为冷冻剂，利用深冷粉碎技术将直径约为3～5mm的聚己内酯颗粒粉碎为110±20μm的颗粒备用。将粒径为40±10nm大小的nano-HA粉末2kg与制备的PCL粉末8kg混合，得到HA质量比为10%的nano-HA/PCL混合粉末10kg。将nano-HA/PCL混合粉末倒入V型混合机的容器中，正转（顺时针）与反转（逆时针）各1小时，得到混合均匀的nano-HA/PCL混合粉末。在计算机上使用三维图形设计软件，设计计算机辅助设计(COMPUTERAIDED DESIGN,CAD)三维模型，该支架模型为圆柱状，底面直径20mm，高5mm，且具有类似天然骨结构的人工骨支架模型，其中最外层为类似骨皮质样的致密结构，不带有孔状结构；往内一层为100～300μm大小的孔结构；再往内一层为300～600μm大小的孔结构，最内层为最内层为600～1000μm大小的孔结构。CAD模型文件由切片软件处理后保存为STL文件，将STL文件的数据信息输送到选择性激光烧结机器（SLS）中。将混合均匀的nano-HA/PCL混合粉末，放入SLS机器中，首先将混合粉末预热到49℃，然后利用直径为150um，内部扫描线功率为5W、边框扫描线功率为3.65W、支撑扫描线功率为3.65W的激光束，采用内部扫描速度为1.25m/s、边框扫描速度为0.55m/s、支撑扫描速度为1.33m/s，按层厚为150um来进行加工。烧结完成后，将烧结好的样品在加工舱中冷却1小时，而后取出，同时吹风法去除样品上残留的原材料粉末，得到最终的具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架样品。

实施例3：制备30%HA横向梯度孔结构的纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架。

使用液氮作为冷冻剂，利用深冷粉碎技术将直径约为3～5mm的聚己内酯颗粒粉碎为110±20μm的颗粒备用。将粒径为40±10nm大小的nano-HA粉末3kg与制备的PCL粉末7kg混合，得到HA质量比为10%的nano-HA/PCL混合粉末10kg。将nano-HA/PCL混合粉末倒入V型混合机的容器中，正转（顺时针）与反转（逆时针）各1小时，得到混合均匀的nano-HA/PCL混合粉末。在计算机上使用三维图形设计软件，设计计算机辅助设计(COMPUTERAIDED DESIGN,CAD)三维模型，该支架模型为圆柱状，底面直径20mm，高12mm，且具有类似天然骨结构的人工骨支架模型，其中最外层为类似骨皮质样的致密结构，不带有孔状结构；往内一层为100～300μm大小的孔结构；再往内一层为300～600μm大小的孔结构，最内层为最内层为600～1000μm大小的孔结构。CAD模型文件由切片软件处理后保存为STL文件，将STL文件的数据信息输送到选择性激光烧结机器（SLS）中。将混合均匀的nano-HA/PCL混合粉末，放入SLS机器中，首先将混合粉末预热到49℃，然后利用直径为150um，内部扫描线功率为5.5W、边框扫描线功率为4.125W、支撑扫描线功率为4.125W的激光束，采用内部扫描速度为1.25m/s、边框扫描速度为0.55m/s、支撑扫描速度为1.33m/s，按层厚为150um来进行加工。烧结完成后，将烧结好的样品在加工舱中冷却1小时，而后取出，同时吹风法去除样品上残留的原材料粉末，得到最终的具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架样品。

实施例4：本发明的实施例1、2、3制得的纳米人工骨支架抗压强度的检测

抗压强度可以反映支架材料的力学性能。我们将实例1、2、3分别与相同整体大小，但是为均一孔径结构的纳米人工骨材料进行对比，采用DDL20电子万能材料试验机对它们的抗压强度进行了测试，结果如图7所示。图7中a：类似天然骨结构的纳米人工骨材料，82.17%孔隙率；b：无孔结构支架；c：100～300μm孔径，73.2%孔隙率；d：300～600μm孔径，79.8%孔隙率；e：600～1000μm孔径，87.5%孔隙率。

从图7中我们可以看出，实例1的抗压强度约为1.8Mpa、实例2的抗压强度约为22Mpa、实例3的抗压强度约为35Mpa，实例1的抗压强度处于松质骨的强度范围，而实例2、3的抗压强度已经远远大于松质骨的强度，达到了皮质骨的强度（参见文献[4]Anseth KS,Shastri VR,Langer R.Photopolymerizable degradable polyanhydrides with osteocompatibility.Naturebiotechnology1999;17:156-9.）。另外，3组材料由于人工骨支架尺寸大小的不同，在最终结果方面，实例1与实例2、3的数值差距较大，但3组材料的整体结果趋势类似，即不带有孔径结构的支架材料具有最大的抗压强度，在具有孔径结构的支架材料中，其抗压强度会随着孔径的增大而明显下降。而具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架材料的抗压强度与无孔结构的支架材料相差不大，与100～300μm孔径的支架材料几乎相等，且明显高于其余2组（300～600μm孔径与600～1000μm孔径的支架材料），并随着HA比例的增加，其力学强度也会随之得到提高。即表明具有类似天然骨结构的纳米人工骨支架材料，虽然其内部孔径逐步增大，但是力学强度并没有出现大幅下降，是一种力学性能优良的组织工程支架材料，已经能够满足作为松质骨区域填充材料甚至皮质骨区域植入材料的要求。

实施例5：本发明的实施例2制得的纳米人工骨支架上的细胞生长曲线检测

生长曲线可以体现细胞在支架上的生长情况，从而反映支架的生物相容性。基于细胞培养对支架材料形状的要求，我们使用实例2来进行细胞培养实验。我们使用CCK-8法来对纳米人工骨支架上的细胞进行生长曲线检测，CCK-8试剂盒是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏检测试剂盒，它在电子耦合剂存在的情况下，可以被还原生成橙黄色的甲臜。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。使用分光光度仪。对细胞培养液的上清在490nm处进行观察，读数后得到值A490，从而将颜色的深浅数量化，并绘制生长曲线。结果如图8所示。图8中曲线a：类似天然骨结构的纳米人工骨材料；曲线b：无孔结构支架；曲线c：100～300μm孔径，73.2%孔隙率；曲线d：300～600μm孔径，79.8%孔隙率；曲线e：600～1000μm孔径，87.5%孔隙率；曲线f：空白对照组（细胞培养孔板中不放置纳米人工骨材料）。

不同孔隙率、不同孔径的纳米人工骨材料在490nm处的吸光值(A490)随培养时间的变化图。从图8中我们可以看出，随培养时间的延长，有孔结构的支架材料的细胞增值率明显高于无孔结构的支架材料和空白对照组。在有孔材料曲线中，4组材料整体趋势相似，其中300～600μm孔径的支架材料具有最佳的细胞增值情况，本发明所制得的具有类似天然骨结构的支架材料稍差于300～600μm孔径的支架材料，优于其余2组（100～300μm孔径和600～1000μm孔径的支架材料）。这说明使用本发明所制造的纳米人工骨支架生物相容性良好，对细胞增殖无不良影响，且随着培养时间的延长，由于支架内部的三维空间结构，细胞增殖率不仅不会下降，反而会持续上升。

Claims (4)

1.一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

（Ⅰ）利用深冷粉碎技术将直径约为3～5mm的聚己内酯颗粒粉碎为110±20μm的颗粒备用；

（Ⅱ）将粒径为40±10nm大小的羟基磷灰石颗粒与步骤（Ⅰ）所制得的110±20μm的聚己内酯颗粒混合，得到质量比为10%～30%:90%～70%的纳米羟基磷灰石/聚己内酯混合材料；

（Ⅲ）将步骤（Ⅱ）所得的混合粉末，倒入V型混合机中，正转及反转各1小时，使两种粉末均匀混合在一起；

（Ⅳ）利用三维造型软件设计出CAD三维模型，然后由切片软件处理后保存为STL文件，将STL文件的数据信息输送到选择性激光烧结机器中；

（Ⅴ）将步骤（Ⅲ）得到的混合均匀的羟基磷灰石/聚己内酯混合材料，放入选择性激光烧结机器中，按照设定好的参数进行加工。

2.根据权利要求1所述的一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架的制备方法，其特征在于，其中步骤（Ⅱ）所述的羟基磷灰石/聚己内酯混合材料中，羟基磷灰石与聚己内酯的质量比为：

羟基磷灰石为10%，聚己内酯为90%，

羟基磷灰石为20%，聚己内酯为80%，或

羟基磷灰石为30%，聚己内酯为70%。

3.根据权利要求1或2所述的一种类似天然骨结构的纳米人工骨支架的制备方法，其特征在于，其中步骤（Ⅴ）中，放入选择性激光烧结机器中，设定的参数为：先将羟基磷灰石/聚己内酯混合材料预热到49℃，然后利用直径为150um，内部扫描线功率为4.5-5.5W、边框扫描线功率为3-4.125W、支撑扫描线功率为3-4.125W的激光束，采用1.25m/s的扫描速度，按层厚为150um进行加工。

4.一种根据权利要求1—3所述的类似天然骨结构的纳米人工骨支架的制备方法制备得到的类似天然骨结构的纳米人工骨支架。