CN104437630B - 一种多元羧酸混合离子液体模拟纤维素酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多元羧酸混合离子液体模拟纤维素酶的方法，本方法以多元羧酸和有机碱为原料，进行一步合成反应，高选择性，高收率地合成模拟酶。合成的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能的离子液体共同使用，制备获得模拟酶可以高效降解纤维素制备还原糖。模拟酶可以回收重复多次使用。模拟纤维素酶催化效果好，不挥发，不易降解，是一类具有应用潜力的模拟纤维素酶。

Description

一种多元羧酸混合离子液体模拟纤维素酶的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种多元羧酸混合离子液体模拟纤维素酶的方法。

背景技术

模拟酶(model enzyme)用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程，从原理的本质定义为是用人工方法合成具有酶性质的一类催化剂。酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用生物体内的酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。模拟酶是一个新的研究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。目前模拟酶的研究主要有以下几方面：模拟酶的金属辅基、模拟酶的活性功能基、模拟酶的高分子作用方式、模拟酶与底物的作用、模拟酶的性状等。

离子液体是指全部由离子组成的液体。在室温或室温附近温度下呈液态的由离子构成的物质，称为室温离子液体、室温熔融盐(室温离子液体常伴有氢键的存在，定义为室温熔融盐有点勉强)、有机离子液体等，目前尚无统一的名称，但倾向于简称离子液体。在离子化合物中，阴阳离子之间的作用力为库仑力，其大小与阴阳离子的电荷数量及半径有关，离子半径越大，它们之间的作用力越小，这种离子化合物的熔点就越低。某些离子化合物的阴阳离子体积很大，结构松散，导致它们之间的作用力较低，以至于熔点接近室温。

迄今为止，室温离子液体的研究取得了惊人的进展。欧盟委员会有一个有关离子液体的3年计划；日本、韩国也有相关研究的相继报道。在我国，中国科学院兰州化学物理研究所西部生态绿色化学研究发展中心、北京大学绿色催化实验室、华东师范大学离子液体研究中心等机构也开展专门的研究。兰州化学物理研究所已在该领域取得重大突破，率先制备了多种咪唑类离子液体润滑剂。2002年美国Albama大学Roger领导的小组首先发现氯盐类离子液体可以溶解和处理纤维素。2009年张平，孟祥光等用组氨酸与铜离子组成的模拟酶体系来催化蔗糖水解，在70℃、pH7的中性溶液中，6h可达到80％以上的转化率。但是这个实验结果不是直接对纤维素的催化水解，因此目前对于模拟纤维素的研究还鲜见报道。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效率、高收率的利用多元羧酸混合离子液体制备模拟纤维素酶的方法。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种利用多元羧酸混合离子液体制备模拟纤维素酶的方法，包括如下步骤：

(1)将多元羧酸与有机碱混合，加热条件下搅拌反应，反应结束后加入萃取剂除去未反应的底物，85～90℃减压蒸馏，干燥得到多元羧酸离子液体，优选地，在100℃下干燥直至用卡尔-菲舍尔分析仪测定水分少于1％为止，经验值是20g离子液体100℃下需干燥3h以上；

(2)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体混合，加热搅拌均匀，反应获得模拟纤维素酶。

具体地，步骤(1)所述的多元羧酸为乙二酸、丙二酸、戊二酸、丁二酸、顺丁烯二酸和柠檬酸中的任意两种或三种的混合物。

步骤(1)中所述有机碱为咪唑、甲基咪唑、乙基咪唑、吡啶、甲基吡啶、乙基吡啶、吡咯烷酮、烷基季铵和烷基季磷中的任意一种。优选地，所述的有机碱为甲基咪唑或乙基咪唑。

在步骤(1)中，加热方式为油浴加热或者微波加热，所述的加热温度为80～150℃，其中，当使用油浴加热时，加热时间为2～8h；当使用微波加热时，微波处理功率为700w～2000w，处理时间20s～10min。

在步骤(1)中，所述的萃取剂为乙酸乙酯或者乙醚。

优选地，所述多元羧酸与有机碱的摩尔比例为1∶2～1∶3。

步骤(2)中，多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体的质量比为1∶1～10。

所述的纤维素溶解功能离子液体为[EMIM][DEP]、[EMIM]Ac、[BMIM]Ac、[AMIM]Ac、[AMIM]Cl、[MMIM][DMP]、[MMIM][DEP]、[EMIM][DMP]、[BMIM]Cl和[BmpyM]Cl中的任意一种。优选地，所述的纤维素溶解功能离子液体为[MMIM][DMP]。

步骤(2)中，加热搅拌的条件为在80℃以上温度下加热1min以上并搅拌。

有益效果：与现有技术相比，本发明以多元羧酸和有机碱为原料，进行一步合成反应，高选择性、高收率地合成模拟酶。合成的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能的离子液体共同使用，制备获得模拟酶，可以高效降解纤维素制备还原糖。同时，制备的模拟纤维素酶可以回收重复多次使用。模拟纤维素酶催化效果好，不挥发，不易降解，是一类具有应用潜力的模拟纤维素酶。

附图说明

图1实施例1制备的模拟酶的红外光谱图。

具体实施方式

实施例1

(1)将0.5摩尔乙二酸和0.5摩尔丁二酸置于三口圆底烧瓶中，室温下缓慢加入2摩尔1-甲基咪唑，130℃磁力搅拌，在氮气保护下(防止甲基咪唑氧化)加热回流8h，得到无色液体。用乙醚和乙酸乙酯分别萃取3次除去有机杂质；然后90℃减压蒸馏除去水等低沸点杂质，得到多元羧酸离子液体。

(2)1-甲基-3-甲基-咪唑-二甲基磷酸盐([MMIM][DMP])的合成。

离子液体[MMIM][DMP]由N-甲基咪唑与磷酸三甲基酯一步反应制得。将N-甲基咪唑(1mol)和磷酸三甲基酯(1.2mol)分别加入到500mL圆底烧瓶中，磁力搅拌使其混合均匀，在氮气保护下(防止N-甲基咪唑氧化)加热回流48h，得到浅黄色的液体。分别用100mL乙醚萃取3次，除去有机杂质；并在90℃蒸馏除去水等低沸点杂质，得到离子液体1-甲基-3-甲基-咪唑-二甲基磷酸盐(产率＝95％)。

(3)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体1-甲基-3-甲基-咪唑-二甲基磷酸盐([MMIM][DMP])混合，摩尔比为1∶1，搅拌均匀，100℃加热搅拌均匀反应10min获得浅黄色或亮棕色液态的模拟纤维素酶。

实施例2

(1)将0.5摩尔乙二酸和0.5摩尔顺丁烯二酸置于三口圆底烧瓶中，室温下缓慢加入2摩尔乙基咪唑，150℃磁力搅拌，在氮气保护下(防止咪唑氧化)加热回流5h，得到无色液体。用乙醚和乙酸乙酯分别萃取3次除去有机杂质；并在90℃下减压蒸馏除去水等低沸点杂质，得到多元羧酸离子液体。

(2)[BMIM]Cl的合成

将N-甲基咪唑和氯代正丁烷按摩尔比1∶1.2混合于500ml圆底烧瓶中，在70℃油浴中加热、回流，并通氮气加以保护，以防止原料氧化，施以磁力搅拌。48h后得到透明或淡黄色的液体，粘度变大。换成蒸馏装置蒸除过量的氯丁烷。得到室温下无色的透明液体。乙醚萃取3～5次除去杂质。得到离子液体[BMIM]Cl。

(3)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体[BMIM]Cl混合，搅拌均匀，120℃加热搅拌均匀反应20min获得模拟酶。

实施例3

(1)将0.5摩尔丙二酸和0.5摩尔顺丁烯二酸置于三口圆底烧瓶中，室温下缓慢加入2摩尔乙基咪唑，150℃磁力搅拌，在氮气保护下(防止咪唑氧化)加热回流6h，得到无色液体。用乙醚萃和乙酸乙酯分别萃取3次除去有机杂质；并在90℃减压蒸馏除去水等低沸点杂质，得到多元羧酸离子液体。

(2)[Bmpym]Cl的合成

将3-甲基吡啶和1-氯丁烷按摩尔比1∶1.2混合于500ml圆底烧瓶中，在70℃油浴中加热、回流，并通氮气加以保护，施以磁力搅拌。48小时后得到白色固体，溶于去离子水，用乙醚萃取3～5次除去杂质，蒸馏除去水等低沸点杂质。得到离子液体[BmpyM]Cl(产率＝94％)。

(3)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体[BmpyM]Cl混合，搅拌均匀，100℃加热搅拌10min均匀反应获得模拟酶。

实施例4

(1)将0.5摩尔顺丁烯二酸和0.5摩尔柠檬酸置于三口圆底烧瓶中，室温下缓慢加入2.5摩尔甲基咪唑，150℃磁力搅拌，在氮气保护下(防止咪唑氧化)加热回流5h，得到无色液体。用乙醚和乙酸乙酯分别萃取3次除去有机杂质；并在90℃下减压蒸馏除去水等低沸点杂质，得到多元羧酸离子液体。

(2)[Emim][oAc]的合成

[Emim]Br的制备：在的500ml三口圆底烧瓶中，按照1∶1.2(摩尔比)加入N-甲基咪唑和溴乙烷，然后在磁力搅拌下逐滴加入溴乙烷，加试剂完毕后回流。反应结束后，用分液漏斗取出油状液层，并用300mL 1，1，1一三氯乙烷洗3次，最后于70℃旋转蒸发除去溶剂。

离子交换树脂预处理：树脂置于容器中用去离子水洗2～3次；装1.9×40cm的717阴离子交换树脂；树脂量3～5倍1N NaOH浸泡2～3小时后用去离子水洗至近中性。

将50g[Emim]Br溶于100ml乙醇，通过717阴离子交换树脂。逐滴加入冰醋酸直至pH7.0，用5％硝酸银检测溴离子是否反应完全。蒸馏除去水，得到的离子液体用乙醚萃取3次，用氯仿∶甲醇(9∶1)混合液洗涤3次，70℃蒸馏除去有机溶剂。

(3)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体[Emim][oAc]按照摩尔比1∶2混合，搅拌均匀，120℃加热搅拌均匀反应20min获得模拟酶。

实施例5

(1)将0.5摩尔乙二酸和0.5摩尔戊二酸置于三口圆底烧瓶中，室温下缓慢加入2摩尔3-甲基吡啶，150℃磁力搅拌，在氮气保护下(防止甲基咪唑氧化)加热回流6h，得到无色液体。用乙醚和乙酸乙酯分别萃取3次除去有机杂质；然后90℃减压蒸馏除去水等低沸点杂质，得到多元羧酸离子液体。

(2)[Bmpym]Cl的合成

将3-甲基吡啶和1-氯丁烷按摩尔比1∶1.2混合于500ml圆底烧瓶中，在70℃油浴中加热、回流，并通氮气加以保护，施以磁力搅拌。48小时后得到白色固体，溶于去离子水，用乙醚萃取3～5次除去杂质，蒸馏除去水等低沸点杂质。得到离子液体[BmpyM]Cl(产率＝94％)。

(3)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体[BmpyM]Cl混合，搅拌均匀，100℃加热搅拌10min均匀反应获得模拟酶。

实施例6模拟酶降解微晶纤维素。

取实施例1～5制备的模拟酶各0.25g、微晶纤维素各0.05g，同时倒入洁净的三孔烧瓶中；加入磁转子，塞紧瓶塞并将三孔烧瓶固定在铁架台上；将DF-I集热磁力搅拌器温度调节至130℃，加热反应3h。反应结束后取出部分反应液移至洁净离心管，加0.5ml水，将离心管放入高速冷冻离心机中，调节转速至10000r离心10min，分层后，取上层液体至于另一洁净离心管中继续离心，如此反复离心直至上清液无悬浮颗粒，然后用DNS法测定上清液的还原糖的含量。

表1模拟酶降解纤维素获得糖的结果图

结果表明，实施例1～5制备的模拟酶均可以较好的降解纤维素得到还原糖。

综上所述，本发明通过将合成的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能的离子液体共同使用，制备获得模拟酶，可以高效降解纤维素制备还原糖。同时，制备的模拟纤维素酶可以回收重复多次使用。模拟纤维素酶催化效果好，不挥发，不易降解，是一类具有应用潜力的模拟纤维素酶。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (6)

1.一种多元羧酸混合离子液体制备模拟纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将多元羧酸与有机碱混合，加热条件下搅拌反应，反应结束后加入萃取剂除去未反应的底物，85～90℃减压蒸馏，干燥直至用卡尔-菲舍尔分析仪测定水分少于1％为止，得到多元羧酸离子液体；所述的多元羧酸为乙二酸、丙二酸、戊二酸、丁二酸、顺丁烯二酸和柠檬酸中的任意两种或三种的混合物；所述的有机碱为咪唑、甲基咪唑、乙基咪唑、吡啶、甲基吡啶、乙基吡啶、吡咯烷酮、烷基季铵和烷基季磷中的任意一种，所述多元羧酸与有机碱的摩尔比例为1∶2～1∶3；

(2)取步骤(1)获得的多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体混合，加热搅拌均匀，反应获得模拟纤维素酶，其中，所述的纤维素溶解功能离子液体为[EMIM][DEP]、[EMIM]Ac、[BMIM]Ac、[AMIM]Ac、[AMIM]Cl、[MMIM][DMP]、[MMIM][DEP]、[EMIM][DMP]、[BMIM]Cl和[BmpyM]Cl中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，加热方式为油浴加热或者微波加热，所述的加热温度为80～150℃，其中，当使用油浴加热时，加热时间为2～8h；当使用微波加热时，微波处理功率为700w～2000w，处理时间20s～10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的萃取剂为乙酸乙酯或者乙醚。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多元羧酸与有机碱的摩尔比例为1∶2～1∶3。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，多元羧酸离子液体与纤维素溶解功能离子液体的质量比为1∶1～10。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，加热搅拌的条件为在80℃以上温度下加热1min以上并搅拌。