CN104431287A - 一种无花果乳清多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无花果乳清多肽及其制备方法，属于生物技术领域，其制备方法主要包括以下步骤：1）无花果多肽水解液的制备；2）乳清蛋白的水解；3）乳清多肽的分离纯化；4）乳清多肽分子量的测定。本发明利用无花果果汁中含有的蛋白酶水解乳清蛋白，使得乳清蛋白转化为小分子的乳清多肽，采用酶工程技术和微生物发酵技术研制出有利于人体消化吸收，满足人体健康营养需求的无花果乳清多肽发酵乳。既增强人体对乳清蛋白的吸收，又提高了乳品的附加值，同时本发明的实施也为乳清资源的利用提供了有效的方法。

Description

一种无花果乳清多肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无花果乳清多肽及其制备方法。

背景技术

乳清蛋白是生产工业干酪的副产物，乳清的主要成分是乳清蛋白，乳清蛋白的主要成分包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白、脂肪球膜蛋白等，同时乳清蛋白中含有可被机体直接吸收的生物活性肽。在牛乳中酪蛋白的蛋白质效率（protein efficiency ratio，PER）值只有2.5，而乳清蛋白却为3.0，仅次于鸡蛋蛋清，乳清蛋白被称为蛋白之王，是公认的一种高营养价值的蛋白质。目前，大量乳清作为废水排放，不仅浪费了营养资源污染了生态环境，而且降低了乳品的附加值。乳清资源的开发利用很早就受到了人们的重视。

无花果（Ficus carica Linn）是一种开花植物，隶属于桑科榕属，主要生长于一些热带和温带地区，科学研究表明，无花果含有大量的无花果蛋白酶（类巯基蛋白酶），对蛋白质水解有着很好的作用。在乳清中添加无花果果汁，利用无花果中所含有的类巯基蛋白酶水解乳清，这样既可以水解得到乳清多肽，另外也可以使得乳清水解液带有无花果的果香味道。

乳清蛋白在酸性条件下的溶解性远远优于其他蛋白，能防止饮料沉淀、分层现象，这种特点使乳清成为酸性饮料理想的蛋白质资源，在蛋白饮料、果汁牛奶、固体饮料、酸性乳饮料中得到广泛应用。科学研究表明乳清多肽对人体吸收代谢方面有着重要的作用且人体对其吸收利用要优于某些氨基酸，同时无花果水解过的乳清多肽具有一定的生物活性，乳清多肽在体内和体外显示出不同的生理功能，如：抗血压、抗菌、抗氧化、免疫调节、促进消化吸收等。

同时乳清蛋白质是热敏性的蛋白质，在制作饮料热处理过程中容易发生热变性而降低在水中的溶解度，也使乳清的利用范围受到很大的限制同时产生的沉淀也影响了饮料产品的感官特性；若弃去沉淀，则其营养价值会大大降低，本项目旨在研究利用无花果果汁中含有无花果蛋白酶的特点，对酶水解乳清蛋白的工艺进行优化，从而制备应用价值优于乳清蛋白的乳清多肽，提高了乳清蛋白的利用率，同时本发明也为提高乳清资源的利用率和工业生产提供技术参数和理论指导。

发明内容

本发明的目是利用无花果果汁中含有的蛋白酶水解乳清蛋白，使得乳清蛋白转化为小分子的乳清多肽，采用酶工程技术和微生物发酵技术研制出有利于人体消化吸收，满足人体健康营养需求的无花果乳清多肽发酵乳。这样既可以增强人体对乳清蛋白的吸收，同时也提高了乳品的附加值，同时本发明的实施也为乳清资源的利用提供了有效的方法，避免了由于大量干酪副产物的浪费造成的资源流失和环境污染。

本发明一种无花果乳清多肽，由如下制备方法制得：

1）无花果多肽水解液的制备

选取成熟的无花果，清洗干净后切成丁，利用榨汁机榨汁，无花果果汁用滤布粗滤，再用离心机离心分离，离心机转速2000r/min、分离时间15min，取上清液为酶原；

2）乳清蛋白的水解

在乳清蛋白中添加无花果果汁，进行乳清蛋白水解，水解条件为45-55℃条件下水解90-120min，无花果果汁添加量为质量百分比10-20%、用pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节乳清pH至6；

3）乳清多肽的分离纯化

将乳清多肽水解液置于截留分子量10000Da的透析袋中对纯水透析24h，采用纳滤过滤装置浓缩乳清多肽，采用Sephadex G50对乳清多肽进行分离纯化，得到乳清多肽；

4）乳清多肽分子量的测定

测得乳清多肽分子量范围为1290-8492Da，即得无花果乳清多肽。

本发明无花果乳清多肽的制备方法，包括如下工艺步骤：

1）无花果多肽水解液的制备

选取成熟的无花果，清洗干净后切成丁，利用榨汁机榨汁，无花果果汁用滤布粗滤，再用离心机离心分离，离心机转速2000r/min、分离时间15min，取上清液为酶原；

2）乳清蛋白的水解

在乳清蛋白中添加无花果果汁，进行乳清蛋白水解，水解条件为45-55℃条件下水解90-120min，无花果果汁添加量为质量百分比10-20%、用pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节乳清pH至6；

3）乳清多肽的分离纯化

将乳清多肽水解液置于截留分子量10000Da的透析袋中对纯水透析24h，采用纳滤过滤装置浓缩乳清多肽，采用Sephadex G50对乳清多肽进行分离纯化，得到乳清多肽；

4）乳清多肽分子量的测定

测得乳清多肽分子量范围为1290-8492Da，即得无花果乳清多肽。

附图说明

图1是本发明乳清活性多肽分离纯化图（所用的柱子65mm*15mm）；

    图2是本发明乳清活性多肽纯度鉴定图（所用的柱子65mm*15mm）；

    图3是本发明乳清多肽水解液液相色谱图；

    图4是标准蛋白的液相色谱图（1、胰岛素，2、酵母核糖核酸，3、杆菌肽，4、还原性谷胱甘肽）。

具体实施方式

一、乳清多肽水解液的制备

选取成熟的无花果，清洗干净后切成丁，利用榨汁机榨汁，无花果果汁用滤布粗滤，再用离心机离心分离（2000r/min，15min），取上清液为酶原。

取100mL乳清，用pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节乳清pH至6，添加10-20%无花果果汁，最佳添加量为15%，在45-55℃条件下水解90-120min，最适温度为50℃，最适水解时间90min，90℃条件下灭酶10min。

二、乳清多肽水解度检测方法

吸取lmL样品，加入80mL蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.05molLNaOH标准液滴定至pH为8.2。加入10ml甲醛溶液，混匀，再用0.05mol/LNaOH标准液继续滴定至pH为9.2，记下氢氧化钠标准液所消耗的毫升数。同时取蒸馏水80mL，做空白对照试验。

式中：

DH：样品中有游离氮的百分含量；

V1：测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液的体积(mL)；

V2：试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准液的体积(mL)：

V3：蛋白水解液的总体积(mL)；

C：氢氧化钠标准溶液浓度(mol/L)： 

F：氮换算为蛋白质的系数，F=6.25：

M：总的蛋白质量(g)。

三、乳清多肽的分离纯化及分子量测定

取经过无花果果汁水解过的样品，置于截留分子量10000Da的透析袋（G-RC16-10K）中对纯水透析24h，透析过程中用磁力搅拌器搅拌，透析结束后，采用纳滤过滤装置（上海迪清过滤技术有限公司 DQ-1）浓缩透析液同时可以去除矿质元素、碳水化合物等，收集浓缩液备用，即为乳清多肽浓缩液。

采用Sephadex G50离子交换柱层析对乳清多肽浓缩液进行分离纯化，Sephadex G50在使用前分别用浓度为0.5mol/LNaOH，0.5mol/LHCl浸泡各1h，用蒸馏水洗至中性。

1、装柱 分析天平称取10g Sephadex G50，常温下用蒸馏水浸泡2-3d。取层析柱，将柱子固定在支架上，然后将处理好的Sephadex G50装填到层析柱柱内，注意在装柱的过程中柱子内部不能有气泡产生，否则会使层析变慢，分离效果不理想，所以最好一次性装柱。

2、平衡 新装好的柱子需要进行平衡处理，通常用磷酸二氢钾平衡，流速控制在0.5mL/min，当流出液的pH与平衡缓冲液pH一致时，层析柱达到平衡。

3、上样 用吸管吸取层析柱内过多的平衡缓冲液至页面1cm高度，吸取经过浓缩处理的乳清多肽5mL到事先用磷酸二氢钾平衡过的柱子内，这时打开柱子出液口止水阀，使样品渗到层析介质内

4、洗脱与收集 当样品凹液面接近柱床表面时用滴管缓慢滴加一定高度的蒸馏水，防止在洗脱的时候直接滴加洗脱液破坏柱床表面，然后用400mL、0.2mol/L的磷酸二氢钾进行洗脱，流速控制在0.5mL/min，每管收集5mL，用考马斯亮蓝法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰。乳清多肽（Whey polypeptide），最终分离得到四种不同分子量乳清多肽，根据其英文名称依次将其命名为：WH-PO-1，WH-PO-2，WH-PO-3，WH-PO-4。

将上述纯化出来的乳清多肽各个组分先用真空冷冻干燥机（FD-1A-50型）在-80℃、100mTorr干燥20h，用双蒸水溶解干燥过的乳清多肽粉末至浓度0.1mg/mL，采用高效液相色谱的方法测定其分子量。

液相色谱条件：

色谱柱采用C18柱，柱温25℃，检测波长254nm，流动相为甲醇：KH₂PO₄=50：50，进样量10μL，流速0.6mL/min，经检测经过乳清蛋白无花果汁水解后得到分子量在1290-8492Da系列的乳清多肽。

Claims (2)

1.一种无花果乳清多肽，其特征在于由如下制备方法制得：

1）无花果多肽水解液的制备

选取成熟的无花果，清洗干净后切成丁，利用榨汁机榨汁，无花果果汁用滤布粗滤，再用离心机离心分离，离心机转速2000r/min、分离时间15min，取上清液为酶原；

2）乳清蛋白的水解

在乳清蛋白中添加无花果果汁，进行乳清蛋白水解，水解条件为45-55℃条件下水解90-120min，无花果果汁添加量为质量百分比10-20%、用pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节乳清pH至6；

3）乳清多肽的分离纯化

将乳清多肽水解液置于截留分子量10000Da的透析袋中对纯水透析24h，采用纳滤过滤装置浓缩乳清多肽，采用Sephadex G50对乳清多肽进行分离纯化，得到乳清多肽；

4）乳清多肽分子量的测定

测得乳清多肽分子量范围为1290-8492Da，即得无花果乳清多肽。

2.一种如权利要求1所述无花果乳清多肽的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

1）无花果多肽水解液的制备

选取成熟的无花果，清洗干净后切成丁，利用榨汁机榨汁，无花果果汁用滤布粗滤，再用离心机离心分离，离心机转速2000r/min、分离时间15min，取上清液为酶原；

2）乳清蛋白的水解

在乳清蛋白中添加无花果果汁，进行乳清蛋白水解，水解条件为45-55℃条件下水解90-120min，无花果果汁添加量为质量百分比10-20%、用pH3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节乳清pH至6；

3）乳清多肽的分离纯化

将乳清多肽水解液置于截留分子量10000Da的透析袋中对纯水透析24h，采用纳滤过滤装置浓缩乳清多肽，采用Sephadex G50对乳清多肽进行分离纯化，得到乳清多肽；

4）乳清多肽分子量的测定

测得乳清多肽分子量范围为1290-8492Da，即得无花果乳清多肽。